專利名稱：口蹄疫疫苗制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及動物疫苗的制備方法，特別是口蹄疫疫苗的制備方法。
背景技術：
口蹄疫作為國際獸醫(yī)局規(guī)定的A類動物流行病，口蹄疫疫苗的研究一直受到國內(nèi)外的研究人員關注。國外目前采用懸浮培養(yǎng)技術培養(yǎng)細胞和病毒，其優(yōu)點在于自動化程度高、質量穩(wěn)定性較高。其缺點在于這種培養(yǎng)病毒的方式病毒含量低，必須經(jīng)過超濾濃縮才能用于疫苗生產(chǎn)，這極大地限制了疫苗的產(chǎn)量。這種生產(chǎn)僅適用于疫苗儲備和小量免疫需要，不適合我國對口蹄疫免疫的大量需要，并且生產(chǎn)設備和工藝成本很高，其產(chǎn)品價格使我國政府和用戶都難以接受。國內(nèi)某研究所在本領域探索了多年，并在前進口了相應的設備，至今不得不棄用，而仍使用目前的傳統(tǒng)方法生產(chǎn)口蹄疫疫苗。
國內(nèi)目前普遍采用傳統(tǒng)的單層細胞培養(yǎng)病毒，其優(yōu)點是無須國外的超濾濃縮工藝，其培養(yǎng)的病毒含量就可以達到制備單價疫苗的要求，適合國內(nèi)的超大規(guī)模生產(chǎn)的要求。申請人發(fā)明的93114885.5發(fā)明專利“口蹄疫疫苗的生產(chǎn)工藝”，通過濃縮培養(yǎng)病毒使單價疫苗的效力大幅提高，目前在國內(nèi)廣泛應用(國家科技發(fā)明二等獎)。其缺點是其僅適合做單價疫苗，做多價疫苗則仍需進一步濃縮病毒，否則只有提高使用劑量，這將加大疫苗的副反應和增加使用難度。如進一步濃縮培養(yǎng)來濃縮病毒則會遇到培養(yǎng)基營養(yǎng)不足和細胞新陳代謝造成酸度增加，從而使合成出來的病毒大量降解，這不但沒有達到濃縮的目的，反而使有效病毒含量越來越少。因此解決營養(yǎng)問題和酸度問題是超濃縮培養(yǎng)的關鍵。同時國內(nèi)目前使用的佐劑劑型是雙相油佐劑，它便于吸收，免疫應答較快，但免疫效力并不高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在解決上述技術問題，提供一種免疫力高，成本低廉的口蹄疫疫苗制備方法。
本發(fā)明的上述發(fā)明目的是通過如下技術方案實現(xiàn)的。
本發(fā)明所提供的口蹄疫疫苗制備方法，包括細胞培養(yǎng)、病毒繁殖和疫苗制備工藝，其中傳統(tǒng)技術通過轉瓶培養(yǎng)單層細胞，轉速10-12轉/小時，單層細胞長滿后接入病毒和病毒培養(yǎng)液。其中以體積計種毒按病毒培養(yǎng)液的1～5％加入，病毒培養(yǎng)液主要包括水解乳蛋白溶液85～90％，抗生素0.5～2％，氨基酸溶液5～10％，3％谷氨酰胺溶液1％，加HEPES0.5～0.8％，加堿溶液調(diào)pH至7.5±0.1；水解乳蛋白溶液用緩沖液配置，含有水解乳蛋白0.4～0.5％，病毒培養(yǎng)液還包括犢牛血清1～2％。加入NaOH和或加NaHCO3，用8.8％的NaHCO3溶液微調(diào)pH至7.5±0.1；轉瓶中病毒培養(yǎng)液加入量為200-400ml/15立升瓶，提高轉瓶轉速至16±1轉/小時，避免細胞處于干旱狀態(tài)。出現(xiàn)細胞致病作用(Cytopathogenic effect，CPE)后，收獲病毒液，置-20℃保存。測定病毒效價，乳鼠測定LD50＞107.5LD50/0.2ml，細胞測定TCID50＞108.5TCID50/0.2ml，采用振動膜除細胞碎片機除去細胞碎片，BEI滅活病毒；將按上述方法培養(yǎng)的各型(O、A、AsiaI)合格病毒液(達到上述測定標準)混合制備疫苗抗原。
其中各型病毒液混合制備疫苗時，二價苗的比例為1∶1～3，三價苗的比例為1∶1～3∶1～3。其中病毒液pH值為7.5±0.1。
其中疫苗配制雙相佐劑采用法國SEPPIC的ISA206佐劑，佐劑與混合抗原(O、AsiaI或O、A、AsiaI)比例為1∶1。疫苗配制單相佐劑采用礦物白油與司本80混合制成的單項佐劑或者法國SEPPIC的50V，與混合抗原的配比為1∶1。
本發(fā)明同現(xiàn)有技術相比具有如下優(yōu)點本發(fā)明所提供的口蹄疫疫苗制備方法不限制使用的病毒株，不同的毒株通過調(diào)整配比都可以達到預期效果。而目前的現(xiàn)有技術都嚴格限制使用的毒株。因為毒株的免疫原性不同，對免疫原性不好的毒株唯一可以改變其免疫效力的辦法就是增加抗原含量。由于本方法有效地增加了病毒濃度，因此可以通過調(diào)整配比解決有些毒株免疫原性不好的問題；本發(fā)明所提供的口蹄疫制備方法中病毒及其培養(yǎng)液的接入量為200-400ml/瓶(15000ml容積細胞瓶)，比93114885.5發(fā)明專利接入量(500ml/瓶)更少。培養(yǎng)液成份中采用更強的緩沖劑HEPES。因為在培養(yǎng)液很少的情況下普通培養(yǎng)液中的緩沖體系不能抵抗細胞新陳代謝產(chǎn)生的酸性而使pH迅速下降，pH的下降將會迅速裂解口蹄疫病毒，而HEPES是很強的緩沖劑，可以解決這一問題；現(xiàn)有技術不使用氨基酸溶液和犢牛血清，但在培養(yǎng)液很少的情況下營養(yǎng)不足以供給病毒合成之用，因此必須補充營養(yǎng)才能保證病毒合成的數(shù)量。通過以上改變，可使病毒合成數(shù)量較現(xiàn)有方法(93114885.5發(fā)明專利)明顯提高。發(fā)明人做口蹄疫病毒蛋白電泳分析時發(fā)現(xiàn)，采用本發(fā)明所提供的口蹄疫疫苗制備方法培養(yǎng)的病毒，其電泳帶較原方法有明顯增粗，這說明了病毒數(shù)量有明顯增加。而傳統(tǒng)的生物學方法對病毒的測定是10倍梯度稀釋，加之生物本身的敏感差異，使得難以穩(wěn)定測定出病毒數(shù)量的增加。
本發(fā)明所提供的口蹄疫制備方法制備的單相佐劑較雙相佐劑有點粘稠，但免疫效力可成倍增加，在口蹄疫O型上的試驗表明，雙相佐劑測定免疫劑量為1.32PD50/ml，單相佐劑測定免疫劑量為15.582PD50/ml，因此可見，單相佐劑的使用可有效減少免疫使用劑量。
同時，本發(fā)明所提供的口蹄疫制備方法與現(xiàn)有技術相比，因為超濃縮培養(yǎng)已達到了濃縮目的無須超濾濃縮，所以便于超大規(guī)模生產(chǎn)。適應于制備二價至三價疫苗，可同時防二至三個型的口蹄疫。因為高濃度病毒的存在使得其有能力混配更多的抗原而不影響其免疫效力。不限制毒株的使用，不同毒株只須調(diào)整配比都可達到預期的免疫效力。因為本方法有效地增加了病毒濃度，因此可以通過調(diào)整配比解決有些毒株免疫原性不好的問題，即使在制備多價口蹄疫疫苗時需要有多型口蹄疫病毒抗原混合，但使用劑量仍然可以很小。1ml/頭劑即可達到國際普通免疫需要(＞3PD50/頭劑)，2ml/頭劑即可達到國際應急免疫需要(＞6PD50/頭劑)。這是因為通過病毒濃縮有效縮小了有效免疫劑量，同時高強度的單相佐劑確保了免疫效力。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發(fā)明進一步詳細說明，這些實施例并非限制本發(fā)明的保護范圍，所有基于本發(fā)明基本思想的修改和變動都屬于本發(fā)明的保護范圍。
制備各型抗原1.培養(yǎng)O型抗原傳統(tǒng)技術通過轉瓶培養(yǎng)單層細胞，轉速10-12轉/小時，單層細胞長滿后接入種毒和病毒培養(yǎng)液，其中種毒按病毒培養(yǎng)液的1％加入，病毒培養(yǎng)液為水解乳蛋白溶液90％，抗生素2％，氨基酸溶液5％，犢牛血清1％，3％的谷氨酰胺溶液1％，加HEPES 0.5％，加NaOH 0.05％，加NaHCO30.45％，用8.8％的NaHCO3溶液微調(diào)pH至7.5±0.1；轉瓶中病毒培養(yǎng)液加入量為200ml/15立升瓶，提高轉瓶轉速至16±1轉/小時，避免細胞處于干旱狀態(tài)。出現(xiàn)CPE后收獲病毒液，置-20℃保存。測定病毒LD50＞107.5LD50/0.2ml或病毒TCID50＞108.5/0.2ml。融化后采用振動膜除細胞碎片機除去細胞碎片，BEI滅活病毒。
2.培養(yǎng)A型抗原傳統(tǒng)技術通過轉瓶培養(yǎng)單層細胞，轉速10-12轉/小時，單層細胞長滿后接入種毒和病毒培養(yǎng)液，其中種毒按病毒培養(yǎng)液的3％加入，病毒培養(yǎng)液為水解乳蛋白溶液87％，抗生素0.5％，氨基酸溶液8.5％，犢牛血清2％，3％谷氨酰胺溶液1％，加HEPES 0.8％，加NaOH 0.03％，NaHCO30.17％，用8.8％的NaHCO3溶液微調(diào)pH至7.5±0.1；轉瓶中病毒培養(yǎng)液加入量為300ml/15立升瓶，提高轉瓶轉速至16±1轉/小時，避免細胞處于干旱狀態(tài)。出現(xiàn)CPE后收獲病毒液，置-20℃保存。測定病毒LD50＞107.5LD50/0.2ml或病毒TCID50＞108.5/0.2ml。融化后采用振動膜除細胞碎片機除去細胞碎片，BEI滅活病毒。
3.培養(yǎng)AsiaI型抗原傳統(tǒng)技術通過轉瓶培養(yǎng)單層細胞，轉速10-12轉/小時，單層細胞長滿后接入種毒和病毒培養(yǎng)液，其中種毒按病毒培養(yǎng)液的5％加入，病毒培養(yǎng)液為水解乳蛋白溶液85％，抗生素1％，氨基酸溶液10％，犢牛血清2％，3％谷氨酰胺溶液1％，加HEPES 0.6％，加NaOH 0.04％，加NaHCO30.36％，用8.8％的NaHCO3溶液微調(diào)pH至7.5±0.1；轉瓶中病毒培養(yǎng)液加入量為400ml/15立升瓶，提高轉瓶轉速至16±1轉/小時，避免細胞處于干旱狀態(tài)。出現(xiàn)CPE后收獲病毒液，置-20℃保存。測定病毒LD50＞107.5LD50/0.2ml或病毒TCID50＞108.5/0.2ml。融化后采用振動膜除細胞碎片機除去細胞碎片，BEI滅活病毒。
制備疫苗采用常規(guī)方法制備如下疫苗。
1.雙相佐劑型，佐劑為法國SEPPIC的ISA206，抗原為例1.3.制備的各型抗原按1∶1比例的混合物，佐劑與抗原比例為1∶1。
2.雙相佐劑型，佐劑為法國SEPPIC的ISA206，抗原為例1.2.3制備的各型抗原按1∶1∶1比例的混合物，佐劑與抗原比例為1∶1。
3.單相佐劑型，佐劑為法國SEPPIC的50V，抗原為例1.3制備的各型抗原按1∶3比例的混合物，佐劑與抗原比例為1∶1。
4.單相佐劑型，佐劑為90％的礦物白油與10％的司本80混合制得佐劑，抗原為例1.2.3制備的各型抗原按1∶3∶3比例的混合物，佐劑與抗原比例為1∶1。
5.單相佐劑型，佐劑為95％的礦物白油與5％的司本80混合制得佐劑，抗原為例1.2.3制備的各型抗原按1∶3∶3比例的混合物，佐劑與抗原比例為1∶1。
傳統(tǒng)方法進行成品檢驗用至少6月齡的健康易感牛(各型中和抗體≤1∶4)，每一型的檢驗用牛15頭，分為3組，每組5頭。將待檢疫苗分為1頭份、1/3頭份、1/9頭份3個劑量組，每一劑量組分別于頸部肌肉注射5頭牛，接種28日后，連同條件相同的對照牛2頭，每頭牛舌上表面皮兩側分兩點皮內(nèi)注射?？谔阋逴型或亞I型或A型病毒強毒，每點0.1ml(共0.2ml含10000ID50)。連續(xù)觀察14日，對照牛均應至少1蹄出現(xiàn)水泡或潰瘍，免疫牛僅在舌面出現(xiàn)水泡或潰瘍，而其它部位無病變時判為保護。除舌面以外任一部位出現(xiàn)典型口蹄疫水泡或潰瘍判為不保護。根據(jù)免疫牛的保護數(shù)，按Reed-Muench法計算被檢疫苗的PD50。每頭份疫苗(按2ml計)應至少含6PD50。
權利要求
1.一種口蹄疫疫苗制備方法，包括細胞培養(yǎng)、病毒繁殖和疫苗制備工藝，其特征在于單層細胞長滿后接入種毒和病毒培養(yǎng)液，其中以體積計種毒接入量為病毒培養(yǎng)液的1～5％；病毒培養(yǎng)液主要包括水解乳蛋白溶液85～90％，抗生素0.5～2％，氨基酸溶液5～10％，3％的谷氨酰胺溶液1％，加HEPES0.5～0.8％，加堿溶液調(diào)pH至7.5±0.1；轉瓶中病毒培養(yǎng)液加入量為200-400ml/15立升瓶，出現(xiàn)細胞致病作用后，收獲病毒液，置-20℃保存。測定病毒LD50＞107.5LD50/0.2ml，病毒TCID50＞108.5TCID50/0.2ml，融化后采用振動膜除細胞碎片機除去細胞碎片，BEI滅活病毒；將培養(yǎng)的各型合格病毒液混合制備疫苗。
2.根據(jù)權利要求1所述的口蹄疫疫苗制備方法，其中各型病毒液混合制備疫苗時，二價苗的比例為1∶1～3，三價苗的比例為1∶1～3∶1～3。
3.根據(jù)權利要求1所述的口蹄疫疫苗制備方法，其中種毒接入量為1～5％。
4.根據(jù)權利要求1所述的口蹄疫疫苗制備方法，其中病毒培養(yǎng)液還包括犢牛血清1～2％。
5.根據(jù)權利要求1所述的口蹄疫疫苗制備方法，其中所述堿溶液為NaOH和/或NaHCO3。
6.根據(jù)權利要求1所述的口蹄疫疫苗制備方法，其中接入病毒和病毒培養(yǎng)液后轉瓶轉速為16±1轉/小時。
7.根據(jù)權利要求1所述的口蹄疫疫苗制備方法，其中疫苗配制采用單相佐劑型，佐劑與抗原配比為1∶1。
8.根據(jù)權利要求7所述的口蹄疫疫苗制備方法，其中所述單項佐劑為法國SEPPIC的50V。
9.根據(jù)權利要求1所述的口蹄疫疫苗制備方法，其中疫苗配制采用雙相佐劑型，佐劑為法國SEPPIC的ISA206，佐劑與混合抗原比例為1∶1。
全文摘要
本發(fā)明提供一種口蹄疫疫苗制備方法，包括細胞培養(yǎng)、病毒繁殖和疫苗制備工藝。單層細胞長滿后接入種毒和病毒培養(yǎng)液，其中種毒使用量按病毒培養(yǎng)液的1～5％，病毒培養(yǎng)液主要包括水解乳蛋白溶液85～90％，抗生素0.5～2％，氨基酸溶液5～10％， 3％的谷氨酰胺溶液1％，加HEPES0.5～0.8％，加堿溶液調(diào)pH至7.5±0.1；滅活病毒后混合制備疫苗，其中二價苗抗原比例為1∶1～3，三價苗抗原比例為1∶1～3∶1～3；雙相佐劑型疫苗，佐劑為法國SEPPIC的ISA206，佐劑與混合抗原的比例為1∶1；單相佐劑型疫苗，佐劑為法國SEPPIC的50V，佐劑與混合抗原的配比為1∶1。本發(fā)明便于超大規(guī)模生產(chǎn)，適于制備多價疫苗，不限制毒株使用，縮小劑量，同時確保免疫效力。
文檔編號A61P31/00GK1736480SQ20051008434
公開日2006年2月22日 申請日期2005年7月15日 優(yōu)先權日2005年6月9日
發(fā)明者薛景山 申請人:薛景山