一種調(diào)控盾葉薯蕷三倍體植株生根的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物三倍體植株生根方法技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種調(diào)控盾葉薯蕷三倍 體植株生根的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 盾葉薯截（ZVascoreaC.H.Wright)是薯截科薯截屬多年生草本 植物，俗稱黃姜，以干燥根莖入藥，根莖中10%左右為薯蕷皂苷(含量最高為16. 5%)(秦松 云，丁季春，舒抒，余再柏，李泉森.中國(guó)盾葉薯蕷資源現(xiàn)狀及保護(hù)對(duì)策.資源開發(fā) 與市場(chǎng)，2004，20，263-265.)，是世界上皂苷元含量最高的植物。薯蕷皂苷元具有降血 月旨、抗衰老、抗腫瘤、治療骨質(zhì)疏松、保護(hù)肝臟、抗糖尿病和消炎等功能。
[0003]多倍體基因的劑量效應(yīng)，可以使其營(yíng)養(yǎng)器官變大，有效成分增加，抗逆性增強(qiáng)等， 所以藥用植物多倍體育種已成為一條很好的優(yōu)良品種選育的有效途徑。三倍體育種是以營(yíng) 養(yǎng)器官為藥用部位的植物多倍體育種的一種有效途徑。因?yàn)樗粌H具有多倍體植株所具有 的優(yōu)良性狀，而且還因其減數(shù)分裂行為異常而多敗育，降低了植物的生殖能耗，有利于營(yíng)養(yǎng) 生長(zhǎng)和有效成分的積累（LewisWH(鮑文奎等譯）.多倍體在植物和動(dòng)物中的地位.貴陽(yáng)： 貴州人民出版社，1984 :293-294)。
[0004]近年來(lái)，對(duì)盾葉薯蕷的研究主要集中在有效成分的提取和藥理的研究等。含有皂 苷元的藥物逐漸被開發(fā)，在臨床上的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。然而由于人們對(duì)于盾葉薯蕷資源不 合理的開發(fā)與利用，導(dǎo)致其生產(chǎn)能力滿足不了市場(chǎng)的需求，因此運(yùn)用組織培養(yǎng)技術(shù)開發(fā)出 新品種有望解決產(chǎn)量和質(zhì)量問(wèn)題，其中利用胚乳培養(yǎng)的方法獲得三倍體植株，能夠有效的 改善盾葉薯蕷品質(zhì)、提高盾葉薯蕷的產(chǎn)量及有效成分含量，具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。前期 我們研究室通過(guò)盾葉薯蕷的胚乳培養(yǎng)誘導(dǎo)出了愈傷組織，并從愈傷組織分化了再生芽，采 用李懋學(xué)和張柿方(李懋學(xué)，張柿方.植物染色體研究技術(shù).哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)出 版社.1991，6-48)方法對(duì)再生芽的腋芽生長(zhǎng)點(diǎn)進(jìn)行鑒定獲得了三倍體再生芽，獲得的三 倍體再生芽很難生根，在培養(yǎng)基上莖基部膨大，時(shí)間長(zhǎng)了莖芽枯黃。采用1/2MS+ 0.3mg/ LNAA能夠使生根率達(dá)到90%，但生根所需時(shí)間較長(zhǎng)，培養(yǎng)15天后才有明顯的根長(zhǎng)出，45天后 才能達(dá)到移栽狀態(tài)，移栽成活率僅為80%。為了使其快速生根，根數(shù)增多，根長(zhǎng)增加，移栽成 活率升高，我們對(duì)其生根促進(jìn)劑進(jìn)行了研究探索。
[0005]銳皮留酮（ecdysterone，EDS)B卩β-蟲兌皮留酮，1954 年，Butenandt等從 500kg香 蛹中分離出250mg最初的昆蟲變態(tài)活性物質(zhì)銳皮酮（ecdysone)。此后，在許多種植物中分 離出多種類似的物質(zhì)。人們發(fā)現(xiàn)，蛻皮激素在植物界的分布不僅較動(dòng)物界高，而且廣，資源 豐富，如懷牛膝、川牛膝、桑葉、白毛夏枯草、澤瀉、羅漢松、紫杉、烏毛蕨及紫箕等藥用植物 中均含有其類似物，涉及到低等植物厥類、裸子植物、被子植物等80個(gè)科的植物類群中。動(dòng) 物實(shí)驗(yàn)表明EDS能促進(jìn)核酸及蛋白質(zhì)合成、調(diào)節(jié)糖代謝、促進(jìn)脂肪代謝、調(diào)芐基因表達(dá)、改 善免疫功能、影響中樞神經(jīng)及心血管系統(tǒng)和促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化等，因此被認(rèn)為有"更生誘 導(dǎo)物質(zhì)（reviveinducer)"的作用。銳皮留酮易溶于乙醇，用乙醇很容易將其提取。研究 發(fā)現(xiàn)牛膝的醇提物以及醇提物的乙酸乙酯萃取物(主要成分為m)s)對(duì)成骨樣細(xì)胞有顯著的 促進(jìn)增殖作用（高曉燕，王大為，李發(fā)美，姜志.牛膝提取物對(duì)成骨樣細(xì)胞增殖的作用. 2000a，17 (3): 201-213,高曉燕，王大為，李發(fā)美.牛膝中脫皮留酮的含量測(cè)定及促成 骨樣細(xì)胞增殖活性.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2000b，35(11): 868-870)，在人表皮干細(xì)胞增殖過(guò)程中也 有顯著促進(jìn)作用，是促進(jìn)創(chuàng)面愈合的主要機(jī)制（李國(guó)芳.蛻皮留酮促進(jìn)人表皮干細(xì)胞增殖 的初步研究[D]，廣州：南方醫(yī)科大學(xué)，2009)。也有研究發(fā)現(xiàn)，DES可促進(jìn)人臍靜脈血管內(nèi)皮 細(xì)胞（HUVEC)由靜止期和（或）DNA合成前期進(jìn)入DNA合成期、由DNA合成期進(jìn)入DNA合成 后期和(或）分裂期，對(duì)HUVEC增殖具有促進(jìn)作用（吳旭.蛻皮留酮的內(nèi)皮保護(hù)作用及其機(jī) 理研究[D]，廣州：第一軍醫(yī)大學(xué)，2006)。
[0006] 通過(guò)對(duì)近五十年有關(guān)EDS的研究報(bào)道的總結(jié)發(fā)現(xiàn)，相關(guān)研究主要集中在分離鑒 定、化學(xué)結(jié)構(gòu)和對(duì)動(dòng)物的作用及其機(jī)制，另外在不同植物中的分布、積累和測(cè)定方法等方面 的研究也較多，而對(duì)植物本身的作用方面尚未見報(bào)道。緣于EDS在動(dòng)物上有促進(jìn)細(xì)胞增殖、 分化等的作用，本研究將其運(yùn)用到盾葉薯蕷三倍體植株生根上，以期找到一種調(diào)控盾葉薯 蕷三倍體植株快速生根的有效方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題是提供了一種調(diào)控盾葉薯蕷三倍體植株生根的方法，所建 立的盾葉薯截三倍體植株生根方法不僅生根快而且生根率尚，根數(shù)較多，根長(zhǎng)較長(zhǎng)，同時(shí)對(duì) 地上部分生長(zhǎng)也有明顯的促進(jìn)作用，易于移栽成活，移栽成活率高達(dá)100%。
[0008] 本發(fā)明為解決上述技術(shù)問(wèn)題采用如下技術(shù)方案，一種調(diào)控盾葉薯蕷三倍體植 株生根的方法，其特征在于具體步驟為：選取生長(zhǎng)健壯的盾葉薯蕷三倍體再生芽，在超 凈工作臺(tái)上切成2-3cm長(zhǎng)的帶芽莖段，接種到培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基包括1/2MS+0. 3mg/L ΝΑΑ+0. 24-0. 96mg/L蛻皮留酮+30000mg/L蔗糖+7500mg/L瓊脂粉，培養(yǎng)基pH值為 5. 8-6. 0， 在無(wú)菌條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：溫度22-24°C，光/暗=16h/8h，相對(duì)濕度80%-90%，光 照強(qiáng)度 2000-3000LX。
[0009] 進(jìn)一步優(yōu)選，所述的培養(yǎng)基包括1/2MS+0. 3mg/LNAA+0. 48mg/L蛻皮甾酮 +30000mg/L蔗糖+7500g/L瓊脂粉。
[0010] 進(jìn)一步優(yōu)選，所述的蛻皮甾酮是從藥用植物懷牛膝、川牛膝、桑葉、白毛夏枯草、澤 瀉、羅漢松、紫杉、烏毛蕨或紫箕中提取的。
[0011] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比較，對(duì)盾葉薯蕷三倍體植株生根的促進(jìn)作用顯著，具體表 現(xiàn)為縮短開始生根時(shí)間的同時(shí)，平均根長(zhǎng)和平均生根數(shù)顯著增加、移栽成活率也顯著提高。 本發(fā)明中蛻皮留酮來(lái)源于植物，存在于80個(gè)科的植物類群中，并且易于提取、定量。因此具 有廣闊的應(yīng)用前景。
【具體實(shí)施方式】
[0012] 以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但不應(yīng)該將此理解為本 發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā) 明的范圍。 實(shí)施例
[0013] 材料和方法 1.1材料 供試材料為進(jìn)行過(guò)染色體數(shù)目、形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、生理生化、同工酶鑒定的盾葉薯蕷三 倍體再生植株。
[0014] 1. 2 方法 生根實(shí)驗(yàn)：超凈工作臺(tái)上，將盾葉薯蕷三倍體再生植株切成2-3cm長(zhǎng)的帶芽莖段，接種 到 1/2MS+0. 3mg/LΝΑΑ+0. 24-0. 96mg/L蛻皮留酮+30000g/L蔗糖+7500g/L瓊脂粉的培養(yǎng)基 中，培養(yǎng)基pH值為5. 8-6. 0,無(wú)菌條件下進(jìn)行培養(yǎng)，蛻皮留酮的濃度分別設(shè)置為0. 24、0. 48、 0. 72、0. 96mg/L，以不添加蛻皮留酮的培養(yǎng)基為對(duì)照。培養(yǎng)條件為：溫度22-24°C，光/暗 =18h/6h，相對(duì)濕度 80%-90%，光照強(qiáng)度 2000-3000LX。
[0015] 每種培養(yǎng)基20瓶，每瓶接種4株，每4瓶為一個(gè)重復(fù)。觀察開始生根時(shí)間，即有明 顯根開始長(zhǎng)出的時(shí)間。培養(yǎng)30天后，統(tǒng)計(jì)生根率、根數(shù)、根長(zhǎng)等。
[0016] 移栽實(shí)驗(yàn)：待生根培養(yǎng)至30天后，用自來(lái)水沖洗去根部培養(yǎng)基，水培2-3天，移栽 到m(泥炭土）：m(蛭石）為1:1的基質(zhì)中，正常管理。在溫室中培養(yǎng)30天后，統(tǒng)計(jì)成活率。
[0017] 1. 3數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)處理用SPSS13.0。采用"Duncan"法進(jìn)行平均數(shù)多重比較。
[0018] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 不同濃度蛻皮留酮處理對(duì)盾葉薯蕷三倍體植株生根及移栽成活率的影響見表1。
[0019] 表1不同濃度的蛻皮留酮溶液對(duì)盾葉薯蕷三倍體植株生根及移栽成活率的影響 (30 天）
注：同一列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示表示在/^ 0. 05水平上達(dá)到顯著差異。
[0020] 由表1可以看出：與對(duì)照①號(hào)培養(yǎng)基相比，添加0. 24-0. 96mg/L蛻皮甾酮都促進(jìn)了 盾葉薯蕷三倍體植株的生根，具體體現(xiàn)在：開始生根時(shí)間提前，最多可提前5天；生根率顯 著提高，最高可達(dá)100%，每個(gè)莖段平均根數(shù)增加，最多可達(dá)大約26條，其中多l(xiāng)cm根(對(duì)移栽 成活非常重要）所占比率也大幅提尚，最尚達(dá)85%。
[0021] 由表1還可以看出，與對(duì)照①號(hào)培養(yǎng)基相比，添加0. 24-0. 96mg/L蛻皮甾酮也促進(jìn) 了盾葉薯蕷三倍體植株地上部分的生長(zhǎng)，具體表現(xiàn)在：顯著增加了株高，最大株高3. 92cm; 顯著增加單株葉片數(shù)，葉片數(shù)最多為4. 85個(gè)。
[0022] 添加蛻皮留酮對(duì)盾葉薯蕷三倍體植株生根和地上部分生長(zhǎng)的的促進(jìn)作用也顯著 影響了其移栽成活，使其移栽成活率大幅提高，最高可達(dá)1〇〇%。這對(duì)于其規(guī)?；a(chǎn)具有重 要意義。
[0023] 以上實(shí)施例描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征及優(yōu)點(diǎn)，本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該 了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書中描述的只是說(shuō)明本發(fā)明的原 理，在不脫離本發(fā)明原理的范圍下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)均落入 本發(fā)明保護(hù)的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種調(diào)控盾葉薯蕷三倍體植株生根的方法，其特征在于具體步驟為：選取生長(zhǎng)健壯 的盾葉薯蕷三倍體再生芽，在超凈工作臺(tái)上切成2-3cm長(zhǎng)的帶芽莖段，接種到培養(yǎng)基中，該 培養(yǎng)基包括 1/2MS+0. 3mg/LΝΑΑ+0. 24-0. 96mg/L蛻皮留酮 +30000mg/L蔗糖 +7500mg/L瓊 脂粉，培養(yǎng)基pH值為5. 8-6. 0,在無(wú)菌條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：溫度22-24Γ，光/暗 =16h/8h，相對(duì)濕度 80%-90%，光照強(qiáng)度 2000-3000LX。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的調(diào)控盾葉薯蕷三倍體植株生根的方法，其特征在于：所述的 培養(yǎng)基包括 1/2MS+0. 3mg/LΝΑΑ+0. 48mg/L蛻皮留酮 +30000mg/L蔗糖 +7500mg/L瓊脂粉。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的調(diào)控盾葉薯蕷三倍體植株生根的方法，其特征在于：所述的 蛻皮甾酮是從藥用植物懷牛膝、川牛膝、桑葉、白毛夏枯草、澤瀉、羅漢松、紫杉、烏毛蕨或紫 箕中提取的。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種調(diào)控盾葉薯蕷三倍體植株生根的方法，其特征在于具體步驟為：選取生長(zhǎng)健壯的盾葉薯蕷三倍體再生芽，在超凈工作臺(tái)上切成2-3cm長(zhǎng)的帶芽莖段，接種到培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基包括1/2MS+0.3mg/L？NAA+0.24-0.96mg/L蛻皮甾酮+30000mg/L蔗糖+7500mg/L瓊脂粉，培養(yǎng)基pH值為5.8-6.0，在無(wú)菌條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：溫度22-24℃，光/暗=16h/8h，相對(duì)濕度80%-90%，光照強(qiáng)度2000-3000Lx。本發(fā)明對(duì)盾葉薯蕷三倍體植株生根的促進(jìn)作用顯著，具體表現(xiàn)為縮短開始生根時(shí)間的同時(shí)，平均根長(zhǎng)和平均生根數(shù)顯著增加、移栽成活率也顯著提高。
【IPC分類】A01H4/00
【公開號(hào)】CN105248283
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510750174
【發(fā)明人】趙喜亭, 李金亭, 陳明霞, 李俊華, 蔣麗薇, 李明軍
【申請(qǐng)人】河南師范大學(xué)
【公開日】2016年1月20日
【申請(qǐng)日】2015年11月9日