本發(fā)明屬于藥用盾葉薯蕷的組培技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高效的藥用盾葉薯蕷批量化生產(chǎn)的方法。

背景技術(shù)：

薯蕷屬植物(Dioscorea)具有重要的藥用價值，其根莖皂甙元是合成避孕藥和甾體激素類藥物的重要起始原料，在醫(yī)藥工業(yè)中占有重要地位。在《中國珍稀瀕危保護植物名錄》中被列為國家級二級漸危物種而受到保護。采用植物細(xì)胞工程技術(shù)和方法進行盾葉薯蕷(salvia hispanica L)大規(guī)模組培快繁、規(guī)范化種植對于促進制藥業(yè)的發(fā)展有著重要作用。2014年提供一種藥用盾葉薯蕷一步成苗的批量化生產(chǎn)方法(授權(quán)號ZL201410288573.9)，能同步誘導(dǎo)愈傷組織、芽、不定根，增殖與生根簡化為一步完成，但是該發(fā)明方法試管苗需經(jīng)過愈傷組織培養(yǎng)階段，提高了變異率。2015年提供一種藥用盾葉薯蕷組培苗無菌短枝生根的方法(申請?zhí)?01510319287.9)，該方法解決了因薯蕷莖結(jié)構(gòu)特殊而導(dǎo)致生根困難的問題，同時無性系后代保持與母本優(yōu)良特性的高度一致，但是該發(fā)明方法單瓶試管苗中有效苗數(shù)量少(最多18株/瓶)，而且試管苗為單株，群聚效應(yīng)差，進而導(dǎo)致試管苗移栽成活率低，單株成本高。本發(fā)明以期創(chuàng)造出盾葉薯蕷高效成苗的最佳方法，建立一套高效低耗量的培養(yǎng)體系，以最快的速度將研究成果轉(zhuǎn)化為現(xiàn)實生產(chǎn)力。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種高效低耗量的盾葉薯蕷快速繁殖方法，該方法培養(yǎng)效果佳，增殖系數(shù)高，穩(wěn)定性好、生產(chǎn)成本低，是一種在最短的時間內(nèi)獲得大量試管苗的快速繁殖方法。

本發(fā)明的目的是通過以下方式實現(xiàn)的：

一種藥用盾葉薯蕷批量化生產(chǎn)的方法，包括以下步驟：

(1)基礎(chǔ)苗獲得：選擇優(yōu)良藥用盾葉薯蕷植株的莖段為外植體，外植體消毒后在其它成分含量不變，僅肌醇含量加倍的MS+6-BA0.01～0.05mg/L+多效唑3.0～10.0mg/L+矮壯素3.0～10.0mg/L瓊脂固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，誘導(dǎo)出大量小芽叢；

(2)批量化生產(chǎn)：將步驟(1)獲得的叢生芽切下來，分成5株一叢，接在其它成分含量不變，僅肌醇含量加倍的MS+NAA0.02～0.6mg/L+IAA0.02～0.6mg/L+多效唑0.5～5.0mg/L+矮壯素0.5～5.0mg/L的瓊脂固體培養(yǎng)基上進行增殖和生根；

(3)試管苗移栽：試管苗出瓶移栽前，打開瓶蓋煉苗3-5d，瓶內(nèi)的幼苗先用1000倍的多菌靈或代森錳鋅噴霧3～5次，取出清洗根部培養(yǎng)基，隨后將幼苗5株/叢移至有頂玻璃的移栽容器中，在溫度為20～30℃，濕度80～90％的條件下生長，長出新葉時，既已成活。

步驟(1)中將外植體剪成含有1節(jié)1芽的規(guī)格，首先用洗衣粉清洗干凈，在無菌操作臺上用無菌水洗5～7次，用70％酒精浸潤30秒-1分鐘，再放入0.1％的升汞溶液中滅菌12～18分鐘，無菌水沖洗5～6次，備用。

步驟(1)誘導(dǎo)出的叢芽繼代培養(yǎng)時，去老莖留新芽叢，轉(zhuǎn)入步驟(1)相同的培養(yǎng)基中，每隔28-30d繼代一次。

步驟(2)是將步驟(1)獲得的叢生芽切下來，分成5株一叢，每瓶10叢，轉(zhuǎn)入步驟(2)所述的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20d即生根，進行移栽。

步驟(1)和(2)的培養(yǎng)溫度為24±2℃，1000～2000lx弱光環(huán)境中，每天10～12小時光照培養(yǎng)。

步驟(1)優(yōu)選使用的培養(yǎng)基：其它成分含量不變，僅肌醇含量加倍的MS+6-BA 0.05mg/L+多效唑6.0mg/L+矮壯素3.0mg/L；或者優(yōu)選使用培養(yǎng)基：其它成分含量不變，僅肌醇含量加倍的MS+6-BA 0.02mg/L+多效唑4.0mg/L+矮壯素6.0mg/L。

步驟(2)優(yōu)選使用的培養(yǎng)基：其它成分含量不變，僅肌醇含量加倍的MS+NAA 0.1mg/L+IAA0.2mg/L+多效唑1.0mg/L+矮壯素2.0mg/L；或者優(yōu)選使用培養(yǎng)基：其它成分含量不變，僅肌醇含量加倍的MS+NAA 0.2mg/L+IAA 0.2mg/L+多效唑1.5mg/L+矮壯素1.0mg/L。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：

1、針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足之處，該發(fā)明方法提高了薯蕷無菌短枝培養(yǎng)效率，直接從無菌短枝葉腋處，形成芽叢，其無性系后代不經(jīng)過愈傷組織階段，能保持與母本優(yōu)良特性的高度一致性。

2、本發(fā)明根據(jù)生產(chǎn)需要設(shè)計培養(yǎng)方法，首先同步誘導(dǎo)大量小芽叢，抑制根的形成，提高增殖倍數(shù)，加快基礎(chǔ)苗的繁殖，增殖倍數(shù)達到15以上，現(xiàn)有技術(shù)一般增殖倍數(shù)在4-6之間；每瓶獲得有效苗50株以上，現(xiàn)有技術(shù)一般每瓶的有效芽在10-20之間，大大提高了培養(yǎng)效率，節(jié)約了生產(chǎn)成本。

3、高效批量化生產(chǎn)時，同步誘導(dǎo)芽叢伸長和生根，形成完整植株只需20d左右；5株一叢進行移栽，緩苗期短，移栽成活率高達100％。

4、根據(jù)前人研究的最新組培技術(shù)生產(chǎn)100萬株盾葉薯蕷組培苗，即“一步成苗法”最多形成用于生根的試管苗18株/瓶，需生產(chǎn)5.5萬瓶組培苗。本發(fā)明技術(shù)生產(chǎn)100萬株盾葉薯蕷組培苗，每瓶有效生根苗為50株以上，僅需生產(chǎn)1萬瓶基礎(chǔ)苗，2萬瓶生根苗，合計3萬瓶。本發(fā)明不僅減少了無菌操作步驟，而且節(jié)約了培養(yǎng)室空間，簡化了健康種苗生產(chǎn)程序，降低了生產(chǎn)成本，提高了生產(chǎn)效率。

附圖說明

圖1為盾葉薯蕷無菌短枝葉腋處誘導(dǎo)芽叢的生長情況；

圖2為盾葉薯蕷基礎(chǔ)苗高效增殖的生長情況；

圖3為盾葉薯蕷芽叢同步伸長和生根的生長情況；

圖4為盾葉薯蕷芽叢同步伸長和生根的根生長情況；

圖5為移栽7d的盾葉薯蕷試管苗的生長情況；

圖6為移栽40d的盾葉薯蕷試管苗的生長情況。

具體實施方式

以下結(jié)合實施例旨在進一步說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。實施例1、組織培養(yǎng)快速繁殖盾葉薯蕷

一、培養(yǎng)基配制和滅菌

初代繼代培養(yǎng)基用于基礎(chǔ)苗繁殖：MS改良(MS其它元素含量不變，僅肌醇含量加倍)+6-BA 0.05mg/L+多效唑6.0mg/L+矮壯素3.0mg/L；

伸長和生根培養(yǎng)基用于批量化生產(chǎn)：MS改良(MS其它元素含量不變，僅肌醇含量加倍)+NAA0.1mg/L+IAA0.2mg/L+多效唑1.0mg/L+矮壯素2.0mg/L；

以上培養(yǎng)基121℃下，滅菌20分鐘。

二、高效基礎(chǔ)苗繁殖

取盾葉薯蕷(salvia hispanica L)莖段，首先用洗衣粉清洗干凈，在無菌操作臺上用無菌水洗5～7次，用70％酒精浸潤1分鐘，再放入0.1％的升汞溶液中滅菌12～18分鐘，無菌水沖洗5～6次，將莖段轉(zhuǎn)入裝有初代培養(yǎng)基上塑料培養(yǎng)瓶(容量80毫升)中，每個培養(yǎng)瓶外植體個數(shù)為10個左右，在下述培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)：24℃左右，每天10小時光照，光照強度為1000～2000lx左右；莖段接種50個。培養(yǎng)2周左右，從莖段葉腋處開始形成芽點，繼續(xù)培養(yǎng)4周，100％莖段葉腋處形成15以上的芽，最高達到22個，誘導(dǎo)叢生芽生長情況如圖1所示。繼代培養(yǎng)時，將叢芽分成小塊，每隔30d繼代一次，每次繼代中，每個芽叢增殖15倍以上，叢生芽生長情況如圖2所示。這一步需要抑制根的形成，以防影響基礎(chǔ)苗的繁殖。根據(jù)生產(chǎn)規(guī)模，繁殖充足的基礎(chǔ)苗，再進行批量化生產(chǎn)。

三、高效批量化生產(chǎn)

取上述50個株系進行繼代繁殖，具體方法如下：將步驟(1)獲得的芽叢按5株一叢的規(guī)格分開，接種在培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)基為前面配制的伸長和生根培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件同前述基礎(chǔ)苗繁殖；培養(yǎng)20d左右后，每芽叢均長成4-6cm高的苗，同時從基部長出5-10條根的完整植株。叢生芽同步伸長生長和生根的苗生長情況如圖3所示；叢生芽同步伸長生長和生根的根生長情況如圖4所示。

四、試管苗移栽：

試管苗出瓶移栽前，打開瓶蓋煉苗3-5d，瓶內(nèi)的幼苗先用1000倍的多菌靈或代森錳鋅噴霧3～5分鐘，取出清洗根部培養(yǎng)基，隨后將幼苗5株/叢移至有頂玻璃的移栽容器中，在溫度為20～30℃，濕度80～90％的條件下生長，7d左右恢復(fù)生長，20d左右長出新葉，40d左右100％長出新葉。移栽7d左右的盾葉薯蕷試管苗的生長情況如圖5所示；移栽40d左右的盾葉薯蕷試管苗的生長情況如圖6所示。

本發(fā)明所提供的盾葉薯蕷組織培養(yǎng)繁殖方法，莖段為外植體，取材容易，數(shù)量大，遺傳穩(wěn)定性高，生長良好等優(yōu)勢。在初代培養(yǎng)過程中，不經(jīng)過愈傷組織階段，直接從莖段葉腋處形成叢生芽，不僅生長速度快，而且繁殖系數(shù)大。批量化生產(chǎn)階段，采用同步伸長生長和生根的方法，簡化了健康種苗生產(chǎn)程序，前人最新發(fā)明的組培技術(shù)生產(chǎn)100萬株盾葉薯蕷組培苗，即“一步成苗法”形成18株/瓶用于生根的組培苗，需生產(chǎn)5.5萬瓶組培苗。本發(fā)明技術(shù)生產(chǎn)100萬株盾葉薯蕷組培苗，每瓶有效苗為50株以上，僅需生產(chǎn)約3萬瓶繼代生根苗。本發(fā)明不僅減少了無菌操作步驟，而且節(jié)約了培養(yǎng)室空間，簡化了健康種苗生產(chǎn)程序，降低了生產(chǎn)成本，提高了生產(chǎn)效率。本發(fā)明不僅高效增殖，增殖倍數(shù)達到15以上，有效苗達到50株/瓶，而且叢芽移栽，群聚效應(yīng)強，成活率高達100％。

實施例2、組織培養(yǎng)快速繁殖盾葉薯蕷

一、培養(yǎng)基配制和滅菌

初代繼代培養(yǎng)基：MS改良(MS其它元素含量不變，僅肌醇含量加倍)+6-BA0.02mg/L+多效唑4.0mg/L+矮壯素6.0mg/L；

伸長和生根培養(yǎng)基：MS改良(MS其它元素含量不變，僅肌醇含量加倍)+NAA0.2mg/L+IAA0.3mg/L+多效唑1.5mg/L+矮壯素1.0mg/L。

以上培養(yǎng)基121℃下，滅菌20分鐘。

取盾葉薯蕷(salvia hispanica L)莖段，基本操作方法同實施例1一致；效果與實施例1相差不大。