本發(fā)明涉及一種核桃楸的植株再生方法。

背景技術：

核桃楸(Juglans mandshurica Maxim)為胡桃科核桃屬植物，又名胡桃楸、東北核桃，俗稱山核桃。產(chǎn)于我國東北、華北各地，由于遭受破壞嚴重，自然資源大量減少，因而被列為國家Ⅱ級珍稀樹種。核桃楸木材質(zhì)地細韌，色澤淡雅，紋理致密，為家具、建筑等優(yōu)良用材。其果實山核桃，果仁含脂肪70％以上，風味獨特，香味濃郁，既是高熱能營養(yǎng)食品，又是補氣養(yǎng)血、潤肺健腦的綠色保健食品。在我國，早已把核桃楸的幼果、樹皮、根皮作為清熱解毒、消炎的中藥材使用，核桃楸的青皮中含有胡桃醌、黃酮類、萜類等多種有效成分，對治療腫瘤、冠心病、高血壓等疾病具有一定作用。核桃楸的樹葉提取物，可以制造殺蟲劑，生產(chǎn)綠色環(huán)保農(nóng)藥?？梢哉f，核桃楸從根到梢的各個部位都有用，渾身是寶。

目前核桃楸主要依靠種子和扦插兩種途徑繁育，速度慢，人工成本較高。研究核桃楸組培快繁技術已經(jīng)成為擴大其人工種植種源的重要基礎。但由于核桃楸細胞中含有豐富的酚類，因此在組織培養(yǎng)過程中褐化現(xiàn)象十分嚴重。另外現(xiàn)有的組培快繁方法誘導率和生根率并不高，難以滿足核桃楸繁育的需要。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明是要解決現(xiàn)有核桃楸組織培養(yǎng)器官發(fā)生困難、褐化現(xiàn)象嚴重、誘導率和生根率低的問題，提供一種核桃楸離體培養(yǎng)不定芽誘導植株再生的方法。

本發(fā)明核桃楸離體培養(yǎng)不定芽誘導植株再生的方法，包括以下步驟：

一、對核桃楸合子胚進行預處理

5月取材，先用洗衣粉水刷洗核桃楸果實表面，然后用流水沖洗1～2h，接著用無菌水沖洗3次，置于2～4℃條件下處理12～24h，然后移至超凈臺，利用紫外燈滅菌15～30min，用質(zhì)量濃度為75％的乙醇溶液浸泡2次，每次30s，再用質(zhì)量濃度為0.1％的HgCl₂溶液浸泡5-10min，然后用無菌水沖洗3-5次，備用；

二、取經(jīng)過步驟一預處理的核桃楸合子胚接種于含有1.0～1.5mg/L噻苯隆(TDZ)、0.5～1.0mg/L 6-BA、350mg/L谷氨酰胺、500mg/L水解酪蛋白、0.5～1.0g/L Na₂S₂O₃、0.5～1.0g/L PVP、6.0g/L瓊脂和30g/L蔗糖的MS改良培養(yǎng)基中，進行暗培養(yǎng)至出現(xiàn)愈傷組織；

步驟二所述暗培養(yǎng)的溫度為22-25℃；

三、將愈傷組織接種于含有0.5～1.0mg/L 6-BA、0.5～1.0g/L Na₂S₂O₃、0.5～1.0g/L PVP和6.0g/L瓊脂的MS改良培養(yǎng)基中，在光照強度為32～36μmol·m^-2·s^-1，溫度為23～25℃的環(huán)境中進行光暗交替培養(yǎng)，光暗周期為14h/10h，至長出不定芽；

四、將帶有不定芽的愈傷組織切成塊轉(zhuǎn)入含有0.1～0.5mg/L噻苯隆、0.02～0.04mg/L NAA、0.5～1.0g/L Na₂S₂O₃、0.5～1.0g/L PVP和6.0g/L瓊脂的MS改良培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每日光照12～14h，在光照強度為32～38μmol·m^-2·s^-1，溫度為22～24℃的環(huán)境中進行光照培養(yǎng)，每2～3天繼代培養(yǎng)一次，進行不定芽伸長，當不定芽伸長至2～3cm，將其轉(zhuǎn)入含有0.05～0.5mg/L 6-BA、0.05～0.2mg/L NAA、0.5～1.0g/L Na₂S₂O₃、0.5～1.0g/L PVP和6.0g/L瓊脂的MS改良培養(yǎng)基中培養(yǎng)，進行不定芽的抽莖；

五、將抽莖的不定芽轉(zhuǎn)入含有2.0mg/L吲哚乙酸、1.0mg/L NAA、6.0g/L瓊脂和60g/L蔗糖的1/2MS改良培養(yǎng)基，在光照強度為32～38μmol·m^-2·s^-1，溫度為22～24℃的環(huán)境中，進行光照培養(yǎng)以實現(xiàn)不定芽的生根；

六、將根長超過2cm的植株經(jīng)煉苗2～3d后移栽到溫室培養(yǎng)。

步驟六中煉苗移栽的具體方法為：取根長超過2cm的植株，移到自然光下，煉苗2～3d，然后洗去根系上的培養(yǎng)基，栽種到草炭:蛭石＝2:1(v/v)混合基質(zhì)中，在自然光下培育20～25天，然后移栽到土壤中。所述蛭石經(jīng)過0.5％高錳酸鉀溶液消毒。

所述MS改良培養(yǎng)基包含以下成分：NH₄NO₃ 1650mg·L^-1、KNO₃ 1900mg·L^-1、CaCl₂·2H₂O440mg·L^-1、MgSO₄·7H₂O 560mg·L^-1、KH₂PO₄170mg·L^-1、KI 1.66mg·L^-1、H₃BO₃6.2mg·L^-1、MnSO₄·4H₂O 22.3mg·L^-1、ZnSO₄·7H₂O 8.6mg·L^-1、NaMo₄·2H₂O 0.25mg·L^-1、CuSO₄·5H₂O 0.05mg·L^-1、CoCl₂·6H₂O 0.05mg·L^-1、FeSO₄·7H₂O 27.8mg·L^-1、Na₂-EDTA25.6mg·L^-1、肌醇1000mg·L^-1、鹽酸硫胺素1.0mg·L^-1、煙酸1.0mg·L^-1、鹽酸吡哆素0.5mg·L^-1、甘氨酸4.0mg·L^-1和蒸餾水。

所述1/2MS改良培養(yǎng)基包含以下成分：NH₄NO₃ 825mg·L^-1、KNO₃ 950mg·L^-1、CaCl₂·2H₂O 220mg·L^-1、MgSO₄·7H₂O 280mg·L^-1、KH₂PO₄ 85mg·L^-1、KI 0.83mg·L^-1、H₃BO₃6.2mg·L^-1、MnSO₄·4H₂O 11.2mg·L^-1、ZnSO₄·7H₂O 8.6mg·L^-1、NaMo₄·2H₂O 0.25mg·L^-1、CuSO₄·5H₂O 0.025mg·L^-1、CoCl₂·6H₂O 0.025mg·L^-1、FeSO₄·7H₂O 13.9mg·L^-1、Na₂-EDTA 12.8mg·L^-1、肌醇500mg·L^-1、鹽酸硫胺素0.5mg·L^-1、煙酸0.5mg·L^-1、鹽酸吡哆素0.25mg·L^-1、甘氨酸2.0mg·L^-1和蒸餾水。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明建立了高效、穩(wěn)定的核桃楸不定芽誘導方法，利用本發(fā)明方法可解決核桃楸育種周期長、見效慢的問題，為核桃楸的基因工程育種和遺傳改良工作奠定基礎。

本發(fā)明以核桃楸的合子胚為外植體進行不定芽的誘導，獲得愈傷組織，愈傷組織誘導率和不定芽誘導率高達100％，不定芽抽莖率高達85.36％，而不定芽生根率可達85％以上。本發(fā)明方法操作步驟簡便可行，能夠顯著降低褐化程度，褐化率僅為8.9％～10.4％。本發(fā)明方法與現(xiàn)有技術相比產(chǎn)生了預料不到的技術效果，這對核桃楸離體培養(yǎng)而言是一大突破，對于核桃楸的大量擴繁和基因工程育種研究具有廣泛的應用價值。

具體實施方式

本發(fā)明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式，還包括各具體實施方式間的任意組合。

具體實施方式一：本實施方式核桃楸離體培養(yǎng)不定芽誘導植株再生的方法，包括以下步驟：

一、對核桃楸合子胚進行預處理；

二、取經(jīng)過步驟一預處理的核桃楸合子胚接種于含有1.0～1.5mg/L噻苯隆、0.5～1.0mg/L 6-BA、350mg/L谷氨酰胺、500mg/L水解酪蛋白、0.5～1.0g/L Na₂S₂O₃、0.5～1.0g/L PVP、6.0g/L瓊脂和30g/L蔗糖的MS改良培養(yǎng)基中，進行暗培養(yǎng)至出現(xiàn)愈傷組織；

三、將愈傷組織接種于含有0.5～1.0mg/L 6-BA、0.5～1.0g/L Na₂S₂O₃、0.5～1.0g/L PVP和6.0g/L瓊脂的MS改良培養(yǎng)基中，在光照強度為32～36μmol·m^-2·s^-1，溫度為23～25℃的環(huán)境中進行光暗交替培養(yǎng)，至長出不定芽；

四、將帶有不定芽的愈傷組織切成塊轉(zhuǎn)入含有0.1～0.5mg/L噻苯隆、0.02～0.04mg/L NAA、0.5～1.0g/L Na₂S₂O₃、0.5～1.0g/L PVP和6.0g/L瓊脂的MS改良培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每日光照12～14h，在光照強度為32～38μmol·m^-2·s^-1，溫度為22～24℃的環(huán)境中進行光照培養(yǎng)，每2～3天繼代培養(yǎng)一次，進行不定芽伸長，當不定芽伸長至2～3cm，將其轉(zhuǎn)入含有0.05～0.5mg/L 6-BA、0.05～0.2mg/L NAA、0.5～1.0g/L Na₂S₂O₃、0.5～1.0g/L PVP和6.0g/L瓊脂的MS改良培養(yǎng)基中培養(yǎng)，進行不定芽的抽莖；

五、將抽莖的不定芽轉(zhuǎn)入含有2.0mg/L吲哚乙酸、1.0mg/L NAA、6.0g/L瓊脂和60g/L蔗糖的1/2MS改良培養(yǎng)基，在光照強度為32～38μmol·m^-2·s^-1，溫度為22～24℃的環(huán)境中，進行光照培養(yǎng)以實現(xiàn)不定芽的生根；

六、將根長超過2cm的植株經(jīng)煉苗2～3d后移栽到溫室培養(yǎng)。

具體實施方式二：本實施方式與具體實施方式一不同的是：步驟一中所述對核桃楸合子胚進行預處理的方法具體為：5月取材，先用洗衣粉水刷洗核桃楸果實表面，然后用流水沖洗1～2h，接著用無菌水沖洗3次，置于2～4℃條件下處理12～24h，然后移至超凈臺，利用紫外燈滅菌15～30min，用質(zhì)量濃度為75％的乙醇溶液浸泡2次，每次30s，再用質(zhì)量濃度為0.1％的HgCl₂溶液浸泡5-10min，然后用無菌水沖洗3-5次，備用。其它與具體實施方式一相同。

具體實施方式三：本實施方式與具體實施方式一或二不同的是：步驟二所述暗培養(yǎng)的溫度為22-25℃。其它與具體實施方式一或二相同。

具體實施方式四：本實施方式與具體實施方式一或二不同的是：步驟二所述暗培養(yǎng)的溫度為23-24℃。其它與具體實施方式一或二相同。

具體實施方式五：本實施方式與具體實施方式一至四之一不同的是：步驟三中在光照強度為33～35μmol·m^-2·s^-1，溫度為24℃的環(huán)境中進行光暗交替培養(yǎng)。其它與具體實施方式一至四之一相同。

具體實施方式六：本實施方式與具體實施方式一至五之一不同的是：步驟三中光暗交替培育的光暗周期為14h/10h。其它與具體實施方式一至五之一相同。

具體實施方式七：本實施方式與具體實施方式一至六之一不同的是：步驟六中煉苗移栽的具體方法為：取根長超過2cm的植株，移到自然光下，煉苗2～3d，然后洗去根系上的培養(yǎng)基，栽種到草炭:蛭石＝2:1混合基質(zhì)中，在自然光下培育20～25天，然后移栽到土壤中。其它與具體實施方式一至六之一相同。

具體實施方式八：本實施方式與具體實施方式七不同的是：所述蛭石經(jīng)過0.5％高錳酸鉀溶液消毒。其它與具體實施方式七相同。

具體實施方式九：本實施方式與具體實施方式一至八之一不同的是：步驟二、三和四中所述MS改良培養(yǎng)基包含以下成分：NH₄NO₃ 1650mg·L^-1、KNO₃ 1900mg·L^-1、CaCl₂·2H₂O440mg·L^-1、MgSO₄·7H₂O 560mg·L^-1、KH₂PO₄170mg·L^-1、KI 1.66mg·L^-1、H₃BO₃6.2mg·L^-1、MnSO₄·4H₂O 22.3mg·L^-1、ZnSO₄·7H₂O 8.6mg·L^-1、NaMo₄·2H₂O 0.25mg·L^-1、CuSO₄·5H₂O 0.05mg·L^-1、CoCl₂·6H₂O 0.05mg·L^-1、FeSO₄·7H₂O 27.8mg·L^-1、Na₂-EDTA25.6mg·L^-1、肌醇1000mg·L^-1、鹽酸硫胺素1.0mg·L^-1、煙酸1.0mg·L^-1、鹽酸吡哆素0.5mg·L^-1、甘氨酸4.0mg·L^-1和蒸餾水。其它與具體實施方式一至八之一相同。

具體實施方式十：本實施方式與具體實施方式一至九之一不同的是：步驟五中所述1/2MS改良培養(yǎng)基包含以下成分：NH₄NO₃ 825mg·L^-1、KNO₃ 950mg·L^-1、CaCl₂·2H₂O 220mg·L^-1、MgSO₄·7H₂O 280mg·L^-1、KH₂PO₄ 85mg·L^-1、KI 0.83mg·L^-1、H₃BO₃ 6.2mg·L^-1、MnSO₄·4H₂O 11.2mg·L^-1、ZnSO₄·7H₂O 8.6mg·L^-1、NaMo₄·2H₂O 0.25mg·L^-1、CuSO₄·5H₂O 0.025mg·L^-1、CoCl₂·6H₂O 0.025mg·L^-1、FeSO₄·7H₂O 13.9mg·L^-1、Na₂-EDTA12.8mg·L^-1、肌醇500mg·L^-1、鹽酸硫胺素0.5mg·L^-1、煙酸0.5mg·L^-1、鹽酸吡哆素0.25mg·L^-1、甘氨酸2.0mg·L^-1和蒸餾水。其它與具體實施方式一至九之一相同。

下面對本發(fā)明的實施例做詳細說明，以下實施例在以本發(fā)明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方案和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。

實施例1：

本實施例核桃楸離體培養(yǎng)不定芽誘導植株再生的方法，包括以下步驟：

一、對核桃楸合子胚進行預處理

5月取材，先用洗衣粉水刷洗核桃楸果實表面，然后用流水沖洗2h，接著用無菌水沖洗3次，置于4℃條件下處理12h，然后移至超凈臺，利用紫外燈滅菌15min，用質(zhì)量濃度為75％的乙醇溶液浸泡2次，每次30s，再用質(zhì)量濃度為0.1％的HgCl₂溶液浸泡10min，然后用無菌水沖洗3次，備用；

二、取經(jīng)過步驟一預處理的核桃楸合子胚接種于含有1.5mg/L噻苯隆、0.5mg/L 6-BA、350mg/L谷氨酰胺、500mg/L水解酪蛋白、0.5g/L Na₂S₂O₃、1.0g/L PVP、6.0g/L瓊脂和30g/L蔗糖的MS改良培養(yǎng)基中，進行暗培養(yǎng)至出現(xiàn)愈傷組織；所述暗培養(yǎng)的溫度為26℃；

三、將愈傷組織接種于含有1.0mg/L 6-BA、0.5g/L Na₂S₂O₃、1.0g/L PVP和6.0g/L瓊脂的MS改良培養(yǎng)基中，在光照強度為33μmol·m^-2·s^-1，溫度為24℃的環(huán)境中進行光暗交替培養(yǎng)，光暗周期為14h/10h，至長出不定芽；

四、將帶有不定芽的愈傷組織切成塊轉(zhuǎn)入含有0.2mg/L噻苯隆、0.04mg/L NAA、0.5g/L Na₂S₂O₃、1.0g/L PVP和6.0g/L瓊脂的MS改良培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每日光照14h，在光照強度為38μmol·m^-2·s^-1，溫度為24℃的環(huán)境中進行光照培養(yǎng)，每2天繼代培養(yǎng)一次，進行不定芽伸長，當不定芽伸長至2cm，將其轉(zhuǎn)入含有1.0mg/L 6-BA、0.05mg/L NAA、0.5g/L Na₂S₂O₃、1.0g/L PVP和6.0g/L瓊脂的MS改良培養(yǎng)基中培養(yǎng)，進行不定芽的抽莖；

五、將抽莖的不定芽轉(zhuǎn)入含有2.0mg/L吲哚乙酸、1.0mg/L NAA、6.0g/L瓊脂和60g/L蔗糖的1/2MS改良培養(yǎng)基，在光照強度為38μmol·m^-2·s^-1，溫度為24℃的環(huán)境中，進行光照培養(yǎng)以實現(xiàn)不定芽的生根；

六、將根長超過2cm的植株經(jīng)煉苗3d后移栽到溫室培養(yǎng)。

步驟六中練苗移栽的具體方法為：取根長超過2cm的植株，移到自然光下，煉苗3d，然后洗去根系上的培養(yǎng)基，栽種到草炭:蛭石＝2:1(v/v)混合基質(zhì)中，在自然光下培育20天，然后移栽到土壤中。所述蛭石經(jīng)過0.5％高錳酸鉀溶液消毒。移栽成活率達到99％。

所述MS改良培養(yǎng)基和1/2MS改良培養(yǎng)基的配方如表1所示。

本實施例是方法中愈傷組織誘導率為100％，愈傷組織呈黃色疏松，生長較快。

愈傷組織表面有綠色的、顆粒狀芽原基產(chǎn)生，且不定芽的誘導率為100％，不定芽生長旺盛，芽點大，呈嫩綠色。

本實施例的不定芽抽莖率為85.36％，不定芽生根的誘導率為89.4％，誘導形成的不定根數(shù)為2～5條，最長的不定根達5.0-6.0cm。再培養(yǎng)2周左右，不定根上長出許多側(cè)根，這些側(cè)根長達10cm以上，短達2cm左右。

本發(fā)明方法操作步驟簡便可行，能夠顯著降低褐化程度，褐化率僅為8.9％。

從外植體培養(yǎng)至成苗僅用60d左右時間，極大地縮短了植株再生時間，不定芽分化僅需12d，小植株生根僅需6d。

實施例2：

本實施例核桃楸離體培養(yǎng)不定芽誘導植株再生的方法，包括以下步驟：

一、對核桃楸合子胚進行預處理

5月取材，先用洗衣粉水刷洗核桃楸果實表面，然后用流水沖洗2h，接著用無菌水沖洗3次，置于4℃條件下處理12h，然后移至超凈臺，利用紫外燈滅菌15min，用質(zhì)量濃度為75％的乙醇溶液浸泡2次，每次30s，再用質(zhì)量濃度為0.1％的HgCl₂溶液浸泡10min，然后用無菌水沖洗3次，備用；

二、取經(jīng)過步驟一預處理的核桃楸合子胚接種于含有1.0mg/L噻苯隆、1.0mg/L 6-BA、350mg/L谷氨酰胺、500mg/L水解酪蛋白、0.5g/L Na₂S₂O₃、1.0g/L PVP、6.0g/L瓊脂和30g/L蔗糖的MS改良培養(yǎng)基中，進行暗培養(yǎng)至出現(xiàn)愈傷組織；所述暗培養(yǎng)的溫度為26℃；

三、將愈傷組織接種于含有1.0mg/L 6-BA、0.5g/L Na₂S₂O₃、1.0g/L PVP和6.0g/L瓊脂的MS改良培養(yǎng)基中，在光照強度為35μmol·m^-2·s^-1，溫度為24℃的環(huán)境中進行光暗交替培養(yǎng)，光暗周期為14h/10h，至長出不定芽；

四、將帶有不定芽的愈傷組織切成塊轉(zhuǎn)入含有0.5mg/L噻苯隆、0.02mg/L NAA、0.5g/L Na₂S₂O₃、1.0g/L PVP和6.0g/L瓊脂的MS改良培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每日光照14h，在光照強度為38μmol·m^-2·s^-1，溫度為22℃的環(huán)境中進行光照培養(yǎng)，每3天繼代培養(yǎng)一次，進行不定芽伸長，當不定芽伸長至2cm，將其轉(zhuǎn)入含有0.4mg/L 6-BA、0.2mg/L NAA、0.5g/L Na₂S₂O₃、1.0g/L PVP和6.0g/L瓊脂的MS改良培養(yǎng)基中培養(yǎng)，進行不定芽的抽莖；

五、將抽莖的不定芽轉(zhuǎn)入含有2.0mg/L吲哚乙酸、1.0mg/L NAA、6.0g/L瓊脂和60g/L蔗糖的1/2MS改良培養(yǎng)基，在光照強度為38μmol·m^-2·s^-1，溫度為24℃的環(huán)境中，進行光照培養(yǎng)以實現(xiàn)不定芽的生根；

六、將根長超過2cm的植株經(jīng)煉苗3d后移栽到溫室培養(yǎng)。

步驟六中練苗移栽的具體方法為：取根長超過2cm的植株，移到自然光下，煉苗3d，然后洗去根系上的培養(yǎng)基，栽種到草炭:蛭石＝2:1(v/v)混合基質(zhì)中，在自然光下培育20天，然后移栽到土壤中。所述蛭石經(jīng)過0.5％高錳酸鉀溶液消毒。移栽成活率達到98％。

所述MS改良培養(yǎng)基和1/2MS改良培養(yǎng)基的配方如表1所示。

本實施例是方法中愈傷組織誘導率為100％，愈傷組織呈黃色疏松，生長較快。

愈傷組織表面有綠色的、顆粒狀芽原基產(chǎn)生，且不定芽的誘導率為100％，不定芽生長旺盛，芽點大，呈嫩綠色。

本實施例的不定芽抽莖率為86.16％，不定芽生根的誘導率為91.22％，誘導形成的不定根數(shù)為2～5條，最長的不定根達5.0-6.0cm。再培養(yǎng)2周左右，不定根上長出許多側(cè)根，這些側(cè)根長達10cm以上，短達2cm左右。

本發(fā)明方法操作步驟簡便可行，能夠顯著降低褐化程度，褐化率僅為9.4％。

從外植體培養(yǎng)至成苗僅用60d左右時間，極大地縮短了植株再生時間，不定芽分化僅需12d，小植株生根僅需6d。

表1