專(zhuān)利名稱(chēng)：新型口蹄疫疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種新的含口蹄疫病毒抗原小肽的融合蛋白及其編碼序列，以及這些融合蛋白在口蹄疫的診斷和預(yù)防上的用途。本發(fā)明還提供了含這些新型融合蛋白的口蹄疫疫苗及其制備方法。
口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus，簡(jiǎn)稱(chēng)為“FMDV”)是一種在世界范圍內(nèi)嚴(yán)重影響產(chǎn)肉、奶家畜生產(chǎn)的病毒。目前除滅活病毒疫苗外，還沒(méi)有有效的基因工程疫苗。而滅活病毒疫苗雖然免疫效果較好，但有時(shí)也會(huì)由于滅活不完全反而導(dǎo)致疫情的爆發(fā)，所以歐共體目前已限制滅活疫苗的使用，只在疫情發(fā)生后才在局部地區(qū)使用滅活疫苗。亞洲包括中國(guó)是口蹄疫的多發(fā)地區(qū)，每年對(duì)畜牧業(yè)生產(chǎn)造成巨大損失，因此開(kāi)發(fā)具有高效、安全、廉價(jià)的基因工程疫苗具有重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
隨著對(duì)FMDV研究的深入，它的外殼蛋白(VP1-VP4)的三維結(jié)構(gòu)已被闡明。其主要抗原決定簇為VP1第141-160氨基酸殘基，其中Arg-Gly-Asp(RGD)是病毒顆粒的細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)。另外VP1羧端第198-211氨基酸殘基對(duì)免疫反應(yīng)也有增強(qiáng)作用(FredBrown.(1992)New approachs to vaccination against FMD,Vaccine 10,1022-1026)。
近幾年來(lái)，利用植物病毒為載體表達(dá)外源小肽的系統(tǒng)逐步建立發(fā)展起來(lái)。這是一個(gè)非常有前途的研究方向，特別是用于生產(chǎn)各種用于預(yù)防和治療的多肽藥物。研究表明許多病原的抗原決定簇都是一些不長(zhǎng)的小肽序列，但僅用人工合成的小肽并不足以引起動(dòng)物的免疫反應(yīng)，還需要同一定的載體蛋白連接后才能有效地刺激T細(xì)胞產(chǎn)生抗體。而一些植物病毒如TMV的外殼蛋白(CP)已被證明能對(duì)引起T細(xì)胞的免疫反應(yīng)起促進(jìn)作用(Loor,F.(1967)Comparative immunogenicities of tobacco mosaic virus,protein subunitsand reaggregated protein subunits.Virology 33,215)。而且外殼蛋白可以耐受一定程度的修飾而不影響其對(duì)病毒基因組的包裝。將較短的外源小肽插入CP基因的末端，可以在不影響病毒復(fù)制的前提下，達(dá)到高效表達(dá)外源基因的目的，如表達(dá)病原的抗原決定小肽。此外，CP具有可自動(dòng)組裝成非常穩(wěn)定的棒狀結(jié)構(gòu)的特性，表達(dá)的外源小肽將以極高的密度呈現(xiàn)在棒狀病毒顆粒的表面，這對(duì)刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫反應(yīng)非常有利。另一方面，從實(shí)際應(yīng)用角度來(lái)說(shuō)，與傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵反應(yīng)系統(tǒng)相比，植物病毒表達(dá)系統(tǒng)不需要昂貴的設(shè)備和嚴(yán)格的無(wú)菌操作，也省卻了處理發(fā)酵廢物的麻煩，而且具有表達(dá)量高，純化容易，生產(chǎn)成本較低的優(yōu)點(diǎn)，具有很高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
目前國(guó)外已有多個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)植物病毒表達(dá)載體進(jìn)行探索性研究。HiroshiHamamoto(1993)首次將TMV 126kd和183kd蛋白之間的通讀序列插入CP與外源小肽之間，利用通讀現(xiàn)象表達(dá)了ACEI小肽(12肽)(1Hiroshi Hamamoto,Yoshinori Sugjyama,Noriake Nakagawa,Eiji Hashida,Yuji Matsunaga,Shizume Takemoto,Yuichiro Watanabeand yoshimi okada(1993)A New Tobacco Mosaic Virus Vector and its Use for theSystemic Production of Angiotensin-I-converting Enzyme Inhibitor in Transgenic Tobaccoand Tomato.Bio/technology.11.930-932.)。1995年Thomas H.Turpen用同樣方法成功表達(dá)了瘧疾抗原小肽(12肽)，并進(jìn)行了較大規(guī)模的生產(chǎn)試驗(yàn)，但用該表達(dá)方法，融合外源小肽的CP僅占CP總表達(dá)量的二十分之一(Thomas H.turpen,Stephen J,Reinl,Yupin Charoenvit,Stephen L.Hoffman,Victoria Fallarme,and Laurence K.Grill(1995)Malarial Epitopes Expressed on the surface of Recombinant Tobacco Mosaic Virus.Bio/technology 13,53-57.)。
CPMV(Cowpea mosaic virus)是第一個(gè)以完全CP融合的形式表達(dá)外源小肽獲得成功的植物病毒，Porta C.(1994)把人鼻病毒HRV-14和愛(ài)滋病HIV-1的抗原決定簇插入到CPMV小分子包裝蛋白基因的末端，獲得大量帶抗原決定簇的病毒粒子，且在動(dòng)物試驗(yàn)中顯示出良好的免疫抗原性。但他們?cè)谠噲D表達(dá)FMDV抗原決定簇時(shí)遇到了困難，攜帶FMDV細(xì)胞黏附序列(RDG)的重組病毒無(wú)法在宿主內(nèi)形成系統(tǒng)感染(Porta,C.,Spall,V.E.,Loveland,J.,Johmson,J.E.,Barker,P.J.and Lomonosoff,G.P.(1994)Developmentof Cowpea Mosaic Virus as a High-Yielding System for the Presentation of Foreigh Peptides.Virology 202,949-955.)。
煙草花葉病毒(TMV)是另一個(gè)用該方法表達(dá)小肽獲得成功的例子。TMV是一種宿主范圍廣泛的正鏈桿狀植物病毒，它可以在宿主體內(nèi)高效復(fù)制和表達(dá)，又能在體外穩(wěn)定存在。其中外殼蛋白(CP)的表達(dá)量可以達(dá)到宿主總蛋白的百分之七。Mich B.Hein等人(1995)首次以全CP融合蛋白的形式利用TMV在煙草內(nèi)表達(dá)鼠ZP3小肽(13肽)獲得了成功，表達(dá)量接近野生型TMV。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果也表明用TMV CP融合小肽的形式表達(dá)的抗原決定小肽具有良好的免疫原性(John Fitchen,Roger N.Beachy and Mich B.Hein(1995)Plant virus expressing hybrid coat protein with added murine epitope elicits autoantobodyresponse.Vaccine 13,1051-1057)。其他實(shí)驗(yàn)室也用類(lèi)似方法表達(dá)外源小肽獲得了成功(Yoshinori Sugiyama, Hiroshi Harnamoto, Shizume Takemoto, Yuichiro Watanabe, YoshimiOkada.(1995) Systemic production of foreigh peptides on the particle surface of tobaccomosaic virus. FEBS Letter 359,247-250；Thomas H.turpen,Stephen J,Reinl,YupinCharoenvit,Stephen L.Hoffman,Victoria Fallarme,and Laurence K.Grill (1995)Malarial Epitopes Expressed on the surface of Recombinant Tobacco Mosaic Virus.Bio/technology 13,53-57.)。
因此，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)出具有高效、安全、廉價(jià)的針對(duì)口蹄疫病毒的疫苗以及安全高效的具有口蹄疫病毒免疫原性的蛋白。
本發(fā)明的一個(gè)目的就是提供一種新的具有口蹄疫病毒免疫原性的蛋白。
本發(fā)明的另一目的是提供編碼該具有口蹄疫病毒免疫原性的蛋白的DNA序列。
本發(fā)明的另一目的是提供一種表達(dá)質(zhì)粒，該質(zhì)粒含有編碼具有口蹄疫病毒免疫原性蛋白的DNA序列。
本發(fā)明的另一目的是提供一種高效、安全、廉價(jià)的針對(duì)口蹄疫病毒的疫苗制劑及其制備方法。
在本發(fā)明第一方面，提供了一種煙草花葉病毒外殼蛋白的融合蛋白，該融合蛋白在外殼蛋白的第155-156位氨基酸之間插入有長(zhǎng)度為10-20個(gè)氨基酸的口蹄疫病毒特異性表位。較佳地，該口蹄疫病毒特異性表位的長(zhǎng)度為11-14個(gè)氨基酸。更佳地，該口蹄疫病毒特異性表位選自下組SEQ ID NO:2、3和4。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種分離的DNA分子，它含有編碼權(quán)利要求1所述的融合蛋白的核苷酸序列。較佳地，該DNA編碼的融合蛋白在外殼蛋白的第155-156位氨基酸之間插入有選自下組的口蹄疫病毒特異性表位SEQ ID NO:2、3和4。
在本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述DNA分子的表達(dá)質(zhì)粒。
在本發(fā)明的第四方面，提供了含有上述表達(dá)質(zhì)粒的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的第五方面，提供了一種產(chǎn)生煙草花葉病毒外殼蛋白的融合蛋白方法，它包括(a)將權(quán)利要求7所述的表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄和包裝，形成重組的煙草花葉病毒，該重組的煙草花葉病毒含有編碼該融合蛋白的編碼序列，其中在外殼蛋白的第155-156位氨基酸之間插入有長(zhǎng)度為10-20個(gè)氨基酸的口蹄疫病毒特異性表位；(b)用該重組的煙草花葉病毒感染煙草；(c)在感染2-4周后，從煙草葉中分離出該融合蛋白。
在本發(fā)明的第六方面，提供了一種口蹄疫疫苗制劑，它含有上述的煙草花葉病毒外殼蛋白的融合蛋白。
在附圖中，


圖1是對(duì)重組TMV基因組，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄PCR后，用5％PAGE進(jìn)行檢測(cè)的電泳圖，其中泳道11Kb DNA分子標(biāo)準(zhǔn)；泳道2未感染病毒的煙草；泳道3、4、5、6分別為感染了病毒TMV、TMV-F11、TMV-F14、TMV-F20后煙草的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
圖2是病毒感染煙草兩周到三周后，提取感染葉片總蛋白，進(jìn)行變性蛋白電泳(SDS-PAGE)，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后的電泳圖。其中，泳道1蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(由下至上分別為T(mén)MV CP 17500、Carbonic Anhydrase 30000、Actin 43000、Albumin 67000、Phosphorylase b94000)；泳道2未感染病毒的健康煙草葉片的總蛋白；泳道3、4、5、6分別為野生TMV、TMV-F11、TMV-F14、TMV-F20感染煙草葉片的總蛋白。
圖3是以抗TMV CP的兔血清為一抗，堿性磷酸酯酶偶聯(lián)的羊抗兔IgG為二抗，進(jìn)行蛋白免疫雜交(Western blot)的電泳圖。其中泳道1、2、3、4分別為感染了野生型TMV、TMV-F11、TMV-F14、TMV-F20的煙草總蛋白；泳道5未感染病毒的煙草總蛋白。
圖4是經(jīng)純化的重組病毒顆粒進(jìn)行SDS-PAGE電泳，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后的電泳圖。其中，泳道1蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(由下至上分別為T(mén)MV CP 17500、Carbonic Anhydrase30000、Actin 43000、Albumin 67000、Phosphorylase b 94000)；泳道2、3、4分別為純化的野生TMV、TMV-F11、TMV-F14的外殼蛋白。
圖5是重組TMV病毒pTMV-F11,pTMV-F14,pTMV-F20的結(jié)構(gòu)示意圖，其中，“表位”表示插入了口蹄疫病毒抗原決定小肽的位置。
圖6是制備和檢測(cè)口蹄疫病毒抗原決定小肽的流程圖。
在本發(fā)明中，“口蹄疫病毒特異性表位”、“口蹄疫病毒特異性抗原決定蔟”和“口蹄疫病毒抗原(決定)小肽”可互換使用，指衍生自口蹄疫病毒天然蛋白、重組蛋白或變異蛋白的具有免疫原性的肽片段，當(dāng)將該肽片段施用于哺乳動(dòng)物時(shí)，會(huì)產(chǎn)生針對(duì)口蹄疫病毒的特異性的免疫應(yīng)答反應(yīng)。
口蹄疫病毒抗原決定小肽的長(zhǎng)度通常為至少8個(gè)氨基酸，較佳地至少10個(gè)氨基酸，更佳地至少11個(gè)氨基酸，并且通常不超過(guò)30個(gè)氨基酸，較佳地不超過(guò)25個(gè)氨基酸，更佳地不超過(guò)20個(gè)氨基酸，更佳地不超過(guò)16個(gè)氨基酸，最佳地不超過(guò)14個(gè)氨基酸。一些口蹄疫病毒抗原決定小肽例子包括(但并不限于)口蹄疫病毒的外殼蛋白VP1第142-152位氨基酸所構(gòu)成的肽(SEQ ID NO:2)、VP1羧基端第198-211位氨基酸所構(gòu)成的肽(SEQ ID NO:3)、VP1第141-160位氨基酸所構(gòu)成的肽(SEQ ID NO:4)、VP1第141-152位氨基酸所構(gòu)成的肽、VP1第149-160位氨基酸所構(gòu)成的肽等。
在本發(fā)明中，“口蹄疫病毒外殼蛋白”指口蹄疫病毒的天然外殼蛋白、重組外殼蛋白、或變異外殼蛋白。一種口蹄疫病毒外殼蛋白VP1的例子是具有SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的蛋白。此外，該術(shù)語(yǔ)包括含有或不含有起始甲硫氨酸的外殼蛋白。該術(shù)語(yǔ)還包括單體形式或聚集形式的外殼蛋白，例如聚集成口蹄疫病毒外殼形式的外殼蛋白。
本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。
口蹄疫病毒抗原決定小肽在TMV外殼蛋白中的插入位點(diǎn)通常在外殼蛋白的C末端，較佳地為第155與156氨基酸(S/G)之間。
在實(shí)施本發(fā)明時(shí)，可用本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)(如PCR法、限制性酶切、DNA連接反應(yīng)等)，將口蹄疫病毒抗原決定小肽的編碼序列插入到表達(dá)載體中TMV外殼蛋白的編碼序列中，形成融合蛋白的編碼序列。尤其是插入到外殼蛋白靠近C末端，因?yàn)檫@樣形成融合蛋白仍然可以聚集形成病毒顆粒，而且口蹄疫抗原小肽將暴露在外側(cè)，從而增強(qiáng)了融合蛋白的免疫原性。
在獲得了融合蛋白的編碼序列后，可將其插入了本領(lǐng)域現(xiàn)有的各種載體中，以便進(jìn)行擴(kuò)增、分析，以及用于隨后的體外轉(zhuǎn)錄和病毒包裝。
可用于本發(fā)明的載體包括本領(lǐng)域已知的各種克隆及轉(zhuǎn)錄載體，如市售的克隆載體pUC119等。此外，為了便于克隆和分析，可以對(duì)現(xiàn)有的載體進(jìn)行適當(dāng)?shù)母脑煲员憧寺。缭诳寺≥d體pUC119中引入新的酶切位點(diǎn)，構(gòu)建成新的克隆載體p210-bnx。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”指原核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。
一種特殊的優(yōu)選表達(dá)載體是煙草花葉病毒。由于，TMV感染煙草后可快速地增殖，因此，可以在較短時(shí)間內(nèi)和低成本地獲得大量的本發(fā)明的融合蛋白。
在獲得了含融合蛋白編碼序列的表達(dá)質(zhì)粒體后，可將其轉(zhuǎn)入合適的宿主細(xì)胞，如DH5、JM109、RR1等大腸桿菌菌株，形成重組TMV克隆，以便于進(jìn)行擴(kuò)增和分析。大量提取表達(dá)質(zhì)粒，再按本領(lǐng)域常規(guī)的方法進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄和包裝，可用于直接感染煙草，例如按Willian O.Dawsom,David L.Beck David A.Knorr,and George L.Grantham.(1986)cDNA cloning of the complete genome of tobacco mosaic virus and production ofinfectious transcripts.PNAS 83,1832-1836所述的方法。
在用重組TMV感染煙草后約2-4周之后，可收集煙草葉子并用本領(lǐng)域常規(guī)的各種分離純化方法，分離出本發(fā)明的融合蛋白。這些分離純化方法的例子包括但并不限于蛋白沉淀劑處理(鹽析、PEG沉淀方法)、離心、超離心、常規(guī)的復(fù)性處理、分子篩層析(凝膠過(guò)濾)、吸附層析、親和層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。較佳地的分離方法是差速離心結(jié)合PEG沉淀方法。
本發(fā)明的融合蛋白可用于免疫動(dòng)物，如豬、牛、羊、豚鼠、家兔、小鼠、大鼠等，以刺激免疫應(yīng)答并產(chǎn)生抗體。有多種佐劑可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)，其中包括但不限于弗氏佐劑等。本發(fā)明的融合蛋白還可與口蹄疫病毒的其他疫苗(例如滅活的口蹄疫病毒疫苗)一起使用，本發(fā)明還提供了一種疫苗制劑(藥物組合物)，它含有安全有效量的本發(fā)明融合蛋白或其聚合形式作為活性成分以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類(lèi)載體包括(但并不限于)生理鹽水、緩沖液、水、甘油、羊毛脂、白油、硬脂酸鋁及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水和其他輔劑的水溶液通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類(lèi)的疫苗制劑，可通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。疫苗制劑如針劑和膠囊宜在無(wú)菌條件下制造。本發(fā)明的藥物組合物和或疫苗可以通過(guò)常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)口服、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
使用疫苗制劑時(shí)，是將免疫有效量的本發(fā)明融合蛋白或其聚合形式施用于哺乳動(dòng)物，如果將包含本發(fā)明口蹄疫病毒(FMDV)抗原決定小肽的融合蛋白的疫苗組合物給予被疑或可能感染有口蹄疫病毒(FMDV)的宿主時(shí)，能加強(qiáng)宿主自身的免疫應(yīng)答能力，那么這樣的用量被稱(chēng)為“免疫有效量”。免疫有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過(guò)約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
本發(fā)明還提供了對(duì)一種對(duì)口蹄疫病毒具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于口蹄疫病毒。本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國(guó)專(zhuān)利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來(lái)自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明還提供了一種對(duì)口蹄疫病毒具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體的制備方法。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于口蹄疫病毒。本發(fā)明的抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，將純化的具有口蹄疫表位小肽的融合蛋白，施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。
本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)樣品中是否存在抗口蹄疫病毒的抗體的方法，將樣品與本發(fā)明的融合蛋白接觸，從而與口蹄疫病毒抗體形成復(fù)合物；檢測(cè)是否形成了免疫復(fù)合物，如果形成免疫復(fù)合物就表示存在抗口蹄疫病毒的抗體。
本發(fā)明人將一系列FMDV抗原決定小肽11肽(142-152)、14肽(198-211)、20肽(141-160)肽序列插入TMV CP序列的3′端，使之在CP的羧端與外殼蛋白形成融合蛋白，并對(duì)表達(dá)的小肽進(jìn)行了免疫性測(cè)定。結(jié)果顯示TMV CP融合小肽具有良好的免疫原性。此外，本發(fā)明的這套植物病毒表達(dá)系統(tǒng)略加改變就可以用來(lái)表達(dá)其它各種抗原小肽。同傳統(tǒng)的大腸桿菌發(fā)酵表達(dá)系統(tǒng)相比，本發(fā)明的植物病毒表達(dá)系統(tǒng)提供了一種新的更為廉價(jià)的疫苗來(lái)源。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1表達(dá)載體(TMV cDNA全長(zhǎng)克隆)pTMV20的構(gòu)建TMV cDNA全長(zhǎng)克隆pTMV20是由TMV普通株U1經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后克隆入載體p210-bnx獲得。TMV cDNA 5′端第一個(gè)堿基前緊連在T7 RNA聚合酶的啟動(dòng)子序列下游，并在T7啟動(dòng)子上游引入KpnⅠ位點(diǎn)；為了便于質(zhì)粒線性化進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，又在TMVcDNA 3′端引入了唯一限制性酶切位點(diǎn)PstⅠ。該克隆經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄后感染煙草，表現(xiàn)出TMV的典型感染癥狀。
(1)克隆載體p210-bnx的構(gòu)建人工合成雙鏈寡核苷酸GCTCGGTACCCGTAGGATCCTGACCTGCAGGCTA(SEQ ID NO:6)，它帶有KpnⅠ/BamHⅠ/PstⅠ三個(gè)酶切位點(diǎn)(黑色斜體字母表示)，經(jīng)KpnⅠ/PstⅠ酶切作為插入片段；市售克隆載體質(zhì)粒pUC119經(jīng)KpnⅠ/PstⅠ酶切作為載體，經(jīng)連接構(gòu)建成質(zhì)粒p210-bnx(3.2kb)。
(2)TMV cDNA全長(zhǎng)克隆構(gòu)建過(guò)程1)TMV擴(kuò)增及收獲將TMV普通株U1接種于“革新”煙草進(jìn)行擴(kuò)增。接種一個(gè)月后收獲煙草葉片，用常規(guī)差速離心的方法提取TMV。
2)將TMV懸浮液加入SDS至百分之一，50度溫育15分鐘，經(jīng)酚抽提和NaAC沉淀獲得TMV RNA。以引物PST:5′-ACGTCTGCAGACTGGGCCCCTACCGGGGGTAA-3′(SEQ ID NO:7)經(jīng)SuperscriptⅡ反轉(zhuǎn)錄，獲得單鏈TMV cDNA。
3)以引物T7TMV 5′-GCTCGGTACC CATTAATACG ACTCACTATAGTATTTTTAC AACAATTACCA-3′(SEQ ID NO:8)和BAM:5′-TATCCATAATCACCAAACTA AACTAGGAAT-3′(SEQ ID NO:9)對(duì)單鏈TMV cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)KpnⅠ/BamHⅠ酶切，克隆入載體p210-bnx(經(jīng)KpnⅠ/BamHⅠ酶切)，獲得質(zhì)粒pTMV5′(含TMV cDNA 5′端片段的克隆)。
4)以引物SQ3:5′-GGTCGGCGGAGCCGCCGTGA-3′(SEQ ID NO:10)和PST(同上，SEQ ID NO:7)對(duì)單鏈TMV cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)BamHⅠ/PstⅠ酶切，克隆入載體pTMV5′(經(jīng)BamHⅠ/PstⅠ酶切)，獲得質(zhì)粒pTMV20(含TMV全長(zhǎng)cDNA的克隆)。
表1 TMV cDNA全長(zhǎng)克隆中所用的引物
注斜體字母為酶切位點(diǎn)，下劃線序列為T(mén)7啟動(dòng)子。
實(shí)施例2表達(dá)質(zhì)粒pTMV-F11的構(gòu)建利用兩次PCR的方法，將FMDV抗原小肽序列引入TMV cDNA克隆pTMV20的CP基因。重組TMV克隆經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄和包裝，得到重組煙草花葉病毒TMV-F11，用于直接感染煙草。
11肽克隆的構(gòu)建過(guò)程第一輪PCR以pTMV20為模板，引物為SQ3/F11(-)，退火溫度為52℃,25個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物應(yīng)為771bp；另以pTMV20為模板，引物為F11(+)/PST，退火溫度為58℃,25個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物應(yīng)為258bp。
第二輪PCR上述兩個(gè)PCR產(chǎn)物經(jīng)PAGE分離，回收純化后，作為模板以SQ3/PST為引物，進(jìn)行第二輪PCR，退火溫度在50-52℃之間，35個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物應(yīng)為1009bp的片段，兩端分別帶有NcoⅠ和PstⅠ酶切位點(diǎn)。
PCR產(chǎn)物用NcoⅠ/PstⅠ酶切，約960bp。經(jīng)電泳分離、回收后，作為連接片段。質(zhì)粒pTMV20(9.5kb)用NcoⅠ/PstⅠ酶切，經(jīng)電泳分離、回收8.6kb片段作為連接載體。經(jīng)T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌RR1菌株。經(jīng)酶切鑒定，獲得含有FMDV 11肽序列的表達(dá)質(zhì)粒pTMV-F11。
大腸桿菌RR1/pTMV-F11于1999年12月21日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，中國(guó)，武漢市)，保藏號(hào)為CCTCC NO:M99014。
插入TMV CP的FMDV 11小肽序列如下11肽F11(FMDV VP1 142-152AA):PNLRGDLQVLA(SEQ ID NO:2)
按Willian O.Dawsom,David L.Beck David A.Knorr,and George L.Granthan.(1986)cDNA cloning of the complete genome of tobacco mosaic virus and production of infectioustranscripts.PNAS 83,1832-1836所述的方法，將表達(dá)質(zhì)粒pTMV-F11經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄和包裝，得到重組煙草花葉病毒TMV-F11，直接感染煙草。
表2重組TMV病毒pTMV-F11,pTMV-F14,pTMV-F20的構(gòu)建中所用的引物
實(shí)施例3表達(dá)質(zhì)粒pTMV-F14的構(gòu)建重復(fù)實(shí)施例2的過(guò)程，制備TMV病毒pTMV-F14，不同點(diǎn)在于用F14(+)和F14(-)代替F11(+)和F11(-)，插入的是14肽F14(FMDVV P1 198-211AA):PGRHKEEIVAPVKQ(SEQ ID NO:3)而不是實(shí)施例2中的11肽(SEQ ID NO:2)。從而獲得含有FMDV 14肽序列的重組TMV cDNA克隆pTMV-F14。
表達(dá)質(zhì)粒pTMV-F14經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄和包裝，得到重組煙草花葉病毒TMV-F14，用于直接感染煙草。
實(shí)施例4表達(dá)質(zhì)粒pTMV-F20的構(gòu)建重復(fù)實(shí)施例2的過(guò)程，制備TMV病毒pTMV-F20，不同點(diǎn)在于F20(+)和F20(-)代替F11(+)和F11(-)，插入的是用20肽F20(FMDV VP1 141-160AA):VPNLRGDLQVLAQKVARTLP(SEQ ID NO:4)而不是實(shí)施例2中的11肽(SEQ ID NO:2)。從而獲得含有FMDV 20肽序列的重組TMV cDNA克隆pTMV-F20。
表達(dá)質(zhì)粒pTMV-F20經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄和包裝，得到重組煙草花葉病毒TMV-F20，用于直接感染煙草。
實(shí)施例5反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測(cè)重組TMV基因組試驗(yàn)流程可參見(jiàn)圖6。重組病毒感染煙草兩周后，提取新生葉片總RNA，再經(jīng)反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，檢測(cè)該重組病毒在煙草內(nèi)的復(fù)制表達(dá)情況。5％PAGE電泳結(jié)果如
圖1所示。其中泳道11Kb DNA分子標(biāo)準(zhǔn)；泳道2未感染病毒煙草；泳道3、4、5、6分別為感染病毒TMV、TMV-F11、TMV-F14、TMV-F20煙草的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(重組TMV病毒pTMV-F11,pTMV-F14,pTMV-F20的結(jié)構(gòu)示意圖可參見(jiàn)圖5)。
結(jié)果表明，重組TMV基因組已經(jīng)攜帶了FMDV的11、14、20肽外源片段，并可以在煙草細(xì)胞內(nèi)有效地復(fù)制表達(dá)，系統(tǒng)感染整株煙草。
實(shí)施例6重組病毒感染煙草的總蛋白SDS-PAGE電泳病毒感染煙草兩周到三周后，提取感染葉片總蛋白，進(jìn)行變性蛋白電泳(SDS-PAGE)，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后檢測(cè)。結(jié)果如圖2所示，其中，泳道1蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(由下至上分別為T(mén)MV CP 17500、Carbonic Anhydrase 30000、Actin 43000、Albumin67000、Phosphorylase b 94000)；泳道2未感染病毒的健康煙草葉片的總蛋白；泳道3、4、5、6分別為野生TMV、TMV-F11、TMV-F14、TMV-F20感染煙草葉片的總蛋白。
結(jié)果表明，感染了重組TMV病毒TMV-F11、TMV-F14、TMV-F20的煙草總蛋白中有一主要的蛋白條帶遷移率明顯較野生型TMV外殼蛋白慢?？偟鞍纂娪窘Y(jié)果顯示重組病毒TMV-F11、TMV-F14 CP的表達(dá)量接近野生型TMV CP。
實(shí)施例7
蛋白免疫雜交(Western-blot)以抗TMV CP的兔血清為一抗，堿性磷酸酯酶偶聯(lián)的羊抗兔IgG為二抗，進(jìn)行蛋白免疫雜交(Western blot)。結(jié)果如圖3所示，其中泳道1、2、3、4分別為感染了野生型TMV、TMV-F11、TMV-F14、TMV-F20的煙草總蛋白；泳道5未感染病毒的煙草總蛋白。
結(jié)果顯示，主條帶是融合有外源小肽的TMV CP，其中TMV-F11、TMV-F14的表達(dá)量接近野生TMV外殼蛋白的表達(dá)量。用抗FMDV14肽或20肽的抗血清為一抗分別進(jìn)行Western印跡雜交，也可以專(zhuān)一性地識(shí)別TMV-F14或TMV-F20外殼蛋白上的特定FMDV肽段。
實(shí)施例8重組病毒穩(wěn)定性的檢測(cè)重組病毒感染煙草兩到三周后，取少量新生葉片研磨，將液汁感染四周齡的煙草幼苗進(jìn)行傳代。經(jīng)連續(xù)三次傳代后，取煙草新生葉片進(jìn)行RT-PCR和Western印跡檢測(cè)，結(jié)果都只檢測(cè)到單一的條帶，表明重組TMV病毒基因組的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，能保持持續(xù)穩(wěn)定地表達(dá)口蹄疫病毒小肽。
實(shí)施例9重組病毒顆粒的大量提取和純化及SDS-PAGE電泳重組TMV感染煙草四周后，收獲葉片后在低溫研磨，低速離心去除雜質(zhì)，以PEG沉淀，沉淀溶解后再經(jīng)低速離心去除沉淀雜質(zhì)，上清再重復(fù)進(jìn)行PEG沉淀，既可獲得高純度的重組TMV顆粒(參照D.Noordam(1973)Identification of plant virus.的方法進(jìn)行操作)。結(jié)果如圖4所示，其中，泳道1蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(由下至上分別為T(mén)MV CP17500、Carbonic Anhydrase 30000、Actin 43000、Albumin 67000、Phosphorylaseb 94000)；泳道2、3、4分別為純化的野生TMV、TMV-F11、TMV-F14的外殼蛋白。
每一百克煙草鮮葉可獲得1-2克高純度的融合有11肽或0.5-1.0克14肽的重組TMV病毒。而且純化后的重組TMV結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可以在4℃長(zhǎng)期保存。融合有20肽的重組TMV病毒雖也可以系統(tǒng)感染煙草，但表達(dá)量明顯較TMV CP為低，在純化過(guò)程中發(fā)現(xiàn)病毒顆粒結(jié)構(gòu)不夠穩(wěn)定。
實(shí)施例10疫苗的制備使用前將7倍體積的10號(hào)白油和3倍體積的3％硬脂酸鋁混合均勻作為免疫輔劑，加入適量的待測(cè)TMV,TMV-F11,TMV-F14蛋白樣品，以漩渦振蕩器混合均勻，即制得疫苗。可取適量用于免疫試驗(yàn)動(dòng)物，如豚鼠。
實(shí)施例11融合蛋白在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中的免疫效力測(cè)定以豚鼠為試驗(yàn)對(duì)象(試驗(yàn)表明豚鼠與豬對(duì)FMDV的免疫力基本一致)，進(jìn)行了CP融合小肽免疫效力的測(cè)定。對(duì)11肽(TMV-F11)和14肽(TMV-F14)的進(jìn)行了如下測(cè)定。
1．豚鼠的免疫程序試驗(yàn)共設(shè)四組，疫苗的制備方法如實(shí)施例10所述，每組各免疫四到五只豚鼠(肌注)。豚鼠經(jīng)一次或兩次免疫后由心臟取血，并制備抗血清進(jìn)行乳鼠保護(hù)實(shí)驗(yàn)。取血后豚鼠恢復(fù)4-5天，再進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)。
2．豚鼠保護(hù)實(shí)驗(yàn)取血后豚鼠恢復(fù)4-5天，全部以50倍豚鼠ID50(豚鼠半致病劑量)的FMDV攻毒，在7-10天內(nèi)觀察其發(fā)病情況(腳爪出現(xiàn)紅腫及水泡)。試驗(yàn)結(jié)果如下
3．乳鼠保護(hù)實(shí)驗(yàn)
豚鼠免疫后由心臟取血，制備的豚鼠血清0.1ml皮下注射2-3日齡乳鼠的背部，次日以不同劑量的FMDV攻擊乳鼠，觀察七天，記錄存活數(shù)。
兩次免疫組乳鼠保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果
陰性對(duì)照組乳鼠保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果
故乳鼠保護(hù)指數(shù)為2.0。
這些試驗(yàn)結(jié)果顯示TMV CP融合小肽具有良好的免疫原性，能在豚鼠體內(nèi)激發(fā)產(chǎn)生高水平的中和抗體。
討論如上所述，據(jù)現(xiàn)有的報(bào)道顯示，采用CPMV作為載體表達(dá)FDMV疫苗小肽并不十分成功，帶有“FMDV LOOP”的重組CPMV病毒可感染宿主細(xì)胞并復(fù)制表達(dá)，但它不能系統(tǒng)感染整株植株，并且此病毒粒子也難以從植株組織分離提純出來(lái)。細(xì)胞定位研究證明了重組CPMV病毒粒子與細(xì)胞膜緊密結(jié)合，其中FMDV的特異序列“Arg-Gly-Asp”(“RGD”)已被其它實(shí)驗(yàn)證實(shí)具對(duì)細(xì)胞膜親和性。
本發(fā)明人在利用TMV為載體表達(dá)不同的FMDV抗原決簇的實(shí)驗(yàn)中，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)病毒粒子與細(xì)胞膜黏著的現(xiàn)象。帶有“RDG”序列的重組病毒TMV-F11有著與野生型TMV病毒幾乎一樣快的感染擴(kuò)散效率。由此可推測(cè)，單獨(dú)的“RGD”序列并不足以引起病毒顆粒對(duì)細(xì)胞膜的附著作用，還需要適當(dāng)?shù)呐詡?cè)序列或蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的參與。TMV-F20表達(dá)的肽段(20肽)中包含有TMV-F11的片段(11肽)，但TMV-F20感染植株后的花葉癥狀延遲出現(xiàn)。此現(xiàn)象可能是由于重組病毒在植株內(nèi)擴(kuò)散速度較低而使得感染癥狀推遲。為了確定其原因，采用RT-PCR和Western對(duì)感染植株的新生葉片進(jìn)行連續(xù)檢測(cè)。結(jié)果在新生葉片中可以檢測(cè)到大量的TMV-F11和微量的TMV-F20，而在較老的葉片中TMV-F20的表達(dá)量有明顯的增加，可見(jiàn)TMV-F20擴(kuò)散到新生葉片中速度比TMV-F11或野生TMV病毒慢得多。TMV-F11和TMV-F20同樣帶有“RGD”序列卻有著不同的感染擴(kuò)散速度，可能是較長(zhǎng)的小肽阻礙了外殼蛋白亞基之間正常的相互作用及外殼蛋白與病毒RNA之間的作用，從而影響了病毒粒子的穩(wěn)定性。外殼蛋白不僅有效地保護(hù)病毒的基因組RNA，而且對(duì)病毒的長(zhǎng)距離運(yùn)輸也起著重要作用，實(shí)驗(yàn)表明將CP基因被破壞的TMV突變體比野生型TMV的感染效率低很多。所以若插入的外源小肽片段影響了外殼蛋白的正確折疊或有效地包裝病毒粒子，會(huì)使病毒難于進(jìn)行長(zhǎng)距離運(yùn)輸；這也可以被用來(lái)解釋為何在新生葉片中僅有微量的TMV-F20而在老葉片中表達(dá)量明顯上升。當(dāng)從感染后煙草中提取純化TMV-F20病毒時(shí)，病毒顆粒很容易發(fā)生解聚也可印證這一推斷。
在豚鼠免疫試驗(yàn)中，以TMV CP融合蛋白形式表達(dá)的外源小肽顯示出良好的免疫原性。本發(fā)明的這套系統(tǒng)略加改變就可以用來(lái)表達(dá)其它各種抗原小肽。同傳統(tǒng)的大腸桿菌發(fā)酵表達(dá)系統(tǒng)相比，本發(fā)明的植物病毒表達(dá)系統(tǒng)提供了一種新的更為廉價(jià)的疫苗來(lái)源。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
序列表(1)一般信息(ⅱ)發(fā)明名稱(chēng)新型口蹄疫疫苗及其制備方法(ⅲ)序列數(shù)目17(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度159氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1MSYSITTPSQ FVFLSSAWAD PIELINLCTN ALGNQFQTQQ ARTVVQRQFS EVWKPSPQVT 60VRFPDSDFKV YRYNAVLDPL VTALLGAFDT RNRIIEVENQ ANPTTAETLD ATRRVDDATV120AIRSAINNLI VELIRGTGSY NRSSFESSSG LVWTSGPAT 159(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度11氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2PNLRGDLQVL A 11(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度14氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3PGRHKEEIVA PVKQ14(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4VPNLRGDLQV LAQKVARTLP 20(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度480bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5ATGTCTTACA GTATCACTAC TCCATCTCAG TTCGTGTTCT TGTCATCAGC GTGGGCCGAC 60CCAATAGAGT TAATTAATTT ATGTACTAAT GCCTTAGGAA ATCAGTTTCA AACACAACAA 120GCTCGAACTG TCGTTCAAAG ACAATTCAGT GAGGTGTGGA AACCTTCACC ACAAGTAACT 180GTTAGGTTCC CTGACAGTGA CTTTAAGGTG TACAGGTACA ATGCGGTATT AGACCCGCTA 240GTCACAGCAC TGTTAGGTGC ATTCGACACT AGAAATAGAA TAATAGAAGT TGAAAATCAG 300GCGAACCCCA CGACTGCCGA AACGTTAGAT GCTACTCGTA GAGTAGACGA CGCAACGGTG 360GCCATAAGGA GCGCGATAAA TAATTTAATA GTAGAATTGA TCAGAGGAAC CGGATCTTAT 420AATCGGAGCT CTTTCGAGAG CTCTTCTGGT TTGGTTTGGA CCTCTGGTCC TGCAACTTGA 480(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度34bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6GCTCGGTACC CGTAGGATCC TGACCTGCAG GCTA 34(2)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度30bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7ACGTCTGCAG TGGGCCCCTA CCGGGGGTAA 30(2)SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度51bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8GCTCGGTACC CATTAATACG ACTCACTATA GTATTTTTAC AACAATTACC A 51(2)SEQ ID NO:9的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度30bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9TATCCATAAT CACCAAACTA AACTAGGAAT 30(2)SEQ ID NO:10的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10GGTCGGCGGA GCCGCCGTGA 20(2)SEQ ID NO:11的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度45bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:11GTGCGTGGTG ACCTGCAGGT ACTTGCTGGT CCTGCAACTT GAGGT 45(2)SEQ ID NO:12的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度46bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:12ACCTGCAGGT CACCACGCAC GTTTGGAGAG GTCCAAACCA AACCAG 46(2)SEQ ID NO:13的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度51bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:13CAAAAGATCG TTGCTCCAGT TAAACAGACT CTTGGTCCTG CAACTTGAGG T 51(2)SEQ ID NO:14的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度50bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:14TTCTGGAGCA ACGATCTTTT GCTTATGTCT AGAGGTCCAA ACCAAACCAG 50(2)SEQ ID NO:15的信息(ⅰ)序列特征
(A)長(zhǎng)度59bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:15CTGAGCCAAA ACTTGTAAAT CTCCTCTTAA ATTTGGAACA GAGGTCCAAA GGAAAGGAG 59(2)SEQ ID NO:16的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度55bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:16ATTTACAAGT TTTGGCTCAG AAAGTTGCTA GAACTTTACC AGGTCCTGCA ACTTG 55(2)SEQ ID NO:17的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度213氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:17TTSAGESADP VTTTVENYGG ETQIQRRQHT DVSFIMDRFV KVTPQNQINI LDLMQIPSHT 60LVGALLRAST YYFSDLEIAV KHEGDLTWVP NGAPEKALDN TTNPTAYHKA PLTRLALPYT 120APHRVLATVY NGECRYNRNA VPNLRGDLQV LAQKVARTLP TSFNYGAIKA TRVTELLYRM 180KRAETYCPRP LLAIHPTEAR HKQKIVAPVK QTL 21權(quán)利要求
1．一種煙草花葉病毒外殼蛋白的融合蛋白，其特征在于，在外殼蛋白的第155-156位氨基酸之間插入有長(zhǎng)度為10-20個(gè)氨基酸的口蹄疫病毒特異性表位。
2．如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，該外殼蛋白的序列為SEQ ID NO:1。
3．如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，該口蹄疫病毒特異性表位的長(zhǎng)度為11-14個(gè)氨基酸。
4．如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，該口蹄疫病毒特異性表位選自下組SEQ ID NO:2、3和4。
5．一種分離的DNA分子，其特征在于，它含有編碼權(quán)利要求1所述的融合蛋白的核苷酸序列。
6．如權(quán)利要求5所述的DNA序列，其特征在于，該DNA編碼的融合蛋白在外殼蛋白的第155-156位氨基酸之間插入有選自下組的口蹄疫病毒特異性表位SEQ ID NO:2、3和4。
7．一種表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于，它含有權(quán)利要求5的DNA。
8．一種宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求7所述的表達(dá)質(zhì)粒。
9．一種產(chǎn)生煙草花葉病毒外殼蛋白的融合蛋白方法，其特征在于，它包括權(quán)利要求7所述的表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄和包裝，形成重組的煙草花葉病毒，該重組的煙草花葉病毒含有編碼該融合蛋白的編碼序列，其中在外殼蛋白的第155-156位氨基酸之間插入有長(zhǎng)度為10-20個(gè)氨基酸的口蹄疫病毒特異性表位；用該重組的煙草花葉病毒感染煙草；在感染2周后，從煙草葉中分離出該融合蛋白。
10．一種口蹄疫疫苗制劑，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的融合蛋白。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的含口蹄疫病毒抗原小肽的融合蛋白及其編碼序列,以及這些融合蛋白在口蹄疫的診斷和預(yù)防上的用途。本發(fā)明還提供了含這些新型融合蛋白的口蹄疫疫苗及其制備方法。
文檔編號(hào)C12N5/12GK1307000SQ0011149
公開(kāi)日2001年8月8日 申請(qǐng)日期2000年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月24日
發(fā)明者許政, 張慶琪, 朱慧慧, 吳立剛 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海植物生理研究所