本發(fā)明涉及蝴蝶蘭種苗繁育技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種蝴蝶蘭脫毒快繁方法。

(二)

背景技術(shù)：
：

蝴蝶蘭(Phalaenopsis spp)屬熱帶或亞熱帶的氣生蘭，又稱蝶蘭，因其姿態(tài)優(yōu)美、色澤艷麗、花期持久，素有“蘭花皇后”之美稱,是室內(nèi)綠化美化重要的觀賞花卉,國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)對(duì)其需求量大。蝴蝶蘭的病毒病是當(dāng)今困擾蘭界的一大難題。

目前，在蝴蝶蘭上分離到的病毒超過(guò)25種，其中危害最重、分布最廣的是建蘭花葉病毒(Cymbidium mosaic virus，CyMV)和齒蘭環(huán)斑病毒(Odontoglossum ringspot virus，ORSV)。感病植株主要造成花葉、壞死、畸形、花瓣變形等癥狀,導(dǎo)致植株生長(zhǎng)不良，花小而少,花期縮短,嚴(yán)重影響其觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。而國(guó)內(nèi)關(guān)于蝴蝶蘭脫毒的研究中成活率不高于30％，脫毒率不高于80％，因此，研究一種成活率高、脫毒效果好，操作簡(jiǎn)便的方法有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。

(三)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種蝴蝶蘭脫毒及快繁技術(shù)，它包括以下幾個(gè)步驟：

1)材料的選擇及初代培養(yǎng)：

選用生長(zhǎng)健壯、開(kāi)花3-5朵、經(jīng)檢測(cè)后攜帶病毒的蝴蝶蘭開(kāi)花株，切取花梗，3-5cm一節(jié)，每節(jié)包含1-2個(gè)飽滿腋芽，在超凈工作臺(tái)上用75％的酒精表面消毒30-40s，再用用0.1％的HgCl₂震蕩消毒8-10min，無(wú)菌水沖洗3-5次，用尖頭鑷剝?nèi)ヒ秆堪~，再0.1％的HgCl₂震蕩消毒2-3min，用無(wú)菌水沖洗5-8次，切除受HgCl₂毒害的兩端，接種于50mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基上先暗培養(yǎng)7-10天，后轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)2-3個(gè)月，待兩片真葉展開(kāi)形成叢生芽即可；

所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/3MS+6-BA5.0mg/L+NAA0.5mg/L+椰汁100mL/L+蔗糖20g/L+瓊脂6.0-6.5g/L，pH5.4-5.8；

光照培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)條件為：溫度25±2℃，光照強(qiáng)度為1500～2000lx，光照時(shí)長(zhǎng)8-10小時(shí)/天；

2)莖尖伸長(zhǎng)培養(yǎng)：

將步驟1)所誘導(dǎo)出的展葉的叢生芽轉(zhuǎn)入50ml促莖尖伸長(zhǎng)培養(yǎng)基，培養(yǎng)40-60天，待第三片或第四片葉成熟即可，得幼苗；

促莖尖伸長(zhǎng)培養(yǎng)基為：1/3MS+GA₃1～2mg/L+椰汁100mL/L+蔗糖20g/L+瓊脂6.0～6.5g/L，pH5.4～5.8；

培養(yǎng)條件為：溫度25±2℃，光照強(qiáng)度為1500～2000lx，光照時(shí)長(zhǎng)8～10小時(shí)/天；

3)第一次脫毒培養(yǎng)：

將步驟2)獲得的幼苗，置于10X的冷光源解剖鏡下用解剖針剝?nèi)∫粋€(gè)微凸、穹形、發(fā)亮的生長(zhǎng)點(diǎn)，迅速切下置于30mL脫毒培養(yǎng)基表面，進(jìn)行暗培養(yǎng)7-15天后轉(zhuǎn)入光培養(yǎng)2-3個(gè)月，中間可進(jìn)行1-2次轉(zhuǎn)接，防褐化死亡，每瓶培養(yǎng)基可接種3-5個(gè)含生長(zhǎng)點(diǎn)的莖尖，莖尖切取大小為1-2mm，留取1個(gè)葉原基；

脫毒培養(yǎng)基為：1/3MS+6-BA5.0mg/L+NAA0.5mg/L+5％氨基寡糖素0.2-0.3mL/L+椰汁100mL/L+蔗糖20g/L+瓊脂6.0-6.5g/L，pH5.4～5.8；

培養(yǎng)條件為：溫度25±2℃，光照強(qiáng)度為1000～1500lx，光照時(shí)長(zhǎng)8～10小時(shí)/天；

4)第二次脫毒培養(yǎng)：

將步驟3)獲得的脫毒莖尖，待其長(zhǎng)出1或2片成熟小葉后，進(jìn)行二次脫毒培養(yǎng)，10X冷光源解剖鏡下剝?nèi)?-2mm大小生長(zhǎng)點(diǎn)后，迅速接于30mL脫毒培養(yǎng)基表面，每瓶培養(yǎng)基接種3-5含生長(zhǎng)點(diǎn)的莖尖，進(jìn)行暗培養(yǎng)7-15天后轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)2-3個(gè)月，每月進(jìn)行一次轉(zhuǎn)接，更換培養(yǎng)基，防止褐化死亡。

脫毒培養(yǎng)基為：1/3MS+6-BA5.0mg/L+NAA0.5mg/L+5％氨基寡糖素0.2mL/L+椰汁100mL/L+蔗糖20g/L+瓊脂6.0-6.5g/L，pH5.4～5.8；

培養(yǎng)條件為：溫度25±2℃，光照強(qiáng)度為1000～1500lx，光照時(shí)長(zhǎng)8～10小時(shí)/天；

5)脫毒苗的增殖培養(yǎng)：

將步驟4)獲得的脫毒苗，檢測(cè)后進(jìn)行增殖培養(yǎng)，切除葉片及褐化部分接于盛100mL培養(yǎng)基的蘭花瓶，每瓶接種5株(待數(shù)量增大以后，視生產(chǎn)情況可增至21-35株/瓶)；培養(yǎng)2-3個(gè)月后，生長(zhǎng)健壯，增殖系數(shù)達(dá)2-4，即得脫毒分化苗；

增殖培養(yǎng)基為：1/3MS+6-BA5.0mg/L+NAA0.5mg/L+腺嘌呤3-5mg/L+椰汁100mL/L+蔗糖20g/L+瓊脂6.0-6.5g/L，pH5.4～5.8；

培養(yǎng)條件同1)。

6)脫毒苗的壯苗培養(yǎng)：

待步驟5)獲得的脫毒分化苗長(zhǎng)至株高2-3cm，兩葉一心后轉(zhuǎn)入盛120mL壯苗培養(yǎng)基的蘭花瓶后進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，每瓶轉(zhuǎn)接16株；培養(yǎng)45-60天后，株高達(dá)3-5cm，兩葉一心壯苗完成。

壯苗培養(yǎng)基為：1/2MS+椰汁100mL/L+蔗糖20g/L+瓊脂6.0-6.5g/L，pH5.4～5.8。

培養(yǎng)條件:溫度25±2℃，光照強(qiáng)度為1500～2000lx，光照時(shí)長(zhǎng)8～10小時(shí)/天；

7)脫毒苗的生根培養(yǎng)：

將步驟6)獲得的壯苗后植株，接于150mL生根培養(yǎng)基的蘭花瓶中進(jìn)行生根培養(yǎng)，每瓶轉(zhuǎn)接11-13株；培養(yǎng)3-4個(gè)月后，待植株長(zhǎng)至3-4片葉，根系達(dá)3條以上，健壯有活力，即可移入溫室馴化移栽。

生根培養(yǎng)基：1/2MS+NAA1.0mg/L+香蕉30g/L+土豆40g/L+蔗糖20g/L+瓊脂6.0-6.5g/L，pH5.4～5.8。

培養(yǎng)條件:溫度25±2℃，光照強(qiáng)度為1500～2000lx，光照時(shí)長(zhǎng)8～10小時(shí)/天。

本發(fā)明通過(guò)摸索初代培養(yǎng)，莖尖伸長(zhǎng)培養(yǎng)，脫毒培養(yǎng)，壯苗、生根培養(yǎng)，獲得一套利用物理方法結(jié)合化學(xué)試劑進(jìn)行二次蝴蝶蘭脫毒的方法及快繁途徑。創(chuàng)新點(diǎn)在于摸索出莖尖伸長(zhǎng)培養(yǎng)的方法、生長(zhǎng)點(diǎn)切取大小結(jié)合化學(xué)試劑提高成活率及脫毒率、二次脫毒提高脫毒率的方法，建立了蝴蝶蘭脫毒及快繁途徑。該方法具有成活率、脫毒率高的優(yōu)點(diǎn)，成活率達(dá)80.13％，脫毒率達(dá)92.67％，具有很好的技術(shù)效果和推廣前景。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

所述的蝴蝶蘭脫毒及快繁技術(shù)，具體步驟如下：

第一、選用生長(zhǎng)健壯、開(kāi)花3-5朵、經(jīng)檢測(cè)后攜帶病毒的的蝴蝶蘭開(kāi)花株，切取花梗截段3cm/節(jié)，每節(jié)1個(gè)飽滿腋芽。75％的酒精表面消毒30s，0.1％的HgCl₂震蕩消毒8min(外植體表面震蕩后無(wú)氣泡為止)，無(wú)菌水沖洗3次，用尖頭鑷剝?nèi)ヒ秆堪~，再0.1％的HgCl₂震蕩消毒3min，用無(wú)菌水沖洗5次，切除受HgCl₂毒害的兩端，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。

第二、將展葉的叢生芽，分株接于促莖尖伸長(zhǎng)培養(yǎng)基，培養(yǎng)45天后，第三片葉成熟。促莖尖伸長(zhǎng)培養(yǎng)基為：1/3MS+GA₃1.0mg/L+椰汁100mL/L+蔗糖20g/L+瓊脂6.0-6.5g/L，pH5.4-5.8。培養(yǎng)條件同1)。

第三、將幼苗切除葉片后，置于10X的冷光源解剖鏡下用解剖針剝?nèi)∏o尖，快速切下置于脫毒培養(yǎng)基表面，進(jìn)行暗培養(yǎng)7天后轉(zhuǎn)入光培養(yǎng)2個(gè)月，中間進(jìn)行1次轉(zhuǎn)接。每個(gè)培養(yǎng)基可接種4個(gè)莖尖，莖尖切取大小為1.0mm，留取1個(gè)葉原基。脫毒培養(yǎng)基為：1/3MS+6-BA5.0mg/L+NAA0.5mg/L+5％氨基寡糖素0.2mL/L+椰汁100mL/L+蔗糖20g/L+瓊脂6.0-6.5g/L，pH5.4-5.8。待長(zhǎng)出兩片葉片后，進(jìn)行二次脫毒。

第四、無(wú)毒檢測(cè)后將無(wú)毒苗進(jìn)行增殖培養(yǎng)。增殖培養(yǎng)基為：

1/3MS+6-BA5.0mg/L+NAA0.5mg/L+腺嘌呤3mg/L+椰汁100mL/L+蔗糖20g/L+瓊脂6.0-6.5g/L，pH5.4～5.8。培養(yǎng)條件同1)。

第五、待脫毒分化苗長(zhǎng)至株高2-3cm，兩葉一心后進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，壯苗培養(yǎng)基為：1/2MS+椰汁100mL/L+蔗糖20g/L+瓊脂6.0-6.5g/L，pH5.4～5.8。培養(yǎng)條件同1)。

第六、待壯苗植株長(zhǎng)至株高3-5cm，兩葉一心后進(jìn)行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)3-4個(gè)月后，植株長(zhǎng)至3-4片葉，根系達(dá)3條以上，健壯有活力，即可移入溫室馴化移栽。

實(shí)施例1中蝴蝶蘭啟動(dòng)培養(yǎng)中二次消毒成活率為89.7％，較一次性消毒成活率81％，提高10.7％。莖尖脫毒60天后，成活率達(dá)64.74％，脫毒率達(dá)94％。

實(shí)施例2

所述的蝴蝶蘭脫毒及快繁技術(shù)，具體步驟如下：

第一、選用生長(zhǎng)健壯、開(kāi)花3-5朵、檢測(cè)后攜帶病毒的的蝴蝶蘭開(kāi)花株，切取花梗截段4cm/節(jié)，每節(jié)1個(gè)飽滿腋芽。75％的酒精表面消毒30s，0.1％的HgCl₂震蕩消毒9min(外植體表面震蕩后無(wú)氣泡為止)，無(wú)菌水沖洗3次，用尖頭鑷剝?nèi)ヒ秆堪~，再0.1％的HgCl₂震蕩消毒2min，用無(wú)菌水沖洗5次，切除受HgCl₂毒害的兩端，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)。

第二、將展葉的叢生芽，分株接于促莖尖伸長(zhǎng)培養(yǎng)基，培養(yǎng)50天后，第三片葉成熟。促莖尖伸長(zhǎng)培養(yǎng)基為：1/3MS+GA₃1.5mg/L+椰汁100mL/L+蔗糖20g/L+瓊脂6.0-6.5g/L，pH5.4-5.8。培養(yǎng)條件同1)。

第三、將幼苗切除葉片后，置于10X的冷光源解剖鏡下用解剖針剝?nèi)∏o尖，快速切下置于脫毒培養(yǎng)基表面，進(jìn)行暗培養(yǎng)7天后轉(zhuǎn)入光培養(yǎng)2個(gè)月，中間進(jìn)行1次轉(zhuǎn)接。每個(gè)培養(yǎng)基可接種4個(gè)莖尖，莖尖切取大小為1.5mm，留取1個(gè)葉原基。脫毒培養(yǎng)基為：1/3MS+6-BA5.0mg/L+NAA0.5mg/L+5％氨基寡糖素0.25mL/L+椰汁100mL/L+蔗糖20g/L+瓊脂6.0-6.5g/L，pH5.4-5.8。待長(zhǎng)出兩片葉片后，進(jìn)行二次脫毒。

第四、無(wú)毒檢測(cè)后將無(wú)毒苗進(jìn)行增殖培養(yǎng)。增殖培養(yǎng)基為：

1/3MS+6-BA5.0mg/L+NAA0.5mg/L+腺嘌呤3mg/L+椰汁100mL/L+蔗糖20g/L+瓊脂6.0-6.5g/L，pH5.4～5.8。培養(yǎng)條件同1)。

第五、待脫毒分化苗長(zhǎng)至株高2-3cm，兩葉一心后進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，壯苗培養(yǎng)基為：1/2MS+椰汁100mL/L+蔗糖20g/L+瓊脂6.0-6.5g/L，pH5.4～5.8。培養(yǎng)條件同1)。

第六、待壯苗植株長(zhǎng)至株高3-5cm，兩葉一心后進(jìn)行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)3-4個(gè)月后，植株長(zhǎng)至3-4片葉，根系達(dá)3條以上，健壯有活力，即可移入溫室馴化移栽。

實(shí)施例2中蝴蝶蘭啟動(dòng)培養(yǎng)中二次消毒成活率為93％，較一次性消毒成活率81％，提高14.8％。莖尖脫毒60天后，成活率達(dá)68.74％，脫毒率達(dá)93.1％。

實(shí)施例3

所述的蝴蝶蘭脫毒及快繁技術(shù)，具體步驟如下：

第一、選用生長(zhǎng)健壯、開(kāi)花3-5朵、檢測(cè)后攜帶病毒的的蝴蝶蘭開(kāi)花株，切取花梗截段5cm/節(jié)，每節(jié)2個(gè)飽滿腋芽。75％的酒精表面消毒30s，0.1％的HgCl₂震蕩消毒10min(外植體表面震蕩后無(wú)氣泡為止)，無(wú)菌水沖洗3次，用尖頭鑷剝?nèi)ヒ秆堪~，再0.1％的HgCl₂震蕩消毒3min，用無(wú)菌水沖洗5次，切除受HgCl₂毒害的兩端，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)。

第二、將展葉的叢生芽，分株接于促莖尖伸長(zhǎng)培養(yǎng)基，培養(yǎng)50天后，第三片葉成熟。促莖尖伸長(zhǎng)培養(yǎng)基為：1/3MS+GA₃2.0mg/L+椰汁100mL/L+蔗糖20g/L+瓊脂6.0-6.5g/L，pH5.4-5.8。培養(yǎng)條件同1)。

第三、將幼苗切除葉片后，置于10X的冷光源解剖鏡下用解剖針剝?nèi)∏o尖，快速切下置于脫毒培養(yǎng)基表面，進(jìn)行暗培養(yǎng)7天后轉(zhuǎn)入光培養(yǎng)2個(gè)月，中間進(jìn)行1次轉(zhuǎn)接。每個(gè)培養(yǎng)基可接種4個(gè)莖尖，莖尖切取大小為2.0mm，留取1個(gè)葉原基。脫毒培養(yǎng)基為：1/3MS+6-BA5.0mg/L+NAA0.5mg/L+5％氨基寡糖素0.3mL/L+椰汁100mL/L+蔗糖20g/L+瓊脂6.0-6.5g/L，pH5.4-5.8。待長(zhǎng)出兩片葉片后，進(jìn)行二次脫毒。

第四、無(wú)毒檢測(cè)后將無(wú)毒苗進(jìn)行增殖培養(yǎng)。增殖培養(yǎng)基為：

1/3MS+6-BA5.0mg/L+NAA0.5mg/L+腺嘌呤3mg/L+椰汁100mL/L+蔗糖20g/L+瓊脂6.0-6.5g/L，pH5.4～5.8。培養(yǎng)條件同1)。

第五、待脫毒分化苗長(zhǎng)至株高2-3cm，兩葉一心后進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，壯苗培養(yǎng)基為：1/2MS+椰汁100mL/L+蔗糖20g/L+瓊脂6.0-6.5g/L，pH5.4～5.8。培養(yǎng)條件同1)。

第六、待壯苗植株長(zhǎng)至株高3-5cm，兩葉一心后進(jìn)行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)3-4個(gè)月后，植株長(zhǎng)至3-4片葉，根系達(dá)3條以上，健壯有活力，即可移入溫室馴化移栽。

實(shí)施例3中蝴蝶蘭啟動(dòng)培養(yǎng)中二次消毒成活率為93.2％，較一次性消毒成活率81％，提高15.1％。莖尖脫毒60天后，成活率達(dá)76.74％，脫毒率達(dá)87.3％。

結(jié)論：通過(guò)使用本發(fā)明進(jìn)行蝴蝶蘭脫毒及快繁時(shí)，在蝴蝶蘭啟動(dòng)培養(yǎng)中成活率、脫毒成活率、脫毒成功率都較高。脫毒后的蝴蝶蘭在后期養(yǎng)護(hù)過(guò)程中，發(fā)病率較低，花朵較大，花期長(zhǎng)，不易落苞，葉片褪綠、畸形現(xiàn)象改善，大大提高了其觀賞價(jià)值及經(jīng)濟(jì)價(jià)值。