本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種酸性蛋白酶在制備抑制病原菌制劑中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

灰葡萄孢是一種寄主范圍很廣的壞死營(yíng)養(yǎng)型病原真菌，能夠引起200多種水果、蔬菜及花卉灰霉病。其在空氣中廣泛分布，近年來(lái)危害越來(lái)越大，作物減產(chǎn)率可達(dá)60％?；移咸焰卟粌H能夠侵染田間作物，同樣會(huì)給植物的采后階段造成巨大損失，在所有貯藏發(fā)生的病害中，它所造成的損失最為嚴(yán)重。

立枯絲核菌是一種寄主范圍很廣的土傳病原真菌，可引起水稻、小麥、棉花和多種蔬菜瓜果等的病害。目前它的分布相當(dāng)普遍廣泛，已經(jīng)變成了一種世界性病害，它導(dǎo)致作物結(jié)實(shí)率下降，粒重降低，減產(chǎn)最高可達(dá)50％，是作物高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的重大障礙之一。

黃曲霉在自然環(huán)境中是一種很常見(jiàn)的霉菌，多存在于花生、玉米、大米和小麥等糧食和糧制品中，會(huì)引起糧食飼料的儲(chǔ)存問(wèn)題。它也是一種動(dòng)物的病原菌，會(huì)造成肺的曲菌癥，有時(shí)候也會(huì)引起角膜、耳與鼻眼框的感染。黃曲霉產(chǎn)生的黃曲霉毒素是一類致癌物，有劇烈毒性。黃曲霉對(duì)食品造成很大的污染，對(duì)動(dòng)物健康有很大危害。

煙曲霉是曲霉菌屬中致病性最強(qiáng)的霉菌，廣泛存在于土壤、糧食、污染的食品和霉腐物中，是引起人、畜和禽類的肺曲霉病及其他疾病的重要致病真菌，也能侵染棉鈴和蘋果等，引起果實(shí)腐爛。

卷枝毛霉屬于條件致病菌，可以破壞食品的營(yíng)養(yǎng)成分，導(dǎo)致食用者胃腸道疾病的發(fā)生和通過(guò)免疫功能低下患者呼吸道、消化道和皮膚等進(jìn)入人體引起感染而引起致命性的真菌感染毛霉菌病。

哈茨木霉是一種存在于幾乎所有土壤中的木霉屬真菌，它們易于定殖植物根，一些菌株具有根際活性，即能夠在根發(fā)育時(shí)在根上生長(zhǎng)。同時(shí)哈茨木霉也會(huì)通過(guò)攻擊，寄生其他真菌等方式來(lái)獲得營(yíng)養(yǎng)。經(jīng)過(guò)多年的進(jìn)化，它們已經(jīng)發(fā)展出用于其它真菌的攻擊和用于增強(qiáng)植物和根生長(zhǎng)的許多機(jī)制。作為一種經(jīng)濟(jì)有效、安全可持續(xù)的菌劑，哈茨木霉也用作殺真菌劑，是目前廣泛應(yīng)用于植物真菌病生物防治的一個(gè)最重要生防菌，其抑菌的作用機(jī)制和應(yīng)用研究已經(jīng)備受關(guān)注。它用于葉面施用，種子處理和土壤處理以抑制各種引起疾病的真菌病原體的生長(zhǎng)。目前市場(chǎng)上商業(yè)生物技術(shù)產(chǎn)品如3Tac、T-22、G-41等已經(jīng)用于治療葡萄孢屬，鐮孢屬和青霉屬引起的真菌性土傳病害。目前的研究推測(cè)哈茨木霉的抑菌機(jī)制有競(jìng)爭(zhēng)、重寄生、抗生素和刺激宿主免疫等，其中又以重寄生作用最具研究意義。目前其重寄生的機(jī)制的研究并不十分清晰，大多數(shù)科學(xué)家推測(cè)其分泌的幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶及蛋白酶等能破壞病原真菌細(xì)胞壁，而使其根植在真菌上重寄生。

在研究哈茨木霉重寄生作用的機(jī)制研究中，2005年Suarez的研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加灰葡萄孢提取的細(xì)胞壁組分后，哈茨木霉分泌蛋白2D電泳中，可見(jiàn)多種蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)，蛋白酶P6281就是其中之一。隨后她通過(guò)質(zhì)譜獲得這個(gè)蛋白酶部分序列，再通過(guò)PCR獲得該基因的全長(zhǎng)，然后根據(jù)蛋白質(zhì)序列分析獲得P6281的理論分子量、等電點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)或活性中心等信息。2007年Suarez對(duì)哈茨木霉EST序列中發(fā)現(xiàn)了61種蛋白酶，其中也包含了P6281。2009年Samolski通過(guò)microarray芯片也發(fā)現(xiàn)在添加幾丁質(zhì)的培養(yǎng)基中，哈茨木霉也有大量基因表達(dá)上調(diào)，其中也有p6281。2013年Szabo也報(bào)道了在線蟲卵上寄生的哈茨木霉中該基因的表達(dá)。由此可見(jiàn)P6281可能是哈茨木霉寄生其他真菌和線蟲卵過(guò)程中的一個(gè)重要蛋白酶。然而到目前為止，尚未有人分離純化過(guò)哈茨木霉的P6281蛋白酶，對(duì)其性質(zhì)并沒(méi)有清楚的研究，也尚未有該蛋白酶有抑制真菌生長(zhǎng)的直接證據(jù)，也從未有人將其直接應(yīng)用于抑菌。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種酸性蛋白酶在制備抑制病原菌制劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明以哈茨木霉為來(lái)源，采用了基因工程的技術(shù)方法，從木霉中獲得酸性蛋白酶基因p6281，構(gòu)建重組質(zhì)粒，然后在畢赤酵母中重組表達(dá)，通過(guò)親和層析和分子篩層析對(duì)發(fā)酵液中的酸性蛋白酶組分進(jìn)行純化，首次成功表達(dá)純化得到了可在制備抑制病原菌制劑中的應(yīng)用的哈茨木霉酸性蛋白酶P6281。

本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種酸性蛋白酶在制備抑制病原菌制劑中的應(yīng)用，所述的酸性蛋白酶為蛋白酶P6281。

所述的病原菌優(yōu)選為植物病原菌、動(dòng)物病原菌和條件致病菌中的一種或至少兩種。

所述的植物病原菌優(yōu)選為灰葡萄孢和/或立枯絲核菌。

所述的動(dòng)物病原菌優(yōu)選為黃曲霉和/或煙曲霉。

所述的條件致病菌優(yōu)選為卷枝毛霉。

所述的抑制病原菌制劑用于果蔬保鮮。

所述的果蔬優(yōu)選為蘋果、桔子和黃瓜中的一種或至少兩種。

所述的抑制病原菌制劑用于果蔬保鮮的方式優(yōu)選為注射、噴灑、擦涂、浸泡。

所述的抑制病原菌制劑在生物防治領(lǐng)域中的應(yīng)用。

所述的生物防治優(yōu)選為植物病原菌的生物防治。

所述的抑制病原菌制劑在農(nóng)作物儲(chǔ)存防霉領(lǐng)域中的應(yīng)用。

所述的蛋白酶P6281優(yōu)選通過(guò)如下步驟制備得到：克隆p6281編碼基因，并構(gòu)建可以表達(dá)P6281的菌株，表達(dá)蛋白酶P6281，純化后獲得蛋白酶P6281。

所述的蛋白酶P6281的編碼基因來(lái)源于哈茨木霉。

所述的哈茨木霉優(yōu)選為哈茨木霉GIM 3.442。

所述的菌株優(yōu)選為畢赤酵母；進(jìn)一步優(yōu)選為畢赤酵母GS115。

所述的蛋白酶P6281優(yōu)選通過(guò)如下具體步驟制備得到：

(1)培養(yǎng)哈茨木霉；

(2)提取哈茨木霉總RNA；

(3)通過(guò)RT-PCR獲得p6281編碼基因；

(4)獲取TA克隆與重組質(zhì)粒的篩選鑒定；

(5)將經(jīng)過(guò)鑒定的基因p6281轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115；

(6)酸性蛋白酶P6281的發(fā)酵誘導(dǎo)及純化；

(7)重組蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)。

本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：

1.到目前為止，尚未有人分離純化過(guò)哈茨木霉的P6281蛋白酶，更未有人將其直接用于抑菌。本發(fā)明的發(fā)明人在首次成功重組表達(dá)純化了哈茨木霉的酸性蛋白酶P6281的基礎(chǔ)上，首次驗(yàn)證了該酶對(duì)動(dòng)植物病原真菌的抑制作用，同時(shí)首次將其應(yīng)用于果蔬的保鮮中。

2.本發(fā)明首次將其應(yīng)用于果蔬的保鮮中。目前，市場(chǎng)上銷售的殺菌劑大部分為化學(xué)農(nóng)藥，都具有毒性，殘留物對(duì)人體有害；本發(fā)明所用的蛋白酶來(lái)自于哈茨木霉，無(wú)毒、安全，且不會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染。另一方面，哈茨木霉菌制劑用于田間，它定植于植物根部，直接施用于果蔬不適宜其生長(zhǎng)，而且有可能引起果蔬腐敗，使用其蛋白酶制劑則不會(huì)有這方面的顧慮。目前常用的果蔬保鮮技術(shù)有通風(fēng)庫(kù)貯藏、冷庫(kù)貯藏和薄膜保鮮等，這些技術(shù)都可以與酶制劑配合使用控制貯藏期間果蔬的灰霉病，有效控制采后腐爛。

附圖說(shuō)明

圖1是酸性蛋白酶P6281對(duì)灰葡萄孢的抑制效果照片圖。

圖2是酸性蛋白酶P6281對(duì)立枯絲核菌的抑制效果照片圖。

圖3是酸性蛋白酶P6281對(duì)黃曲霉的抑制效果照片圖。

圖4是酸性蛋白酶P6281對(duì)煙曲霉的抑制效果照片圖。

圖5是酸性蛋白酶P6281對(duì)卷枝毛霉的抑制效果照片圖。

圖6是酸性蛋白酶P6281對(duì)灰葡萄孢引起的蘋果灰霉病的抑制效果照片圖。

圖7是酸性蛋白酶P6281對(duì)灰葡萄孢引起的桔子灰霉病的抑制效果照片圖。

圖8是酸性蛋白酶P6281對(duì)灰葡萄孢引起的黃瓜灰霉病的抑制效果照片圖。

圖9是重組表達(dá)載體pPIC9BM-p6281的質(zhì)粒圖譜圖。

圖10是實(shí)施例3制得的重組蛋白的SDS-PAGE凝膠電泳圖；其中，M表示標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白，泳道1是經(jīng)過(guò)4天發(fā)酵誘導(dǎo)后得到的粗酶液，泳道2是經(jīng)過(guò)5天發(fā)酵誘導(dǎo)后純化后的樣品，泳道3是經(jīng)過(guò)5天發(fā)酵誘導(dǎo)的粗酶液，泳道4是經(jīng)過(guò)5天誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化空載體的畢赤酵母上清液。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

實(shí)施例1酸性蛋白酶P6281抗病原真菌效果實(shí)驗(yàn)

本實(shí)施例中所涉及的灰葡萄孢、立枯絲核菌、黃曲霉、煙曲霉和卷枝毛霉分別為灰葡萄孢GIM3.47、立枯絲核菌GIM3.512、煙曲霉GIM3.20、卷枝毛霉GIM3.79，均購(gòu)自廣東省微生物菌種保藏中心；黃曲霉GIM3.493，購(gòu)自中科院微生物所。

(1)分別將-80℃保存的植物病原菌灰葡萄孢和立枯絲核菌，動(dòng)植物病原菌黃曲霉、煙曲霉和條件致病菌卷枝毛霉分別接種到PDA平板上，25℃培養(yǎng)5天；

(2)用接種環(huán)挑取直徑4mm的菌絲體分別接種至含有10％培養(yǎng)基體積的蛋白酶P6281純酶液(2mL)的PDA培養(yǎng)基(實(shí)驗(yàn)組)及含有培養(yǎng)基10％體積的已經(jīng)沸水浴10分鐘滅活的蛋白酶P6281純酶液的PDA培養(yǎng)基(對(duì)照組)中心，培養(yǎng)數(shù)天，觀察并記錄病原菌生長(zhǎng)的半徑大小并對(duì)照，即可得到酸性蛋白酶P6281的抗菌效果。抑制率的計(jì)算公式為：

抑制率(％)＝(R-r)/R，

其中R為含有10％體積滅活純酶液的PDA培養(yǎng)基中致病菌生長(zhǎng)的半徑，r為含有10％體積純酶液的PDA培養(yǎng)基中致病菌生長(zhǎng)的半徑。

結(jié)果如附圖1～5所示，各圖中左邊均為含有10％培養(yǎng)基體積的P6281純酶液+病原菌的實(shí)驗(yàn)組的情況，右邊均為對(duì)照組的情況，測(cè)得抑菌結(jié)果分別為：圖1為處理后培養(yǎng)3天的灰葡萄孢生長(zhǎng)狀況，測(cè)到抑制率為60.2％；圖2為處理后培養(yǎng)7天的立枯絲核菌生長(zhǎng)狀況，測(cè)得抑制率為36.4％；圖3為處理后培養(yǎng)4天的黃曲霉生長(zhǎng)狀況，測(cè)得抑制率為27.3％；圖4為處理后培養(yǎng)3天的煙曲霉的生長(zhǎng)狀況，測(cè)得抑制率為27.3％；圖5為處理后培養(yǎng)3天的卷枝毛霉生長(zhǎng)狀況，測(cè)得抑制率為31.7％。

該結(jié)果表明，蛋白酶P6281對(duì)以上動(dòng)植物病原真菌的生長(zhǎng)具有顯著的抑制效果，提示該酶可用于植物病原菌的生物防治、果蔬保鮮、花生玉米等農(nóng)作物儲(chǔ)存中的防霉等應(yīng)用。

實(shí)施例2酸性蛋白酶P6281在水果儲(chǔ)存中的應(yīng)用

用無(wú)菌水沖洗培養(yǎng)5天灰葡萄孢的PDA平板獲得菌懸液，將等體積20μL的純酶液(含P6281蛋白酶2μg)和菌懸液(濃度約為10⁵個(gè)/mL)注射接種至用1％次氯酸鈉溶液進(jìn)行表面消毒的蘋果、桔子、黃瓜上，作為實(shí)驗(yàn)組；以接種等量菌懸液和高溫滅活酶的蘋果、桔子、黃瓜為對(duì)照組，在室溫下培養(yǎng)觀察灰霉病的發(fā)展情況。

結(jié)果如附圖6～8所示，各圖中左邊均為P6281+灰葡萄孢菌懸液的實(shí)驗(yàn)組，右邊均為對(duì)照組。圖6為培養(yǎng)4天觀察蘋果灰霉病的發(fā)展情況，記錄灰霉病病灶的發(fā)展半徑，測(cè)得對(duì)照組病灶圈平均半徑為0.76cm，實(shí)驗(yàn)組未觀察到顯著的病變。圖7為培養(yǎng)3天的桔子，對(duì)照組的桔子有明顯的病灶，半徑為1.08cm，實(shí)驗(yàn)組的桔子未觀察到顯著的病變。圖8為培養(yǎng)4天的黃瓜，對(duì)照組的黃瓜整體泛黃，接種點(diǎn)有明顯霉變，實(shí)驗(yàn)組的黃瓜未有顯著病變。以上結(jié)果表明蛋白酶P6281在果蔬保鮮中有顯著效果。

實(shí)施例3哈茨木霉酸性蛋白酶P6281的異源表達(dá)及純化

(一)哈茨木霉培養(yǎng)：

將哈茨木霉GIM 3.442(購(gòu)于廣東省微生物菌種保藏中心)接種至PDA固體培養(yǎng)基(馬鈴薯粉濾過(guò)液200mL，葡萄糖4g，硫酸鎂0.75g，磷酸二氫鉀0.75g，瓊脂粉4g)中，30℃培養(yǎng)2天。

(二)哈茨木霉總RNA提?。?/p>

(1)用高壓蒸汽滅菌后的鑷子攝取約100mg的菌絲體放入液氮預(yù)冷的研缽中，加入少量液氮，用研缽快速研磨，再加入少量液氮，繼續(xù)研磨，反復(fù)3次，直至全部菌絲體徹底變成白色粉末。

(2)向研缽中加入2mL RNAiso Plus(購(gòu)于大連寶生物工程有限公司)，盡量將粉末完全覆蓋，然后室溫靜置，直至RNAiso Plus完全融化，用研缽繼續(xù)研磨至裂解液呈透明狀。將所得的裂解液等量轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，室溫靜置5分鐘。12000rpm，4℃離心5分鐘，小心吸取上清液，移入新的離心管中(切勿吸取沉淀)。

(3)向步驟(2)中得到的上清液加入400μL氯仿，蓋緊離心管蓋，劇烈振蕩15秒。待溶液充分乳化后，再室溫靜置數(shù)分鐘后12000rpm，4℃離心15分鐘。

(4)從離心機(jī)中小心取出離心管，此時(shí)勻漿液分為三層，無(wú)色的上清液、中間的白色蛋白層和帶有顏色的下層有機(jī)相。吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中；

(5)向步驟(4)得到的上清液中加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，在室溫下靜置10分鐘后，12000rpm，4℃離心10分鐘。

(6)離心之后，試管底部有沉淀。小心棄去上清，緩慢地沿離心管壁加入1mL 75％的乙醇(切勿觸及沉淀)，輕輕上下顛倒，洗滌離心管管壁，12000rpm，4℃離心5分鐘后小心棄去乙醇。

(7)打開(kāi)離心管蓋子，倒置管子，室溫干燥沉淀5分鐘，加入20μL的RNase-free水溶解沉淀，待沉淀完全溶解后，將溶解液轉(zhuǎn)移至RNase-free離心管中，置于-80℃保存。

(三)RT-PCR克隆p6281編碼序列：

(1)把下列組分加入到一個(gè)無(wú)核酶的PCR管中：

表1 RT-PCR體系

(2)65℃保溫上述混合物5分鐘后迅速置于冰上，再加入4μL 5×First-Strand buffer，2μL 0.1M DTT，1μL 40U/mL RNase抑制劑于上述混合物中，輕輕混合并在37℃培養(yǎng)2分鐘；

(3)加入1μL反轉(zhuǎn)錄酶，輕輕混合后在37℃培養(yǎng)50分鐘；

(4)70℃培養(yǎng)15分鐘滅活反轉(zhuǎn)錄酶，置于-20℃保存；

(5)設(shè)計(jì)正向引物F(5’-CTGCGAATTCTCGCCGGTAAAGCCAAGT-3’)和反向引物R(5’-ACTTACGCGTAGCGGCGGTAGCAAAGC-3’)，下劃線的序列分別表示EcoRI酶切位點(diǎn)和MluI酶切位點(diǎn)。以上一步獲得的哈茨木霉cDNA為模板，按照以下PCR體系及程序，進(jìn)行PCR反應(yīng)獲得目的DNA片段；

表2 PCR體系

PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30秒；51℃退火30秒；72℃延伸2分鐘；32個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘；然后將產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，瓊脂糖濃度為1.5％，電泳條件為120V，25min，瓊脂糖凝膠電泳的操作過(guò)程參見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》。得到酸性蛋白酶基因條帶大小約為1100bp，使用凝膠回收試劑盒回收目的基因。

(四)TA克隆與重組質(zhì)粒的篩選鑒定

(1)高保真酶產(chǎn)物經(jīng)切膠回收后，利用Ex-taq酶進(jìn)行加A反應(yīng)，按以下體系將步驟(三)得到的目的基因片段(p6281)與pMD18-T載體(購(gòu)于大連寶生物工程有限公司)連接，連接條件16℃，2h；

表3 T載體連接體系

然后42℃熱擊70秒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞(購(gòu)買于大連寶生物工程有限公司)，涂布含有氨芐青霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，蒸餾水定容至1000mL)中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。然后使用2×Taq PCR Mix進(jìn)行菌落PCR篩選陽(yáng)性菌落，反應(yīng)體系及程序如下：

表4菌落PCR體系

菌落PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30秒；51℃退火30秒；72℃延伸1分鐘；32個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘；然后將產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，瓊脂糖濃度為1％，電泳條件為120V，25min，得到酸性蛋白酶基因條帶大小約為1100bp；

(2)挑取陽(yáng)性克隆加入到含氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基于37℃，220rpm搖床上擴(kuò)大培養(yǎng)12h。取擴(kuò)大培養(yǎng)的菌液于離心管中，送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)過(guò)測(cè)序測(cè)得克隆基因長(zhǎng)度為1107bp，測(cè)序結(jié)果如下：其核苷酸序列如SEQ ID No:3所示；

(五)基因p6281轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115：

(1)提取克隆有酸性蛋白酶基因的pMD18-T-p6281克隆載體質(zhì)粒，以之為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR體系參照前文表2，然后將產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用試劑盒純化回收。把表達(dá)載體pPIC9K(購(gòu)買于Invitrogen公司)多酶切位點(diǎn)改造，依次為BamHI，EcoRI，ApaI和MluI，并命名為pPIC9BM(圖9)。構(gòu)建載體使用RF克隆，引物為5’-GAAGCTGGATCCGAATTCCCGCTCGAGGGGCCCACGCGTCATCATCATCATC-3’(下劃線的序列分別表示EcoRI酶切位點(diǎn)和MluI酶切位點(diǎn))，反應(yīng)體系為：

表5 RF克隆體系

反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性3min；98℃變性10秒；58℃退火15秒；72℃延伸8分鐘；32個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘；產(chǎn)物測(cè)序鑒定；

使用EcoRI和MluI對(duì)回收產(chǎn)物和pPIC9BM載體按照說(shuō)明書進(jìn)行雙酶切(雙酶切體系如表6)，用普通DNA回收試劑盒對(duì)酶切后的DNA分別進(jìn)行純化回收，然后用核酸濃度檢測(cè)儀檢測(cè)DNA濃度；

表6雙酶切體系

酶切條件37℃，4h；

(2)將純化回收的蛋白酶基因片段p6281和pPIC9BM載體片斷按摩爾比為1：5的比例利用T4連接酶進(jìn)行體外連接，連接條件22℃，8h，連接體系如下表。

表7 T4連接酶連接體系

將連接后的重組質(zhì)粒42℃熱擊70秒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α菌株中。在含有的平板上挑選陽(yáng)性單菌落，提取其質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，并且對(duì)該菌株也進(jìn)行菌液和質(zhì)粒測(cè)序鑒定；對(duì)構(gòu)建成功的表達(dá)質(zhì)粒命名為pPIC9BM-p6281。

(3)采用質(zhì)粒小提試劑盒從陽(yáng)性克隆菌株的菌懸液中提取表達(dá)質(zhì)粒載體，然后對(duì)表達(dá)質(zhì)粒載體用BglII內(nèi)切酶酶切，將表達(dá)質(zhì)粒載體線性化，酶切體系如下：

表8單酶切體系

酶切之后，用回收試劑盒回收質(zhì)粒并測(cè)定濃度；

(4)制備畢赤酵母GS115感受態(tài)，具體步驟如下：

a.將-80℃凍存的畢赤酵母GS115菌株于YPD平板(胰蛋白胨20g,酵母提取物10g,葡萄糖20g，瓊脂粉20g，蒸餾水定容至1000mL)上劃線接種，30℃培養(yǎng)3天；

b.挑取畢赤酵母GS115菌株的單菌落接種至含有25mLYPD培養(yǎng)液(胰蛋白胨20g,酵母提取物10g,葡萄糖20g，蒸餾水定容至1000mL)的250mL三角瓶中，30℃、220rpm振蕩培養(yǎng)2天；

c.取1mL步驟b最終得到的菌懸液接種至另一瓶含有50mLYPD培養(yǎng)液三角瓶中，30℃、220rpm振蕩培養(yǎng)數(shù)小時(shí)，至菌懸液的OD600達(dá)到2.0；

d.將菌懸液轉(zhuǎn)移已滅菌的50mL離心管中，5000rpm，4℃離心5分鐘，去上清，用預(yù)冷的無(wú)菌水10mL將菌體重懸，然后轉(zhuǎn)移至15mL離心管中；

e.5000rpm，4℃離心5分鐘，去上清，用預(yù)冷的1M山梨醇10mL將菌體重懸，重復(fù)一次；

f.5000rpm，4℃離心5分鐘，去上清，用1mL 1M山梨醇重懸菌體，置于冰上用于電轉(zhuǎn)化；

(5)使用電轉(zhuǎn)化法把步驟(3)得到的線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母中，電擊條件為1.5kV，2mm電轉(zhuǎn)杯，10ng線性化質(zhì)粒。把電轉(zhuǎn)化后的菌液涂布MD平板，30℃培養(yǎng)2天，挑選5個(gè)單菌落分別接種YPD液體培養(yǎng)基，然后低溫裂解畢赤酵母轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，

裂解方法如下：

a.從MD平板(葡萄糖20g，YNB 13.4g，瓊脂粉20g，蒸餾水定容至1000mL)上，挑取10個(gè)畢赤酵母轉(zhuǎn)化子單菌落分別接種至2mLYPD培養(yǎng)液中，30℃，220rpm振蕩培養(yǎng)2天；

b.分別將1mL菌液轉(zhuǎn)移至離心管中，8000rpm離心2min，棄上清；

c.加入1mL TE buffer重懸菌體，8000rpm離心2min，棄上清，重復(fù)一次；

d.沸水浴30min后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱放置一個(gè)小時(shí)，然后沸水浴10min；

e.8000rpm離心2min，所得上清置于-20℃保存；

使用2×Taq PCR Mix進(jìn)行菌落PCR鑒定，反應(yīng)體系及程序參照表4；

(六)P6281的發(fā)酵誘導(dǎo)及純化：

挑選陽(yáng)性重組畢赤酵母菌株劃線MD平板，30℃培養(yǎng)2天，挑取單菌落接種于裝有50mL BMGY培養(yǎng)液(酵母提取物10g，胰蛋白胨20g，YNB 13.4g，甘油10m L，1M磷酸鉀(pH6.0)100m L，蒸餾水定容至1000mL)的三角瓶中，30℃，220rpm振蕩培養(yǎng)至OD600≈5.0。然后離心收集菌體，等量轉(zhuǎn)移菌體沉淀至裝有100mL BMMY培養(yǎng)液的三角瓶中28℃，220rpm振蕩培養(yǎng)，每24小時(shí)添加1.5％的甲醇溶液進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)4～5天。發(fā)酵液5000rpm，4℃離心10min取得上清測(cè)定酶活；采用《SB/T 10317-1999蛋白酶活力測(cè)定法》中的“福林法”測(cè)定P6281的蛋白酶活。然后使用鎳柱親和層析和Sephadex G-75柱層析純化目的蛋白，其中鎳柱親和層析上樣量為150mL，所用洗脫液為0.01M咪唑、0.5M NaCl、0.02M磷酸緩沖液(pH7.4)；Sephadex G-75柱層析上樣量為95mL，沖洗液為0.05M NaCl、0.02M磷酸緩沖液(pH6.0)。以轉(zhuǎn)化空載體pPIC9BM的GS115菌株作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照。

通過(guò)前述方法，測(cè)得本發(fā)明所得的發(fā)酵液蛋白酶活為321.8U/mL，比酶活為4373.1U/mg。通過(guò)生工生物工程(上海)股份有限公司的BCA蛋白濃度試劑盒測(cè)得純化后的蛋白酶的產(chǎn)量為116.5mg/1000mL發(fā)酵液。

Suarez等曾分別添加1％的P.ultimum，B.cinerea，R.solani細(xì)胞壁和幾丁質(zhì)作為碳源對(duì)哈茨木霉的蛋白表達(dá)進(jìn)行研究，哈茨木霉在其中添加B.cinerea細(xì)胞壁的條件下表達(dá)P6281表達(dá)量最大，但其表達(dá)的總蛋白量?jī)H為18μg/300mL(包含P6281，未純化)。由此可見(jiàn)，本發(fā)明不僅首次成功異源表達(dá)純化得到P6281，且產(chǎn)量實(shí)現(xiàn)了明顯提高。

(七)重組蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)：

利用SDS-PAGE凝膠電泳來(lái)確認(rèn)重組蛋白酶的表達(dá)情況、純度和分子質(zhì)量的大小。采用的濃縮膠濃度為12％以及分離膠濃度為5％，上樣量為20μL，以標(biāo)準(zhǔn)分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白作為Marker。SDS-PAGE凝膠電泳的操作過(guò)程參見(jiàn)《蛋白質(zhì)電泳實(shí)驗(yàn)技術(shù)》。對(duì)于發(fā)酵液樣品的制備，誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)生的重組蛋白酶的量較高，可以直接將發(fā)酵液稀釋1倍后與上樣緩沖液混勻，沸水煮沸10min后，12000rpm離心1min，上樣后進(jìn)行電泳。

粗酶液(指未經(jīng)過(guò)鎳柱親和層析和Sephadex G-75柱層析的發(fā)酵液)與純化后酶液的SDS-PAGE電泳圖如圖10所示，M表示標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白，泳道1是經(jīng)過(guò)4天發(fā)酵誘導(dǎo)后得到的粗酶液，泳道2是經(jīng)過(guò)5天發(fā)酵誘導(dǎo)后通過(guò)親和層析和分子篩層析純化的樣品，泳道3是經(jīng)過(guò)5天發(fā)酵誘導(dǎo)的粗酶液，泳道4是經(jīng)過(guò)5天誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化空載體的畢赤酵母上清液。由圖中可以看出，轉(zhuǎn)化空載體的畢赤酵母并無(wú)蛋白表達(dá)，而未經(jīng)純化的陽(yáng)性誘導(dǎo)(即泳道1和泳道3)的上清液中均有一深一淺兩個(gè)蛋白條帶，其中深色條帶大小接近40kDa，與預(yù)期結(jié)果相符；而誘導(dǎo)5天的蛋白表達(dá)量比4天要大，由泳道2可看出，經(jīng)過(guò)純化處理后只剩下單一的預(yù)期蛋白條帶，表明已經(jīng)成功獲得電泳純級(jí)別的酸性蛋白酶P6281。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 華南理工大學(xué)

<120> 一種酸性蛋白酶在制備抑制病原菌制劑中的應(yīng)用

<130> 1

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RT-PCR正向引物F

<400> 1

ctgcgaattc tcgccggtaa agccaagt 28

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RT-PCR反向引物R

<400> 2

acttacgcgt agcggcggta gcaaagc 27

<210> 3

<211> 1107

<212> DNA

<213> 哈茨木霉

<220>

<223> 哈茨木霉蛋白酶p6281目的基因

<400> 3

tcgccggtaa agccaagtgc caagactgcc gcgctatcag tgaagcgtgt ctcgaacgtc 60

aaatcattga agaatattgt ccaaaagggc caggcacgca tcaacaagat caacggcgtc 120

aaagacatcg aggccagagc tagcggccca gccaccaacg aggatgttag ctatgttgcc 180

tcggtcacta ttggtggtaa atcctgggac ctcatcgtcg acactggatc ttcaaacacg 240

tggtgtggtg ctcaaagctc atgcgagcct tcatctactg gcaagtccac gggcggttcc 300

gtccaggtca gctatggttc cggctccttc tccggcaccg agtacaagga cacagttagc 360

ttcggtggtt tgactgtcac atcacagtcg gttggagctg cccgttcatc ctctggcttt 420

tcaggtgtcg atggaattat tggctttggt ccggtggatc tcactgagga caccgtctcc 480

aacgccaaca cggttccaac cttcttggat aatctctaca gccaaggttc catctcgact 540

gaggtgctgg gcgtttcttt caagccagag tctggcagtg acagtgatga caccaacggc 600

gagttgaccc tcggcggtac tgatagctcc aagtacacgg gctctctcac ctacttctca 660

actctcaaga gtggctctgc tgctccctac tggggcatct ctattgctag tttcacctac 720

ggctcgacga ccctcgcatc gtctgcgacc ggcattgtcg acactggtac tacgctcatc 780

tacatcccca ccaaggctta caatgcattc ctgtctgccg ctggtggcaa gactgacagc 840

tcttctggcc tcgccgtctt ctcaaaagcg ccaacatcca actttgctat caagtttggc 900

tcaacgacct acaccctcac accttctcaa tacttggttc ccacctctca gtacagcttc 960

tacggactca gctctggaaa gtactacgct tggattaacg acggtggcag ctcgggtgtc 1020

aacaccatta ttggccagaa gttcctggaa aactactact ccgtttttga tactaccaac 1080

ggccgcatcg gctttgctac cgccgct 1107

<210> 4

<211> 52

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RF克隆引物

<400> 4

gaagctggat ccgaattccc gctcgagggg cccacgcgtc atcatcatca tc 52