專利名稱：一種用于等電聚焦分離的微流控芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微流控芯片，尤其是涉及ー種利用鋸齒形的微通道實現(xiàn)高分辨率等電聚焦分離的用于等電聚焦分離的微流控芯片。
背景技術(shù)：
等電聚焦(Isoelectric focusing, IEF)是利用兩性電解質(zhì)載體在電場中形成連續(xù)的PH梯度，蛋白質(zhì)等生物分子具有特定的等電點，在pH梯度中會遷移到具有與等電點相一致的PH的位置，從而實現(xiàn)分離、測定和鑒定等目的的ー種方法。早期的等電聚焦電泳采用垂直管式，近年來又發(fā)展了超薄層水平板式等電聚焦電泳，一般采用聚丙烯酰胺凝膠作為抗對流和擴散的支持介質(zhì)(D. J.布勒爾，E.佩特斯，R.庫爾持，R.彭特曼中國專利CN101460835A)。也有使用pH梯度固定的IPG膠條 (Gorg, A. ；Obermaier, C. ；Boguth, G. ；Harder, A. , Scheibe, B. ；Wildgruber, R. ；Weiss, W. Electrophoresis 2000，21，1037-1053)，這ー改進簡化了蛋白質(zhì)的等電聚焦分離、檢測。這類方法雖然使用方便、實驗準(zhǔn)備與操作較為簡単，但是所需的兩性電解質(zhì)等原料及樣品量相對較大，不適合進行微量蛋白質(zhì)混合樣品的分離檢測，而且對于等電點相近的蛋白質(zhì)的分辨能力有限，分離效果有待提高。針對這些不足，發(fā)展了基于毛細(xì)管的等電聚焦方法(cIEF)，利用載體兩性電解質(zhì)在石英毛細(xì)管內(nèi)進行樣品的等電聚焦(楊春，張玉奎，張麗華中國專利CN1831526A)，能有效降低所需試劑和樣品量、縮短分離時間、提高分辨率 (張玉奎，朱貴杰，張麗華，楊春，劉和春，張維冰中國專利CN1865991A ；屈鋒，蔡波大，馬文韜中國專利CN101556^K)A)，并且可以和其他分離方法進行耦聯(lián)(張祥民，毛煜，中國專利 CN1316244C)。但毛細(xì)管結(jié)構(gòu)簡單、功能単一，無法在結(jié)構(gòu)上進行改進以進一步提高分析性能。微流控芯片是利用各種微加工技術(shù)在芯片材料上加工出具有各種功能的微結(jié)構(gòu)， 實現(xiàn)反應(yīng)、分離、檢測等功能。自20世紀(jì)90年代初Manz和Widmer等(Manz A，Graber N, Widemer H M. Sens. Acturators，B，1990，1，244-248)首次提出以來，微流控芯片技術(shù)得到了快速發(fā)展。在微流控芯片上進行等電聚焦分離，能夠有效降低試劑消耗、加快分離速度和提高分離效率(Chen，H.，F(xiàn)an, Ζ. H. Electrophoresis, 2009, 30, 758-765) 在微流控芯片上進行等電聚焦已有大量的報道，表現(xiàn)出了優(yōu)異的性能(Hofmarm，0.，Che, D. P.， Cruickshank, K. A. ，Muller, U. R. ，Anal. Chem. 1999,71,678-686 ；Tan, W. ，F(xiàn)an, Ζ. H. ，Qiu, C. X.，Ricco, A. J.，Gibbons, I. Electrophoresis 2002，23，3638-3645)。但目前已報道的利用微流控芯片進行等電聚焦的方法，仍主要延續(xù)cIEF的方法，較少在微通道結(jié)構(gòu)上進行改進以提高分離性能，對于等電點比較接近的樣品，仍無法達(dá)到很好的分離效果，分離分辨率還有待進ー步提高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于等電聚焦分離的微流控芯片。
本發(fā)明設(shè)有2片基底，所述2片基底經(jīng)可逆或非可逆鍵合形成，在1片基底上加工有微通道和出入孔，所述出入孔作為儲液池，所述微通道設(shè)有收縮區(qū)域和擴大區(qū)域，所述收縮區(qū)域與擴大區(qū)域之間設(shè)有過渡的連接區(qū)域，所述連接區(qū)域具有傾角，以便于蛋白質(zhì)等樣品在微通道內(nèi)的運動和分離。所述微流控芯片可由石英、玻璃、硅、高聚物或者其他材料制作而成，也可以是鋸齒形的固相PH梯度(IPG)膠條。所述微通道可采用IGP膠條，通過收縮區(qū)域和擴大區(qū)域在電場作用下實現(xiàn)非線性的PH梯度。所述微通道(IPG膠條)的寬度可為Inm 5cm，長度可為Ιμπι lm。擴大區(qū)域和收縮區(qū)域的寬度的比值可為1 107，可以通過調(diào)節(jié)不同的寬度，實現(xiàn)不同比值的微通道結(jié)構(gòu)。所述微通道可以是直形、盤管形、矩形或螺旋形等，所述微通道可以是單根通道或多根平行通道。以下給出本發(fā)明的使用方法1)將樣品溶解在含有 5%載體兩性電解質(zhì)的電泳緩沖液內(nèi)，并加入到微通道內(nèi)，在微通道兩端的出入孔(儲液池)中分別加入陽極和陰極緩沖液。2)將電極插入陽極和陰極緩沖液中，并施加電壓進行等電聚焦，電壓范圍為IV 10萬V。載體兩性電解質(zhì)會根據(jù)電場分布和電壓降在微通道內(nèi)形成相應(yīng)的PH梯度，樣品由于各自的等電點不同而在PH梯度中帶上不同的電荷。帶有電荷的樣品在電場作用下在pH 梯度中進行遷移，直到遷移到某一位置。這ー位置的PH值與樣品的等電點一致，樣品在此位置會失去電荷呈電中性而停止遷移。不同的樣品由于具有不同的等電點從而能在微通道內(nèi)實現(xiàn)分離。3)所述樣品可以是但不限于生物分子及化合物，如蛋白質(zhì)和相關(guān)化合物(如多肽、肽、單克隆或多克隆的抗體、可溶的或結(jié)合的受體、轉(zhuǎn)錄因子等)；核酸和相關(guān)化合物 (例如DNA、RNA、寡核苷酸或其類似物、PCR產(chǎn)物、基因組DNA、細(xì)菌人工染色體、質(zhì)粒等)；抗原、配體、半抗原、碳水化合物和相關(guān)化合物(例如多糖、低聚糖等)；細(xì)胞片段，如細(xì)胞膜片段、細(xì)胞器、完整細(xì)胞、細(xì)菌、病毒、原生質(zhì)等；藥物；受體等。傳統(tǒng)的等電聚焦是在兩性電解質(zhì)(或IPG膠條)上形成線性的pH梯度從而實現(xiàn)蛋白質(zhì)等樣品的等電聚焦分離，本發(fā)明的突出特點在于在PH梯度范圍為定值的前提下，利用微通道寬度的周期性變化，引起通道內(nèi)電場分布也呈規(guī)律性的變化，以形成非線性的PH梯度，使等電點比較相近的蛋白質(zhì)樣品能夠?qū)崿F(xiàn)更高分辨率的分離。本發(fā)明是基于微流控芯片技木，具有尺度小、試劑省、分離快以及便于集成化和自動化等特點。微流控芯片利用微加工技木，能夠一次性地加工出成百上千個重復(fù)的微結(jié)構(gòu)，成本低廉、制作簡單、操作簡便、 效率可觀，在等電聚焦分離方面具有良好效果和實際意義。本發(fā)明是加工具有鋸齒狀微通道的微流控芯片，通過電場在微通道內(nèi)的非均勻分布實現(xiàn)非線性的PH梯度，用于蛋白質(zhì)等生物樣品的等電聚焦分離。


圖1為本發(fā)明實施例的結(jié)構(gòu)俯視圖。圖2為圖1的A-A剖面(微通道)的構(gòu)型示意圖。圖3為本發(fā)明實施例的鋸齒形微通道內(nèi)的電場等勢線圖。在圖3中，微流控芯片水平放置，橫坐標(biāo)為平面X方向，縱坐標(biāo)為平面Y方向，微通道沿X方向延伸。
圖4為本發(fā)明實施例的鋸齒形微通道和等寬度微通道內(nèi)的PH梯度對比圖。在圖4 中，橫坐標(biāo)為微通道延伸方向，縱坐標(biāo)為PH值；虛線是在等寬度微通道內(nèi)形成的線性pH梯度，實線是在鋸齒形微通道內(nèi)形成的非線性PH梯度。圖5為本發(fā)明實施例的鋸齒形微通道與等寬度微通道內(nèi)進行等電聚焦分離的效果對比示意圖。在圖5中，橫坐標(biāo)為微通道延伸方向，縱坐標(biāo)為pH值；下圖中的直線是在等寬度微通道內(nèi)形成的PH梯度，折線是在鋸齒形微通道內(nèi)形成的pH梯度；上圖是等電點不同的兩個蛋白質(zhì)分別在兩種不同PH梯度中經(jīng)等電聚焦分離后所處的不同位置。
具體實施例方式以下實施例將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進ー步的說明。實施例1參見圖1和2，微通道的收縮區(qū)域4和擴大區(qū)域5長度均為40 μ m,寬度分別為 50 μ m ^P 100 μ m，其比值為2。收縮區(qū)域4和擴大區(qū)域5之間的連接區(qū)域6長度為10 μ m。 由通道收縮區(qū)域4、擴大區(qū)域5和連接區(qū)域6三個部分組成的重復(fù)結(jié)構(gòu)的長度可為100 μ m。 不同寬度的通道在電場中具有不同的電阻率，具有不同的電壓降，在等電聚焦過程中實現(xiàn)非線性的PH梯度。常規(guī)的等電聚焦中采用的IPG膠條有幾種規(guī)格，長度分別為7cm、llcm、 17cm、18cm和Mem。若制作與IPG膠條相同長度的微通道，則分別可加工700、1100、1700、 1800和MOO個重復(fù)結(jié)構(gòu)。如果每個重復(fù)結(jié)構(gòu)均容納ー個樣品，則峰容量可分別達(dá)到700 個、1100個、1700個、1800個和MOO個。對于pH范圍最大的IPG膠條(范圍從pH = 3到 pH = 10)，其 pH 分辨率分別達(dá)至Ij 0. 0100,0. 00636,0. 0042,0. 0039 和 0. 0030。如果選擇 pH 范圍較窄的IPG膠條，可以實現(xiàn)更高的pH分辨率。同時可根據(jù)需要，減少重復(fù)結(jié)構(gòu)的尺寸進ー步增加重復(fù)結(jié)構(gòu)的數(shù)目以實現(xiàn)更高的峰容量和更高的分辨率。微流控芯片1由兩片基底7經(jīng)可逆或非可逆鍵合所形成，在一片基底上加工有微通道2和出入孔(儲液池)3。所述微通道2的構(gòu)型如圖2所示，微通道由收縮區(qū)域4和擴大區(qū)域5的重復(fù)結(jié)構(gòu)共同組成微通道，收縮區(qū)域4與擴大區(qū)域5之間過渡的連接區(qū)域6具有一定的傾角，以便于蛋白質(zhì)等樣品在微通道內(nèi)的運動和分離。重復(fù)結(jié)構(gòu)的尺寸可根據(jù)需要和加工能力進行加工。微流控芯片可以是由石英、玻璃、硅、高聚物或者其他材料制作及加工而成，也可以是鋸齒形的固相PH梯度(IPG)膠條。所述微通道(IGP膠條)由收縮部分和擴大部分連接在一起組成重復(fù)結(jié)構(gòu)，通過收縮部分和擴大部分在電場作用下實現(xiàn)非線性的PH梯度。微通道(IPG膠條)的寬度范圍是Inm 5cm，長度范圍是1 μ m lm。擴大部分和收縮部分的寬度的比值范圍是1 107，可以通過調(diào)節(jié)不同的寬度，實現(xiàn)不同比值的微通道結(jié)構(gòu)。所述微通道(IGP膠條)可以是直形、盤管形、矩形、螺旋形，可以是單根通道，也可以是多根平行通道。圖3給出本發(fā)明所述用于等電聚焦的微流控芯片的鋸齒形微通道內(nèi)的電場等勢線圖，黒色線條為等勢線。等勢線集中在收縮區(qū)域是因為收縮區(qū)域的電阻比擴大區(qū)域大，電場強度較大，電壓降也相對較多，所以形成的PH梯度也集中在收縮區(qū)域。根據(jù)收縮區(qū)域和放大區(qū)域的截面積對比，會形成如圖4所示的非線性的pH梯度，其中的虛線為線性pH梯度。具有不同等電點的蛋白質(zhì)等樣品在鋸齒形微通道內(nèi)會有更大的幾率聚焦于收縮區(qū)域，由于間隔有擴大區(qū)域能實現(xiàn)更大分辨率的分離。 圖5為具有接近等電點的兩個樣品在兩種不同pH梯度內(nèi)的分離效果示意圖。虛線1所對應(yīng)的位置為線性PH梯度內(nèi)，兩個樣品峰所處的位置；虛線2為在非線性pH梯度內(nèi)，兩個樣品峰所處的位置。后者中兩峰所處的位置相距更遠(yuǎn)，峰的分離度更高。如果兩個樣品在非線性PH梯度內(nèi)被聚集于同一個收縮區(qū)域內(nèi)，可通過對pH梯度的微調(diào)、改變或平移 PH梯度，使這兩個樣品的聚集點分別位于擴大區(qū)域兩側(cè)實現(xiàn)更靈敏的分離。
權(quán)利要求
1.ー種用于等電聚焦分離的微流控芯片，其特征在于設(shè)有2片基底，所述2片基底經(jīng)可逆或非可逆鍵合形成，在1片基底上加工有微通道和出入孔，所述出入孔作為儲液池，所述微通道設(shè)有收縮區(qū)域和擴大區(qū)域，所述收縮區(qū)域與擴大區(qū)域之間設(shè)有過渡的連接區(qū)域。
2.如權(quán)利要求1所述的ー種用于等電聚焦分離的微流控芯片，其特征在于所述微流控芯片采用石英、玻璃、硅、高聚物制成。
3.如權(quán)利要求1所述的ー種用于等電聚焦分離的微流控芯片，其特征在于所述微流控芯片采用鋸齒形的固相PH梯度膠條制成。
4.如權(quán)利要求1所述的ー種用于等電聚焦分離的微流控芯片，其特征在于所述微通道采用IGP膠條。
5.如權(quán)利要求1或4所述的ー種用于等電聚焦分離的微流控芯片，其特征在于所述微通道的寬度為Inm 5cm，長度為1 μ m lm。
6.如權(quán)利要求1所述的ー種用于等電聚焦分離的微流控芯片，其特征在于所述擴大區(qū)域和收縮區(qū)域的寬度的比值為1 107。
7.如權(quán)利要求1或4所述的ー種用于等電聚焦分離的微流控芯片，其特征在于所述微通道為直形微通道、盤管形微通道、矩形微通道或螺旋形微通道。
8.如權(quán)利要求1或4所述的ー種用于等電聚焦分離的微流控芯片，其特征在于所述微通道為單根通道或多根平行通道。
9.如權(quán)利要求1所述的ー種用于等電聚焦分離的微流控芯片，其特征在于所述連接區(qū)域具有傾角。
全文摘要
一種用于等電聚焦分離的微流控芯片，涉及微流控芯片。設(shè)有2片基底，2片基底經(jīng)可逆或非可逆鍵合形成，在1片基底上加工有微通道和出入孔，出入孔作為儲液池，微通道設(shè)有收縮區(qū)域和擴大區(qū)域，收縮區(qū)域與擴大區(qū)域之間設(shè)有過渡的連接區(qū)域，連接區(qū)域具有傾角。在pH梯度范圍為定值的前提下，利用微通道寬度的周期性變化，引起通道內(nèi)電場分布也呈規(guī)律性的變化，以形成非線性的pH梯度，使等電點比較相近的蛋白質(zhì)樣品能夠?qū)崿F(xiàn)更高分辨率的分離。具有尺度小、試劑省、分離快以及便于集成化和自動化等特點，能夠一次性地加工出成百上千個重復(fù)的微結(jié)構(gòu)，成本低廉、制作簡單、操作簡便、效率可觀，在等電聚焦分離方面具有良好效果和實際意義。
文檔編號G01N27/447GK102565171SQ20121000399
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月5日
發(fā)明者付廣春, 張博, 戴思敏, 陳宏 申請人:廈門大學(xué)