專利名稱：分泌抗水稻黑條矮縮病毒單抗雜交瘤細(xì)胞株及其單抗應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種分泌抗水稻黑條矮縮病毒單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其單抗的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水稻黑條矮縮病曾于1960年代中期在浙江及華東諸省市不少地區(qū)的稻、麥和玉米等禾谷類糧食作物上嚴(yán)重為害，其中浙江發(fā)病較重致使當(dāng)時以東陽為中心的浙中玉米種植區(qū)被迫改變栽培制度，此后20年發(fā)病面積迅速下降直至70年代銷聲匿跡。近年來由于受耕作栽培制度改變、氣候變暖、灰飛虱暴發(fā)等多種因素影響導(dǎo)致黑條矮縮病在浙江、上海、江蘇、安徽、江西等地發(fā)生、流行。水稻黑條矮縮病由水稻黑條矮縮病毒(Rice black streaked dwarf virus, RBSDV)引起，該病毒屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)斐濟(jì)病毒屬(Fijivirus)。該病毒可侵染水稻、大麥、小麥、玉米、高粱、馬唐、白草和稗草等多種禾本科作物和雜草，引起水稻的黑條矮縮病和玉米的矮縮病。病毒粒體球狀，直徑70 75 nm。病毒基因組為雙鏈 RNA(dsRNA)，共10個片段，由大到小分別命名為SI S10，其中SlO編碼病毒的外殼蛋白。 細(xì)胞質(zhì)中病毒粒子以三種形式存在一種是分散或不規(guī)則聚集，另一種是有規(guī)則的晶狀排列，再一種病毒粒子排列成串，外包一層膜，呈豆莢狀、鞘狀或管狀構(gòu)造。水稻黑條矮縮病毒是一種由灰飛虱(Laodelphax striatellus Fallen)為主要傳播媒介的病毒，極具暴發(fā)性、間歇性和遷移性。水稻一旦感染上該病毒就無法防治。其中秧苗2葉 4葉心葉期為最易感病期，且極顯著高于其他生育期。因此秧苗期是防治灰飛虱傳毒的關(guān)鍵時期。感病水稻的癥狀表現(xiàn)為分蘗增加，葉片短闊、僵直，葉色深綠，葉背的葉脈和莖稈上初現(xiàn)蠟白色，后變褐色的短條瘤狀隆起，不抽穗或穗小，結(jié)實(shí)不良。不同生育期染病后的癥狀略有差異，具體表現(xiàn)為苗期發(fā)病心葉生長緩慢，葉片短寬、僵直、濃綠，葉脈有不規(guī)則蠟白色瘤狀突起，后變黑褐色，根短小，植株矮小，不抽穗，大田移栽后枯死；分蘗期發(fā)病新生分蘗先顯癥，主莖和早期分蘗尚能抽出短小病穗，但病穗縮藏于葉鞘內(nèi)；拔節(jié)期發(fā)病劍葉短闊，穗頸短縮，結(jié)實(shí)率低，葉背和莖稈上有短條狀瘤突。水稻黑條矮縮病毒傳毒介體灰飛虱一經(jīng)獲毒，終身帶毒，但不經(jīng)卵傳毒。病毒主要在大麥、小麥病株上越冬，有部分也在灰飛虱體內(nèi)越冬。田間病毒通過麥-早稻-晚稻的途徑完成侵染循環(huán)。第一代灰飛虱在病麥上接毒后傳到早稻、單季稻、晚稻和青玉米上傳毒。 稻田中繁殖的2、3代灰飛虱，在水稻病株上吸毒后，遷入晚稻和秋玉米傳毒，晚稻上繁殖的灰飛虱成蟲和越冬代若蟲又進(jìn)行傳毒，傳給大麥、小麥?；绎w虱最短獲毒時間30分鐘，1-2 天即可充分獲毒，病毒在灰飛虱體內(nèi)循回期為8-35天，接毒時間僅1分鐘?；绎w虱帶毒情況及發(fā)生數(shù)量成為水稻黑條矮縮病發(fā)病流行的重要因素。為了掌握灰飛虱自然種群帶毒及水稻發(fā)病狀況，強(qiáng)化我國水稻黑條矮縮病早期監(jiān)測和預(yù)警，科學(xué)指導(dǎo)防控，急需建立檢測灰飛虱體內(nèi)及水稻中RBSDV的高通量的檢測方法，而目前沒有這種高通量的檢測方法，僅用低效率的電鏡觀察、RT-PCR方法等方法進(jìn)行小樣本檢測。本發(fā)明以RBSDV外殼蛋白(CP)為CN 102533664 A
抗原通過雜交瘤技術(shù)制備了 1株抗RBSDV的特異性單克隆抗體，以制備的單抗為核心建立了檢測RBSDV的高通量的血清學(xué)方法，并成功應(yīng)用于田間RBSDV的檢測，從而為我國水稻黑條矮縮病早期監(jiān)測和預(yù)警，科學(xué)指導(dǎo)防控提供物質(zhì)和技術(shù)支持。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種分泌抗水稻黑條矮縮病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其單抗應(yīng)用。分泌抗水稻黑條矮縮病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，保藏號為CGMCC No. 5537， 它能分泌抗水稻黑條矮縮病毒的單克隆抗體?？顾竞跅l矮縮病毒的單克隆抗體腹水間接ELISA效價(jià)達(dá)10_6以上，抗體類型及亞類為IgGl、kappa鏈，該單克隆抗體能與水稻黑條矮縮病毒56kD的外殼蛋白亞基有特異性免疫結(jié)合反應(yīng)。抗水稻黑條矮縮病毒單克隆抗體在該病毒檢測上的應(yīng)用是以單克隆抗體為核心建立的各種免疫學(xué)檢測方法和免疫學(xué)試劑盒。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有的有益效果1)提供的雜交瘤細(xì)胞株分泌抗水稻黑條矮縮病毒特異性單克隆抗體，以該單抗為核心建立的dot-ELISA、ACP-ELISA、DAS-ELISA、和 TAS-ELISA等免疫學(xué)方法及用這些方法建立的試劑盒能高度特異、準(zhǔn)確、靈敏的檢測水稻黑條矮縮病毒；2)利用本發(fā)明所制備的單克隆抗體檢測水稻黑條矮縮病毒，不需要昂貴的電子顯微鏡、PCR儀等設(shè)備；3)利用本發(fā)明所制備的單克隆抗體，可有效地用于田間作物及灰飛虱中的水稻黑條矮縮病毒的檢測。


圖1是dot-ELISA方法檢測水稻RBSDV的靈敏度分析； 圖2是dot-ELISA方法檢測水稻田間樣品中RBSDV的結(jié)果； 圖3是dot-ELISA方法檢測灰飛虱體內(nèi)RBSDV的靈敏度分析； 圖4是dot-ELISA方法檢測田間灰飛虱體內(nèi)RBSDV的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式分泌抗水稻黑條矮縮病毒單抗雜交瘤細(xì)胞，于2011年11月觀日，保藏于中國科學(xué)院微生物研究所，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 5537，它能分泌抗水稻黑條矮縮病毒的單克隆抗體?？顾竞跅l矮縮病毒的單克隆抗體腹水間接ELISA效價(jià)達(dá)10_6以上，抗體類型及亞類為IgGl、kappa鏈，該單克隆抗體能與水稻黑條矮縮病毒56kD的外殼蛋白亞基有特異性免疫結(jié)合反應(yīng)?？顾竞跅l矮縮病毒單克隆抗體在該病毒檢測上的應(yīng)用是以單克隆抗體為核心建立的各種免疫學(xué)檢測方法和免疫學(xué)試劑盒。本發(fā)明提供的雜交瘤細(xì)胞株能大量分泌抗水稻黑條矮縮病毒單抗，且其特異性強(qiáng)、效價(jià)高、穩(wěn)定性好。以該單抗為核心建立了檢測RBSDV的高通量的血清學(xué)方法，并可應(yīng)用于田間RBSDV的檢測，從而為我國水稻黑條矮縮病早期監(jiān)測和預(yù)警，科學(xué)指導(dǎo)防控提供物質(zhì)和技術(shù)支持。下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。一、雜交瘤細(xì)胞獲得及其單克隆抗體的制備 1.免疫原及檢測抗原的制備
根據(jù)GenBank中報(bào)道的水稻黑條矮縮病毒(RBSDV)的衣殼蛋白基因(CP基因)序列設(shè)計(jì)引物CP-F :5-CGGGATCCATGGCTGACATAAGACTCGA~3 和 CP - R :5~CG GTCGACTCATCTTGTCACTTTGTTTAG-3,上游引物對應(yīng)于日本分離物(Accession No. D00606) 的22-41 nt，下劃線處為BamH I酶切位點(diǎn)，下游引物與中國浙江分離物(Accession No. AJ297433)的1678-1698 nt互補(bǔ)，下劃線處為Sal I酶切位點(diǎn)，引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。利用Trizol試劑提取水稻病樣的總RNA，第一鏈cDNA的合成按照 RevertAidTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行，即模板RNA 2 μ ，下游引物1 μ ，RNase Free H2O 9 μ ?；靹蚝?70°C下 5 min，取出置冰上 3-5 min ；加入 4 μ 5 X RT Buffer, 2 μ dNTP Mix, 1 M-I Rnasin Inhibitor,混勻后 37°C下 5 min ；力卩入 1 M-I Reverse Transcriptase, 混合后42°C下反應(yīng)lh，70°C下10 min使逆轉(zhuǎn)錄酶失活。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)體系如下預(yù)變性94°C 3 min，變性94°C 1 min，退火52°C 1 min，延伸72°C 2 min 30 sec，循環(huán)擴(kuò)增35次，最后延伸72°C 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物于0. 8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，并用PCR凝膠回收試劑盒(AxyGEN)回收DNA片段，具體操作參考試劑盒說明書進(jìn)行。 將回收的目的基因片段與克隆載體PMD-18T vector連接，重組質(zhì)粒命名為pMD18_T_CP，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH 5α的感受態(tài)細(xì)胞中，用質(zhì)粒提取試劑盒(AxyGEN)提取重組質(zhì)粒，對提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，并通過測序驗(yàn)證重組克隆載體pMDIS-T-CP中所攜帶的CP基因序列及讀碼框的正確性，序列分析軟件為DNAstar、NCBI-BLAST，所用的數(shù)據(jù)庫為GeneBank等。重組質(zhì)粒pMD18_T_CP中CP基因片段經(jīng)BamH I和Ml I雙酶切后定向插入經(jīng)同樣酶切的pET-3h表達(dá)載體中。PCR、酶切篩選陽性克隆，并通過測序驗(yàn)證重組原核表達(dá)載體pET-32a-CP中所攜帶CP基因序列未突變且讀碼框正確。并把原核表達(dá)質(zhì)粒 pET-32a-CP熱擊轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)菌株BL21 (DE3)中，挑取單菌落接種到含氨芐青霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)過夜，按1 : 100的比例將培養(yǎng)物接種于含氨卞青霉素抗性的新鮮TB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至0D600 0. 5加入終濃度為1 mmol . L-I IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4 h，離心收集菌體。部分菌體加入IX SDS-PAGE上樣緩沖液，沸水中處理5-10 min, 12 000 rpm離心后取上清10 μ 進(jìn)行12. 5% SDS-PAGE電泳分析，其余菌體經(jīng)超聲波破碎，收集上清按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行用Ni+ NTA親和層析柱純化目的蛋白。以純化的重組CP蛋白作為免疫原及檢測抗原。2.免疫動物
用免疫原表達(dá)的重組RBSDV外殼蛋白CP免疫四周齡體重18-20g BALB/C雌性小鼠。 用免疫原RBSDV CP外殼蛋白ΙΟΟμ ν只與等體積福氏完全佐劑混合，充分乳化后，經(jīng)背腹部皮下多點(diǎn)注射0. 2ml每只，間隔3周，取與一免等量抗原和等體積的福氏不完全佐劑充分乳化后，第二次腹腔注射0. 2ml每只，過3周后用加倍劑量的抗原進(jìn)行腹腔注射，3天后取脾細(xì)胞進(jìn)行融合。3.細(xì)胞融合取上述免疫小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)按5-10 1的比例，在無血清的 RPMI-1640 (Gibco)培養(yǎng)基中混勻，1500rpm離心5min，去除培養(yǎng)基，用50 % PEG (Sigma，分子量1500)作為融合劑，在37°C下水浴下加入1ml，使其融合2min，用無血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基終止融合后1500rpm離心5min，沉淀用HAT培養(yǎng)基懸浮，分裝到96孔含有飼養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞板中，37°C，5 % CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4.雜交瘤細(xì)胞、陽性孔的篩選及其克隆
細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天后，用HAT培養(yǎng)基換液一次，第10天用HT培養(yǎng)基換液，等到融合細(xì)胞覆蓋孔底5%-50%時，以RBSDV PlO蛋白為檢測抗原包被，用常規(guī)間接ELISA方法篩選陽性孔，共獲72個陽性孔。選擇10個呈強(qiáng)陽性反應(yīng)的細(xì)胞孔，進(jìn)行有限稀釋法克隆，獲得1株能分泌抗RBSDV的特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞株5G1。經(jīng)6個月以上體外傳代和多次凍存復(fù)蘇后，細(xì)胞株均能良好生長，并穩(wěn)定分泌抗體。經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后，用于腹水制備和液氮保存。5.單克隆抗體的特異性檢測
用感染蕪菁花葉病毒(TuMV)、番茄花葉病毒(ToMV)、煙草花葉病毒(TMV)、黃瓜花葉病毒(CMV)、馬鈴薯X病毒(PVX)和馬鈴薯Y病毒(PVY)、水稻矮縮病毒(RDV)、水稻條紋病毒 (RSV)、水稻齒葉矮縮病毒(RRSV)的病葉汁包被ELISA反應(yīng)板，以相應(yīng)的健葉提取液作陰性對照，以水稻黑條矮縮病毒為陽性對照，用間接ELISA法測定單抗的特異性反應(yīng)。間接 ELISA方法具體為上述病毒感染的病葉用液氮研磨成粉末，按1: 30 (w/v, g /mL)加入 ELISA包被液研磨后IOOul/孔包被ELISA板，4°C過夜或37°C 2小時，使其吸附于聚苯乙烯板孔；PBST洗滌三次后用1-10%的脫脂奶粉或1-3% BSA或3_6%牛血清封閉30-60min; 加入單抗IOOul/孔，370C 1-2小時；PBST洗滌三次后加入按說明書稀釋10000倍的堿性磷酸脂酶(AP)標(biāo)記兔抗鼠IgG 二抗(Sigma公司)100ul/孔，37°C 1-2小時，PBST洗滌四次后，用PNPP底物顯色，2mol/L氫氧化鈉終止反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀讀取OD4tl5的值，以與陰性O(shè)D 值比值大于2. 1為陽性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5G1單抗對RBSDV有特異性反應(yīng)，而與TuMV、TMV、I10MV、 CMV, PVY, PVX, RDV, RSV、RRSV其他病毒均無特異性反應(yīng)。6.單克隆抗體腹水制備及純化
取8周齡左右BALB/C小鼠，腹腔注射0. 3-0. 5ml降植烷(Sigma)，7_10天后腹腔注入5-10 X IO5個雜交瘤細(xì)胞，注射后7-10天可見小鼠腹部明顯膨大，采取腹水，3000rpm離心:3min，收集上清液，即為單克隆抗體腹水。取1倍體積腹水加2倍體積0.06 M PH4. 8 醋酸緩沖液稀釋，加辛酸(30ul/ml腹水)，室溫下邊加邊攪拌，4°C澄清1小時，12000rpm 離心20min，收集上清，再用50%飽和硫酸銨沉淀免疫球蛋白，4°C放置2小時，3000rpm離心20min，沉淀用2倍體積的PBS溶液溶解，在4°C流動透析M小時后即獲純化的腹水抗體，-70°C保存。7.單克隆抗體的亞類鑒定和腹水效價(jià)測定
將純化的單抗腹水與Sigma公司的標(biāo)準(zhǔn)抗BALB/C小鼠IgG1、IgG2aUgG2bUgG3^IgM抗體作雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，結(jié)果為5G1單抗亞類為IgGl、kappa鏈。用常規(guī)間接ELISA方法檢測單抗腹水效價(jià)，結(jié)果為上述單抗腹水效價(jià)在10 —6以上。二、病毒免疫學(xué)檢測方法及其檢測試劑盒
1.用單抗建立抗原包被ELISA (ACP-ELISA)方法檢測病毒ACP-ELISA方法的操作步驟
(1)用0.05M碳酸鹽緩沖液(pH9. 6)按1: 30 (w/v, g /mL)倍稀釋的病葉汁液或按 150 ul碳酸鹽緩沖液每頭灰飛虱加入后搗爛的上清IOOul/孔加入ELISA板，以RBSDV病葉或攜帶RBSDV灰飛虱為陽性對照，相應(yīng)健葉或非帶毒灰飛虱為陰性對照，37°C 2h，或4°C過夜；
(2)PBST洗滌后用5%脫脂奶粉封閉30min ；
(3)單抗腹水5000倍稀釋后IOOul/孔，37°CIh ；
(4)PBST洗滌后加入5000倍稀釋的堿性磷酸脂酶(AP)或辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠 IgG 二抗(Sigma)，IOOul/孔，37°C，Ih ；
(5)用PBST洗滌后加入硝基磷酸鹽底物或TMB底物IOOul/孔，室溫30min；
(6)用肉眼觀察，底物顏色變成黃綠色或藍(lán)色的孔為陽性，或用2mol/L氫氧化鈉或硫酸終止反應(yīng)后，用酶聯(lián)免疫檢測儀測0D405或450值，以P/N> 2. 1作為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)。ACP-ELISA方法檢測靈敏度檢測
單抗腹水工作濃度為5000倍稀釋，對病葉從1 :10至5120作倍比稀釋或單頭灰飛虱進(jìn)行倍比稀釋50uL/頭至12800uL/頭，分別以相應(yīng)稀釋度的健葉汁液作陰性對照，進(jìn)行上述 ACP-ELISA方法檢測。結(jié)果表明ACP-ELISA方法對1 :10 160倍稀釋的病葉汁液及單頭灰飛虱稀釋到50 uL 1600uL/頭均呈陽性反應(yīng)，即對檢測病葉的靈敏度可達(dá)到1 :160，對灰飛虱的檢測靈敏度達(dá)到1600 uL/頭，表明ACP-ELISA方法具有高度的靈敏性和可靠性。2.檢測 RBSDV 的 TAS-ELISA 檢測方法 2. 1. TAS-ELISA方法的操作流程
1)1 5000倍稀釋的抗RBSDV的兔抗血清(由純化的原核表達(dá)TYLCV-CP免疫兔子制備) IOOul/孔包被聚苯乙烯板，370C，2-4h或4°C，過夜；
2)PBST洗滌三次后加1-10%的脫脂奶粉或1-3% BSA或3_6%牛血清封閉200ul/孔于 37°C 封閉 30-60min
3)加入檢測樣品IOOul/孔。以RBSDV病葉或攜帶RBSDV的灰飛虱為陽性對照，以相應(yīng)的健康樣品或非帶RBSDV的灰飛虱為陰性對照，37°C l-2h ；
4)洗滌后用封閉液稀釋5000倍的單抗腹水IOOul/孔，37°Cl-2h
5)PBST洗滌后加入10000倍稀釋的AP或HRP標(biāo)記兔抗鼠IgG 二抗(Sigma)IOOul/孔， 370C l-2h
6)PBST洗滌后加PNPP底物或TMB底物于室溫顯色5-30min，肉眼觀察底物顏色變成黃綠色或藍(lán)色的孔為陽性，2mol/L氫氧化鈉或硫酸終止反應(yīng)后，用680型酶聯(lián)免疫檢測儀測 405nm或450nm的OD值，以P/N> 2. 1作為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)。2. 2. TAS-ELISA檢測方法最適條件的確定
采用TAS-ELISA方陣試驗(yàn)進(jìn)行，即橫向分別加用包被緩沖液從1 : 100至1 : 10M00 倍比稀釋的兔抗RBSDV血清；加入RBSDV病葉汁或灰飛虱勻漿液；縱向分別加用封閉液從 1 5至1 2048000倍比稀釋單抗腹水；AP標(biāo)或HRP記的兔抗鼠IgG 二抗按Sigma公司說明書稀釋，1 10000倍；按TAS-ELISA方法流程進(jìn)行操作。結(jié)果表明水稻黑條矮縮病毒 RBSDV的兔抗血清及單抗的最適稀釋度分別為1 : 5000、1 5000。2. 3. TAS-ELISA方法檢測靈敏度的確定在兔抗血清和單抗腹水最適工作濃度下，將RBSDV病葉汁或灰飛虱勻漿液用PBS液進(jìn)行倍比稀釋后進(jìn)行TAS-ELISA測定，測定結(jié)果為TAS-ELISA檢測病葉和灰飛虱的靈敏度分別達(dá)到1:600倍稀釋(w/v，g /mL)和1600 uL/頭，說明本方法具有很好的靈敏度。3. dot-ELISA方法的建立及田間檢測應(yīng)用
3. 1 dot-ELISA檢測水稻中RBSDV方法的建立及其田間樣品檢測將水稻葉片稱重后用液氮研磨成粉末，按1 10 30 (w/v, g /mL)加入0. 01 mol/L PBS (pH7. 4)后研磨；病汁液5000 rpm離心3 min;取3 μ 1上清點(diǎn)到NC上，同時設(shè)置健康和感病水稻葉汁分別作為陰性和陽性對照；室溫干燥10-20 min; NC膜浸入到含5%脫脂奶粉的PBST (含0. 05% Tween-20的0. 01 mol/L PBS)封閉液中室溫封閉30 min ； NC膜放入適度稀釋的單抗中室溫孵育30-60 min ；用PBST洗膜3 4次，每次3 min ； NC膜放入適度稀釋的AP酶標(biāo)記羊抗鼠IgG 二抗中室溫孵育3(T60 min; PBST洗膜4 5次，每次 3 min; 66 μ L NBT 禾口 33 μ L BCIP 底物(Promega)加入到 10 ml 底物緩沖液(0. 1 mol/ L Tris CU0. 1 mol/L NaCl、0. 025 mol/L MgCl、ρΗ9· 5)混勻，膜放入底物液中反應(yīng)，肉眼觀察結(jié)果。待陽性對照顯色明顯，而陰性沒有任何顯色時自來水漂洗終止反應(yīng)，拍照記錄結(jié)^ ο用方陣試驗(yàn)確定檢測水稻病葉的dot-ELISA單抗和酶標(biāo)二抗的最適工作濃度，試驗(yàn)表明5G1單抗及酶標(biāo)二抗的最適工作濃度分別為1:3000和1:8000倍稀釋。以上述抗體的最適工作濃度建立檢測RBSDV病葉的dot-ELISA方法。靈敏度分析表明，當(dāng)水稻葉片稀釋到1:160倍(w/v，g/mL)時，以5G1單抗建立的dot-ELISA檢測仍呈現(xiàn)紫色的陽性斑點(diǎn)， 即其檢測病葉的靈敏度達(dá)到1:160倍稀釋(圖1)。用建立的dot-ELISA方法對2010、2011年采自江蘇蘇州、南京土橋、江蘇連云港、浙江湖州等水稻田間疑似發(fā)病水稻樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，50個水稻檢測樣品中有 38個樣品產(chǎn)生紫色的陽性斑點(diǎn)(圖2)，陽性樣品進(jìn)一步用RT-PCR分析，結(jié)果表明所有的 dot-ELISA陽性樣品均檢測到RBSDV特異性的PCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物核酸測序表明陽性樣品感染RBSDV。說明該dot- ELISA方法能準(zhǔn)確、可靠地用于水稻樣品中水稻黑條矮縮病毒的檢測。3. 2 dot-ELISA檢測灰飛虱體內(nèi)RBSDV方法的建立及其田間樣品檢測
單頭灰飛虱放入1. 5 mL的印pendorf的離心管中，并加入100 μ L PBS (0. 01mol/L, pH7. 4)，用牙簽搗爛灰飛虱后、稍靜置，取3 μ L上清點(diǎn)到NC膜上，膜干燥、單抗孵育、二抗孵育、顯色步驟與dot-ELISA檢測水稻中RBSDV方法相同，不同的只是二抗為適度稀釋的 HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG 二抗，顯色底物是HRP的顯色底物，即TMB顯色底物。同時設(shè)非帶毒和帶毒的灰飛虱作為陰性和陽性對照。用方陣試驗(yàn)確定檢測稻飛虱的dot-ELISA單抗和酶標(biāo)二抗的最適工作濃度，試驗(yàn)表明5G1單抗及酶標(biāo)二抗的最適工作濃度分別為1:3000和1:5000倍稀釋。以上述抗體的最適工作濃度建立檢測飛虱體內(nèi)RBSDV的dot-ELISA方法，檢測結(jié)果表明攜帶RBSDV的灰飛虱呈現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)，而無毒的灰飛虱沒有任何顯色反應(yīng)，即建立的dot-ELISA方法能特異性地檢測灰飛虱體內(nèi)的RBSDV。靈敏度分析表明，當(dāng)單頭灰飛虱加1600 μ L PBS時，以5G1 單抗建立的dot-ELISA檢測仍呈現(xiàn)藍(lán)色的陽性斑點(diǎn)，即其檢測灰飛虱的靈敏度達(dá)到1 :1600 稀釋(頭/yL)(圖3)。
用建立的dot-ELISA方法對2010、2011年采自江蘇蘇州、南京土橋、江蘇連云港、 浙江湖州等水稻發(fā)病田間的灰飛虱、人工飼喂獲毒的和無毒的灰飛虱進(jìn)行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 130頭灰飛虱檢測樣品中有61頭產(chǎn)生藍(lán)色的陽性斑點(diǎn)，而無毒的灰飛虱沒有產(chǎn)生任何藍(lán)色斑點(diǎn)(圖4)。陽性樣品進(jìn)一步用RT-PCR分析，結(jié)果表明所有的dot-ELISA陽性樣品均檢測到 RBSDV特異性的PCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物核酸測序表明陽性樣品感染RBSDV。說明該dot- ELISA 方法能準(zhǔn)確、可靠地用于灰飛虱樣品中水稻黑條矮縮病毒的檢測。3. 3水稻黑條矮縮病毒dot-ELISA檢測試劑盒(水稻和灰飛虱樣品)
1)試劑盒主要成分 RBSDV單克隆抗體1管 AP標(biāo)記羊抗鼠IgG 二抗1管 HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG 二抗1管 NBT/BCIP底物各1瓶 TMB底物 1瓶
陽性對照1 (含RBSDV水稻葉片汁液)1管陽性對照2 (帶毒RBSDV灰飛虱勻漿液)1管陰性對照1 (健康水稻葉片汁液)1管陰性對照2 (非帶毒灰飛虱勻漿液)1管抗體稀釋液(IOX) 1瓶以上試劑均保存于4°C下硝酸纖維素膜(NC) 10張
2)檢測水稻樣品的操作步驟
a.將水稻葉片稱重后用液氮研磨成粉末，按1:10 30(w/v, g /mL)加入0.01 mol/ L PBS (pH7. 4)后研磨；
b.病汁液5000rpm離心3 min;
c.取3μ 1上清點(diǎn)到NC上，同時設(shè)置健康和感病水稻葉汁分別作為陰性和陽性對照， 室溫干燥10-20 min;
d.NC膜浸入到含5%脫脂奶粉的PBST (含0. 05% Tween-20的0. 01 mol/L PBS)封閉液中室溫封閉30 min ；
e.NC膜放入1 2000倍稀釋的單抗中室溫孵育30 60 min ；
f.用PBST洗膜3 4次，每次3min ； NC膜放入1 3000稀釋的AP酶標(biāo)記羊抗鼠IgG 二抗中室溫孵育30 60 min;
g.PBST洗膜4 5次，每次3 min ； 66 μ L NBT和33 μ L BCIP底物加入到10 ml底物緩沖液(0. 1 mol/L Tris C1、0. 1 mol/L NaCl、0. 025 mol/L MgCl、pH9. 5)混勻，膜放入底物液中反應(yīng)，肉眼觀察結(jié)果；
h.待陽性對照顯色明顯(紫色)，而陰性沒有任何顯色時自來水漂洗終止反應(yīng)，拍照記錄結(jié)果。3)檢測灰飛虱樣品的操作步驟
a.單頭灰飛虱放入1. 5 mL的印pendorf的離心管中，并加入50-100 μ L PBS (0. 01mol/L,pH7. 4)，用牙簽搗爛灰飛虱后、稍靜置，取3 μ L上清點(diǎn)到NC膜上，同時設(shè)置帶
0.2ml0.1ml0.1ml
分別為2 ml和Iml 10 ml 2 ml 2ml 2 ml 2 ml 80ml
9毒和非帶毒的灰飛虱分別作為陰性和陽性對照，室溫干燥10-20 min;
b.NC膜浸入到含5%脫脂奶粉的PBST (含0. 05% Tween-20的0. 01 mol/L PBS)封閉液中室溫封閉30 min ；
c.NC膜放入1 3000倍稀釋的單抗中室溫孵育30 60 min ；
d.用PBST洗膜3 4次，每次3min ； NC膜放入1 3000倍稀釋的HRP酶標(biāo)記羊抗鼠 IgG 二抗中室溫孵育30 60 min;
e.PBST洗膜4 5次，每次3 min;膜放入TMB底物液中反應(yīng)，肉眼觀察結(jié)果；
f.待陽性對照顯色明顯(藍(lán)色)，而陰性沒有任何顯色時自來水漂洗終止反應(yīng)，拍照記錄結(jié)果。4)保存及有效期于2 8°C避光保存，有效期12個月。5)緩沖液配方
磷酸鹽緩沖液(PBS，0. 01 mol/L, ρΗ7· 4) NaCl KCl
KH2PO4
Na2HPO412Η20 疊氮化鈉
加蒸餾水950溶解后調(diào)ρΗ至7. 4，定容至1000 ml ELISA 洗滌液(0. 01 mol/L PBST) 1000 ml 0. 01mol/L PBS 中力口 0. 5 ml Tween-20 ELISA封閉液
0.01 mol/L PBST中加入脫脂奶粉至終濃度5% (ff/V)c
權(quán)利要求
1.一種分泌抗水稻黑條矮縮病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，保藏號為CGMCC No. 5537，其特征在于能分泌抗水稻黑條矮縮病毒的單克隆抗體。
2.一種如權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞株分泌的抗水稻黑條矮縮病毒的單克隆抗體，其特征在于該單克隆抗體腹水間接ELISA效價(jià)達(dá)10_6以上，抗體類型及亞類為IgGl、 kappa鏈，該單克隆抗體能與水稻黑條矮縮病毒56kD的外殼蛋白亞基有特異性免疫結(jié)合反應(yīng)。
3.—種如權(quán)利要求2所述的抗水稻黑條矮縮病毒單克隆抗體在該病毒檢測上的應(yīng)用，其特征在于以單克隆抗體為核心建立的各種免疫學(xué)檢測方法和免疫學(xué)試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種分泌抗水稻黑條矮縮病毒單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其單抗的應(yīng)用。用原核表達(dá)的方法表達(dá)水稻黑條矮縮病毒(RBSDV)的外殼蛋白CP為抗原免疫BALB/c小鼠，經(jīng)細(xì)胞融合、篩選、克隆，獲得1株能穩(wěn)定傳代并分泌抗RBSDV單克隆抗體(MAb)的雜交瘤細(xì)胞株5G1，其保藏號為CGMCCNo.5537。5G1單克隆抗體腹水間接ELISA效價(jià)達(dá)10-6以上，抗體類型及亞類為IgG1，kappa鏈。該株細(xì)胞分泌的單抗與RBSDV的外殼蛋白有特異免疫結(jié)合反應(yīng)。利用5G1單抗為核心建立的檢測稻飛虱和水稻中RBSDV的dot-ELISA檢測方法，當(dāng)單頭灰飛虱稀釋到1600μL時，病葉1:160倍稀釋(w/v,g/mL)時仍能檢測到病毒。抗RBSDV單抗的制備及其檢測方法的建立為該水稻病毒病的診斷、預(yù)報(bào)及科學(xué)防控提供技術(shù)和物質(zhì)支撐。
文檔編號G01N33/577GK102533664SQ20121000416
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月9日
發(fā)明者倪躍群, 劉歡, 吳建祥, 周雪平, 饒黎霞 申請人:浙江大學(xué)