專利名稱：玉米植株mon88017和組合物以及檢測它們的方法
專利說明玉米植株MON88017和組合物 以及檢測它們的方法 本申請要求2003年12月15日提交的美國臨時(shí)申請No.60/529,477的優(yōu)先權(quán)。發(fā)明領(lǐng)域[Para3]本發(fā)明涉及植物分子生物學(xué)領(lǐng)域。更特別地，發(fā)明涉及草甘膦耐受的以及昆蟲抗性的玉米植株MON88017，并涉及檢測植株樣品及其組合物中玉米植株MON88017DNA存在的分析和方法。相關(guān)現(xiàn)有技術(shù)的描述[Para5]玉米是重要的作物，在世界上很多地區(qū)都是主要的食物來源。生物技術(shù)方法已經(jīng)被運(yùn)用到玉米上來改進(jìn)產(chǎn)品的農(nóng)學(xué)性狀和質(zhì)量。一種這樣的農(nóng)學(xué)性狀是耐受除草劑，特別是耐受草甘膦除草劑。玉米中的該性狀已經(jīng)通過在表達(dá)抗草甘膦的5-烯醇丙酮酰-3-磷酸莽草酸合酶(CP4 EPSPS，美國專利5,633,435)的玉米植株中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)而被賦予。另一個(gè)農(nóng)學(xué)性狀是昆蟲抗性，例如遺傳工程玉米植株對玉米鉆孔螟和玉米根蟲的抗性(美國專利6,489,542和美國專利6,620,988)。能夠檢測到特定植株的轉(zhuǎn)基因/基因組DNA的存在以確定有性雜交的子代是否含有感興趣的轉(zhuǎn)基因/基因組DNA，這將是非常有利的。此外，當(dāng)遵照源自重組作物植物的食物需要預(yù)先的市場批準(zhǔn)和標(biāo)記的規(guī)則時(shí)，檢測特定植株的方法將是有用的。已知外來基因在植物中的表達(dá)受到它們的染色體位置的影響，或許是由于染色質(zhì)結(jié)構(gòu)(如異染色質(zhì))或靠近整合位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件(如增強(qiáng)子)的接近(Weising et al.，Ann.Rev.Genet 22421-477，1988)。因此之故，經(jīng)常有必要篩選大量的植株以鑒別最佳表達(dá)所引入的感興趣轉(zhuǎn)基因?yàn)樘卣鞯闹仓?。例如，已?jīng)觀察到在植物和其它生物中，在植物中所引入轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平可能廣泛變化。表達(dá)的空間或時(shí)間模式也可能有差異，例如在各種植物組織中的轉(zhuǎn)基因相對表達(dá)的差異，可能并不符合所引入基因構(gòu)建體中存在的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件所預(yù)期的模式。因此之故，通常產(chǎn)生成百上千的不同轉(zhuǎn)基因植株并篩選其中具有期望的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平和表型的單個(gè)植株用于商業(yè)目的。具有期望的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平或模式的植株在通過使用常規(guī)育種方法的有性雜交而將轉(zhuǎn)基因基因漸滲到其它遺傳背景方面是有用的。這種雜交的子代保留了原始轉(zhuǎn)化體的轉(zhuǎn)基因表達(dá)特征。該策略用于確保多種品種中的可靠基因表達(dá)，非常適合當(dāng)?shù)厣L條件和市場需求。通過任何公知的核酸檢測方法諸如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或使用多核酸探針的DNA雜交來檢測轉(zhuǎn)基因的存在是可能的。這些檢測方法一般使用遺傳元件特異的DNA引物或探針分子，諸如啟動子、前導(dǎo)序列、內(nèi)含子、編碼區(qū)、3′轉(zhuǎn)錄終止子、標(biāo)志基因等等，它們是DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因的成分。因此，這些方法用于區(qū)別不同轉(zhuǎn)基因事件(event)時(shí)不很有用，特別是使用同樣的轉(zhuǎn)基因DNA構(gòu)建體產(chǎn)生的那些，除非鄰近插入的轉(zhuǎn)基因DNA的基因組DNA序列是已知的。已經(jīng)開發(fā)了事件特異性的DNA檢測方法用于許多轉(zhuǎn)基因作物植物的引進(jìn)，例如甜菜(美國專利6,531,649)、小麥(美國專利公開20020062503)、抗昆蟲的玉米(美國專利公開20020102582)以及草甘膦耐受的玉米事件nk603(美國專利公開20020013960)。本發(fā)明涉及草甘膦耐受的并有玉米根蟲抗性的玉米植株MON88017，以及其中含有的組合物，并涉及檢測玉米植株MON88017的轉(zhuǎn)基因/基因組插入?yún)^(qū)的方法以及其含有這些組合物的子代。發(fā)明概述[Para10]本發(fā)明涉及命名為MON88017的轉(zhuǎn)基因玉米植株，種子以保藏號PTA-5582保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。發(fā)明的另一方面包括植物的子代植株、或種子、或可再生部分以及植株MON88017的種子。發(fā)明也包括玉米植株MON88017的植物部分，包括但不限于花粉、胚珠、種子、根和葉。發(fā)明涉及具有草甘膦耐受表型和玉米根蟲抗性表型的玉米植株MON88017，以及MON88017基因組中含有的新的遺傳組合物。發(fā)明的一個(gè)方面提供了DNA組合物以及檢測玉米植株MON88017的轉(zhuǎn)基因/基因組的接合區(qū)存在的方法。提供了分離的DNA分子，其包括選自SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的至少一種轉(zhuǎn)基因/基因組接合DNA分子及其互補(bǔ)序列，其中接合分子跨越轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)，所述插入位點(diǎn)包括插入玉米基因組中的異源DNA和玉米植株MON88017中插入位點(diǎn)側(cè)翼的玉米基因組DNA。含有這些DNA分子的任意一種的玉米種子及其植物材料是本發(fā)明的一方面。提供了分離的DNA分子，它是轉(zhuǎn)基因/基因組區(qū)SEQ ID NO3或其互補(bǔ)序列，其中該DNA分子在玉米植株MON88017的基因組中是新的。在基因組中含有SEQ ID NO3的玉米植株和種子是本發(fā)明的一方面。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了分離的DNA分子，它是轉(zhuǎn)基因/基因組區(qū)SEQ ID NO4或其互補(bǔ)序列，其中該DNA分子在玉米植株MON88017的基因組中是新的。在基因組中含有SEQ ID NO4的玉米植株和種子是本發(fā)明的一方面。提供了分離的DNA分子，它是MON88017的轉(zhuǎn)基因/基因組區(qū)SEQ ID NO5或其互補(bǔ)序列，其中該DNA分子在玉米植株MON88017的基因組中是新的。在基因組中含有SEQ ID NO5的玉米植株和種子是本發(fā)明的一方面。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了用于DNA檢測方法中的包括引物對的兩種DNA分子，其中第一DNA分子含有SEQ ID NO3或其互補(bǔ)的DNA分子的轉(zhuǎn)基因DNA區(qū)任何部分的至少11個(gè)或更多的連續(xù)多核苷酸，第二DNA分子含有SEQ ID NO3或其互補(bǔ)的玉米基因組DNA區(qū)任何部分的至少11個(gè)或更多的連續(xù)多核苷酸，其中當(dāng)一起使用時(shí)，這些DNA分子在產(chǎn)生擴(kuò)增子的DNA擴(kuò)增方法中包括DNA引物組。使用DNA引物對在DNA擴(kuò)增方法中產(chǎn)生的擴(kuò)增子是包含SEQ ID NO1的擴(kuò)增子時(shí)，可診斷玉米植株MON88017。由MON88017 DNA產(chǎn)生的任何長度的擴(kuò)增子是發(fā)明的方面，其中擴(kuò)增子含有SEQ ID NO1。熟練技術(shù)人員將認(rèn)可的是，第一和第二DNA分子不必僅僅由DNA組成，也可包括RNA，DNA和RNA的混合物，或者DNA、RNA或其它不作為一種或多種聚合酶模板的核苷酸或其類似物的組合。此外，熟練技術(shù)人員將認(rèn)可的是，如此處所述的探針或引物應(yīng)該是至少大約11、12、13、14、15、16、17、18、19和20個(gè)連續(xù)核苷酸的長度，其選自如SEQ ID NO1(任意命名的5’接合區(qū))、SEQ ID NO2(任意命名的3’接合區(qū))、SEQ ID NO3(任意命名的5’側(cè)翼序列的部分)、SEQ ID NO4(任意命名的3’側(cè)翼序列的部分)和SEQ ID NO5(插入的核苷酸序列的全部或部分)中所述的核苷酸。當(dāng)選自如SEQ ID NO3、SEQ ID NO4和SEQ ID NO5所示的核苷酸時(shí)，長度為至少大約21個(gè)到大約50個(gè)或更多連續(xù)核苷酸的探針和引物是可能的。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了用于DNA檢測方法中的包括引物對的兩種DNA分子，其中第一DNA分子含有SEQ ID NO4或其互補(bǔ)的DNA分子的轉(zhuǎn)基因DNA區(qū)任何部分的至少11個(gè)或更多的連續(xù)多核苷酸，第二DNA分子含有SEQ ID NO4或其互補(bǔ)的玉米基因組DNA區(qū)任何部分的至少11個(gè)或更多的連續(xù)多核苷酸，其中當(dāng)一起使用時(shí)，這些DNA分子在產(chǎn)生擴(kuò)增子的DNA擴(kuò)增方法中包括DNA引物組。使用DNA引物對在DNA擴(kuò)增方法中產(chǎn)生的擴(kuò)增子是包含SEQ ID NO2的擴(kuò)增子時(shí)，可診斷玉米植株MON88017。由MON88017 DNA產(chǎn)生的任何長度的擴(kuò)增子是發(fā)明的方面，其中擴(kuò)增子含有SEQ ID NO2。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了檢測樣品中特異性相應(yīng)于玉米植株MON88017 DNA的DNA存在的方法。該方法包括(a)將包含MON88017基因組DNA的樣品與DNA引物對接觸；(b)進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，從而產(chǎn)生擴(kuò)增子；以及(c)檢測擴(kuò)增子，其中擴(kuò)增子包含SEQ ID NO1或SEQ ID NO2。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了檢測樣品中特異性相應(yīng)于玉米植株MON88017 DNA的DNA存在的方法。該方法包括(a)將包含MON88017 DNA的樣品與DNA探針接觸，所述探針含有SEQ IDNO1或SEQ ID NO2，或者與SEQ ID NO1或SEQ ID NO2基本上同源的DNA分子，其在嚴(yán)格雜交條件下與玉米植株MON88017的基因組DNA雜交并且在嚴(yán)格雜交條件下不與非MON88017玉米植株DNA雜交；(b)使樣品和探針處于嚴(yán)格雜交條件下；以及(c)檢測探針與玉米植株MON88017 DNA的雜交。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了產(chǎn)生耐受草甘膦施用以及抵抗玉米根蟲的玉米植株的方法，包括步驟將第一親本玉米植株MON88017與缺少草甘膦耐受性和玉米根蟲抗性的第二親本玉米植株有性雜交，從而產(chǎn)生草甘膦耐受的和玉米根蟲抗性的雜種子代植物。本發(fā)明的另一方面是確定玉米事件MON88017的子代的接合性的方法，包括(a)將含有玉米DNA的樣品與包括SEQ ID NO32、SEQ ID NO33和SEQ ID NO34的引物組接觸，當(dāng)用于與玉米事件MON88017的基因組DNA進(jìn)行的核酸擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，所述引物組能產(chǎn)生診斷玉米事件MON88017的第一擴(kuò)增子；(b)進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，從而產(chǎn)生第一擴(kuò)增子；(c)檢測第一擴(kuò)增子；(d)將含有玉米DNA的樣品與所述引物組接觸，當(dāng)用于與玉米植株基因組DNA進(jìn)行的核酸擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，所述引物組能產(chǎn)生第二擴(kuò)增子，所述第二擴(kuò)增子含有與被鑒別為玉米事件MON88017的轉(zhuǎn)基因插入片段的玉米基因組區(qū)同源的天然玉米基因組DNA；(e)進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，從而產(chǎn)生第二擴(kuò)增子；(f)檢測第二擴(kuò)增子；(g)比較樣品中的第一和第二擴(kuò)增子，其中兩種擴(kuò)增子都存在，表明樣品對于轉(zhuǎn)基因插入是雜合的?？刂品N植玉米植株MON88017的大田中的雜草的方法，包括將含有有效量草甘膦的除草劑施加到種植MON88017玉米植株的大田中的步驟。雜種玉米種子，包含的其中至少一種親本是MON88017。用含有MON88017的植物表達(dá)盒的植物DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的玉米植株。從下面的詳細(xì)描述和附圖來看，前述的以及發(fā)明的其它方面將變得更為顯而易見。附圖簡述[Para26]

圖1.pMON53616質(zhì)粒圖譜。圖2.玉米植株MON88017中插入片段的基因組組構(gòu)。圖3.MON88017 5’轉(zhuǎn)基因/基因組DNA區(qū)(SEQ ID NO3)。圖4.MON88017 3’轉(zhuǎn)基因/基因組DNA區(qū)(SEQ ID NO4)。圖5.MON88017轉(zhuǎn)基因/基因組DNA區(qū)(SEQ ID NO5)。優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述[Para32]這里所稱為的“植株MON88017”或“MON88017”的轉(zhuǎn)基因玉米植株是對鞘翅目害蟲玉米根蟲(Diabrotica spp.)的攝食損傷有抗性的，并且耐受含草甘膦的農(nóng)業(yè)除草劑的植物毒性作用。該雙重性狀的玉米植株表達(dá)蘇云金芽孢桿菌(Kumamotoensis亞種)的CRY3Bb1蛋白(美國專利6,501,009)的修飾變體，其提供了對玉米根蟲幼蟲攝食損傷的抗性，并表達(dá)農(nóng)桿菌菌株CP4的草甘膦抗性的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(CP4EPSPS)蛋白(美國專利5,633,435)，其賦予植物對草甘膦的耐受性。雙重性狀玉米的使用將給玉米種植者提供主要好處a)免受由于玉米根蟲幼蟲造成的經(jīng)濟(jì)損失，該幼蟲是美國的主要昆蟲害蟲，在世界上的許多玉米種植區(qū)越來越受關(guān)注；b)施加含草甘膦的農(nóng)業(yè)除草劑給玉米作物用于廣譜雜草控制的能力。此外，編碼玉米根蟲和草甘膦耐受性狀的轉(zhuǎn)基因連鎖在同一DNA區(qū)段上，并且存在于MON88017基因組的單一基因座上，這一點(diǎn)提供了增強(qiáng)的育種效率并使得能夠用分子標(biāo)志來追蹤繁殖群體及其子代中的轉(zhuǎn)基因插入片段。通過用質(zhì)粒構(gòu)建體MON53616(圖1)對近交玉米系的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法生產(chǎn)玉米植株MON88017。該質(zhì)粒構(gòu)建體包含與在玉米植物細(xì)胞中表達(dá)CRY3Bb1蛋白和CP4 EPSPS蛋白所必需的調(diào)節(jié)性遺傳元件相連鎖的植物表達(dá)盒。將玉米細(xì)胞再生為完整玉米植株，從植株群體中選擇顯示出植物表達(dá)盒完整性以及對草甘膦和玉米根蟲幼蟲攝食損傷的抗性的個(gè)體植株。在其基因組中含有連鎖的pMON53616植物表達(dá)盒的玉米植株是本發(fā)明的一個(gè)方面。插入到玉米植株MON88017基因組中的質(zhì)粒DNA通過詳細(xì)的分子分析進(jìn)行表征。這些分析包括插入數(shù)量(玉米基因組中的整合位點(diǎn)數(shù))、拷貝數(shù)(一個(gè)基因座中的T-DNA拷貝數(shù))以及插入的基因盒的完整性。使用了DNA分子探針，其包括完整的CP4 EPSPS和CRY3Bb1編碼區(qū)和它們各自的調(diào)節(jié)元件、啟動子、內(nèi)含子和植物表達(dá)盒的聚腺苷化序列以及質(zhì)粒pMON53616主鏈DNA區(qū)。數(shù)據(jù)顯示MON88017含有單一的T-DNA插入和一個(gè)拷貝的CRY3Bb1和CP4EPSPS盒。在MON88017基因組中沒有檢測到來自連鎖或不連鎖到完整基因盒的轉(zhuǎn)化載體pMON88017的額外元件。最后，進(jìn)行了PCR和DNA序列分析來確定插入植物基因組的5′和3′接合區(qū)，確認(rèn)插入片段中的元件組構(gòu)(圖2)，并確定玉米植株MON88017中插入片段的完整DNA序列(SEQ ID NO5)。草甘膦耐受的、玉米根蟲抗性的玉米植株的培育可通過首先將由MON88017生長的玉米植株組成的第一親本玉米植株與缺少草甘膦除草劑耐受性的第二親本玉米植株有性雜交，從而產(chǎn)生許多雜種子代植株。近交玉米系可通過這樣的方法產(chǎn)生，包括用回歸親本回交并用草甘膦處理進(jìn)行選擇。通常用于不同性狀和作物的其它培育方法的描述可在現(xiàn)有技術(shù)已知的參考文獻(xiàn)中找到，例如Fehr，in BreedingMethods for Cultivar Development，Wilcox J.ed.，American Society ofAgronomy，Madisob WI(1987)。除非另有說明，術(shù)語是根據(jù)相關(guān)現(xiàn)有技術(shù)中的普通技術(shù)人員的常規(guī)用法來理解的。分子生物學(xué)中普通術(shù)語的定義也可在Riegeret al.，Glossary of GeneticsClassical and Molecular，5th edition，Springer-VerlagNew York，1991；以及Lewin，Genes V，OxfordUniversity PressNew York，1994中找到。使用如37 CFR§1.822所述的DNA堿基命名。如這里使用的，術(shù)語“玉米”是指Zea mays，包括可用玉米植株MON88017培育的所有植物品種。如這里使用的，術(shù)語“包含”是指“包括但不限于”?！安莞熟ⅰ笔侵窷-膦酰基甲基甘氨酸和它的鹽。N-膦酰基甲基甘氨酸是公知的對廣譜植物物種有活性的除草劑。草甘膦是在環(huán)境中具有期望的短半衰期的安全除草劑Roundup(Monsanto Co.)的活性成分。草甘膦是Roundup除草劑(Monsanto Co.)的活性成分。用“草甘膦除草劑”處理是指用Roundup、Roundup Ultra、Roundup Pro除草劑或者含草甘膦的任何其它除草劑制劑處理。草甘膦商品制劑的例子包括但不限于由Monsanto公司作為ROUNDUP、ROUNDUPULTRA、ROUNDUPULTRAMAX、ROUNDUPWEATHERMAX、ROUNDUPCT、ROUNDUPEXTRA、ROUNDUPBIACTIVE、ROUNDUPBIOFORCE、RODEO、POLARIS、SPARK和ACCORD除草劑出售的那些，全部都含有草甘膦的異丙基銨鹽；由Monsanto公司作為ROUNDUPDRY和RIVAL除草劑出售的那些，其含有草甘膦的銨鹽；由Monsanto公司作為ROUNDUPGEOFORCE出售的，其含有草甘膦的鈉鹽；以及由Syngenta Crop Protection作為TOUCHDOWN除草劑出售的，其含有草甘膦的三甲基锍鹽。當(dāng)施加到植物表面時(shí)，草甘膦系統(tǒng)性移動通過植物。草甘膦由于其對莽草酸途徑的抑制而是植物毒性的，該途徑提供芳香氨基酸合成的前體。草甘膦抑制植物中發(fā)現(xiàn)的酶，即5-烯醇丙酮酰-3-磷酸莽草酸合酶(EPSPS)。草甘膦耐受性可通過表達(dá)細(xì)菌EPSPS變體和植物EPSPS變體而獲得，所述變體具有更低的草甘膦親和性，從而在草甘膦存在下維持其催化活性(美國專利Nos.5,633,435，5,094,945，4,535,060和6,040,497)。玉米根蟲(CRW，Diabrotica spp)幼蟲以發(fā)育中的玉米植株的根為食。投入了大量費(fèi)用和時(shí)間來控制這種害蟲引起的經(jīng)濟(jì)損失。每年為控制CRW，將包括有機(jī)磷酸酯、氨基甲酸酯和合成除蟲菊酯類在內(nèi)的化學(xué)殺蟲劑引入到超過1600萬英畝的玉米地土壤中。從土壤殺蟲劑轉(zhuǎn)變到轉(zhuǎn)基因方法的好處是重大的，包括減少了潛在的人類健康和安全風(fēng)險(xiǎn)、減少了對非靶生物的直接影響、減少了地表和地下水供給的污染、減少了殺蟲劑容器的處理問題、以及與其它害蟲控制和農(nóng)學(xué)程序的普遍相容性。本發(fā)明提供了用含有至少一種表達(dá)高水平CRY3Bb1δ-內(nèi)毒素的表達(dá)盒和至少一種表達(dá)草甘膦耐受性酶的表達(dá)盒的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基植物。根據(jù)這里公開的方法，用這里公開的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的玉米植株是抗CRW的。同樣的玉米植株也是抗草甘膦除草劑的。連鎖的農(nóng)學(xué)性狀使得容易在繁殖群體中將這些性狀維持在一起。轉(zhuǎn)基因“植株”的生產(chǎn)是通過用異源DNA，即包括感興趣的轉(zhuǎn)基因的多核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；再生由轉(zhuǎn)基因插入到植物細(xì)胞基因組中而產(chǎn)生的植株群體，選擇特征為插入到特定基因組位置的特定植株。術(shù)語“事件(event)”是指包括異源DNA的原始轉(zhuǎn)化體植株以及轉(zhuǎn)化體的子代。術(shù)語“事件”也包括由事件與另一種植株之間的有性遠(yuǎn)交而產(chǎn)生的子代，其中子代包括異源DNA。即使在重復(fù)回交于回歸親本之后，被轉(zhuǎn)化的親本事件的插入DNA和側(cè)翼基因組DNA還存在于雜交子代的同一染色體位置。術(shù)語“事件”也指包括了插入DNA的原始轉(zhuǎn)化體的DNA以及緊鄰插入DNA的側(cè)翼基因組序列，它們預(yù)期將被轉(zhuǎn)移到接受了包括感興趣的轉(zhuǎn)基因的插入DNA的子代中，這是由于包括插入DNA的一種親本系(例如原始轉(zhuǎn)化體和自交產(chǎn)生的子代)與不含插入DNA的親本系的有性雜交的結(jié)果。本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因事件、玉米植株MON88017、其子代以及其中含有的DNA組合物?！疤结槨笔欠蛛x的核酸，其上連接了常規(guī)的可檢測標(biāo)志或報(bào)道分子，例如放射性同位素、配體、化學(xué)發(fā)光試劑或酶。這樣的探針與靶核酸的鏈互補(bǔ)，在本發(fā)明的情況下，是與MON88017的基因組DNA的鏈互補(bǔ)，其來自MON88017植株或者來自包括MON88017DNA的樣品。根據(jù)本發(fā)明的探針不僅包括脫氧核糖核酸或核糖核酸，也包括特異性結(jié)合到靶DNA上并可用于檢測靶DNA序列存在的聚酰胺和其它探針材料。DNA引物是分離的多核酸，其通過核酸雜交被退火到互補(bǔ)的靶DNA鏈上，在引物和靶DNA鏈之間形成雜交體，然后通過聚合酶如DNA聚合酶沿靶DNA鏈延伸。本發(fā)明的DNA引物對或DNA引物組是指用于擴(kuò)增靶核酸序列的兩種DNA引物，所述擴(kuò)增例如通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或其它常規(guī)的多核酸擴(kuò)增方法。DNA探針和DNA引物通常的長度為11個(gè)多核苷酸或更多，經(jīng)常是18個(gè)多核苷酸或更多、24個(gè)多核苷酸或更多、或者30個(gè)多核苷酸或更多。這樣的探針和引物被選擇為在高嚴(yán)格雜交條件下有足夠的長度來特異性雜交到靶序列上。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的探針和引物具有與靶序列完全的序列相似性，盡管也可以通過常規(guī)方法設(shè)計(jì)保持雜交到靶序列能力的不同于靶序列的探針。制備和使用探針和引物的方法描述于例如MolecularCloningA Laboratory Manual，2nd ed.，vol.1-3，ed.Sambrook etal.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989(下文稱為″Sambrook et al.，1989″)；Current Protocols inMolecular Biology，ed.Ausubel et al.，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York，1992(定性更新)(下文稱為″Ausubel et al，1992″)；以及Innis et al.，PCR ProtocolsA Guide to Methods andApplications，Academic PressSan Diego，1990。PCR DNA引物對可源自已知序列，例如通過使用打算用于例如引物目的的計(jì)算機(jī)程序(Version 0.5，1991，Whitehead Institute for Biomedical Research，Cambridge，MA)。這里公開的基于側(cè)翼基因組DNA和插入序列的引物和探針可用于確認(rèn)(如果必要的話，校正)由常規(guī)方法例如通過重新克隆并測序這些DNA分子而得到的公開DNA序列。本發(fā)明的核酸探針和引物在嚴(yán)格條件下與靶DNA分子雜交。可使用任何常規(guī)的核酸雜交或擴(kuò)增方法來鑒別樣品中轉(zhuǎn)基因植物DNA的存在。多核酸分子(也稱為核酸區(qū)段)或其片段在某種情況下能夠與其它核酸分子特異性雜交。如這里使用的，據(jù)認(rèn)為如果兩種多核酸分子能夠形成反向平行的雙鏈核酸結(jié)構(gòu)，這兩種多核酸分子就能夠彼此特異性雜交。如果表現(xiàn)出完全的互補(bǔ)性，核酸分子就被認(rèn)為是另一種核酸分子的“互補(bǔ)序列”。如這里使用的，當(dāng)一種分子的每個(gè)核苷酸都與另一分子的核苷酸互補(bǔ)，則認(rèn)為分子顯示出“完全的互補(bǔ)性”。如果兩種分子能夠以足夠的穩(wěn)定性相互雜交以允許它們在至少常規(guī)的“低嚴(yán)格”條件下保持彼此退火，則認(rèn)為它們是“最低程度互補(bǔ)的”。類似地，如果分子能夠以足夠的穩(wěn)定性相互雜交以允許它們在常規(guī)的“高嚴(yán)格”條件下保持彼此退火，則認(rèn)為它們是“互補(bǔ)的”。常規(guī)的嚴(yán)格條件描述于Sambrook et al，1989以及Haymes et alNucleic Acid Hybridization，A Practical Approach，IRL Press，Washington，DC(1985)，因此偏離完全互補(bǔ)是可允許的，只要這些偏離不完全阻止分子形成雙鏈結(jié)構(gòu)的能力。為將核酸分子用作引物或探針，僅僅需要它在序列上足夠互補(bǔ)以能夠在所采用的特定溶劑和鹽濃度下形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。如這里使用的，基本上同源的序列是在高嚴(yán)格條件下將特異性雜交于與其相比的核酸序列的互補(bǔ)序列的核酸序列。促進(jìn)DNA雜交的合適嚴(yán)格條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的或者能夠在CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中找到，例如約45℃下，6.0x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)，接著在50℃用2.0xSSC漂洗。例如，漂洗步驟的鹽濃度可選自50℃下大約2.0xSSC的低嚴(yán)格條件到50℃下大約0.2xSSC的高嚴(yán)格條件。此外，漂洗步驟的溫度可由大約22℃的室溫低嚴(yán)格條件增加到大約65℃的高嚴(yán)格條件。溫度和鹽兩者都可變化，或者溫度或鹽濃度兩者之一可保持恒定而改變另一變量。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核酸在中度嚴(yán)格條件下將與SEQ ID NOs1、2、3、4或5中所示的一種或多種核酸分子或其互補(bǔ)序列或其片段特異性雜交，例如大約2.0xSSC和大約65℃。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸在高嚴(yán)格條件下將與SEQ ID NOs1、2、3、4或5中所示的一種或多種核酸分子或其互補(bǔ)序列或其片段特異性雜交。在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明的優(yōu)選標(biāo)志核酸分子具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2中所示核酸序列或其互補(bǔ)序列或其片段。在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明的優(yōu)選標(biāo)志核酸分子與SEQ ID NO1或SEQ ID NO2中所示核酸序列或其互補(bǔ)序列或其片段共有80％-100％或者90％-100％的序列同一性。在本發(fā)明進(jìn)一步的方面，本發(fā)明的優(yōu)選標(biāo)志核酸分子與SEQ ID NO1或SEQ ID NO2中所示序列或其互補(bǔ)序列或其片段具有95％-100％的序列同一性。SEQ ID NO1或SEQ ID NO2可用作植物育種方法中的標(biāo)志來鑒別遺傳雜交的子代，類似于DNAmarkersProtocols，applications，and overviews(1997)173-185，Cregan，et al.，eds.，Wiley-Liss NY中描述的簡單序列重復(fù)DNA標(biāo)志分析方法。與靶DNA分子雜交的探針可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多方法檢測，這些方法包括但不限于熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、基于抗體的標(biāo)記以及化學(xué)發(fā)光標(biāo)記。關(guān)于使用特定的擴(kuò)增引物對擴(kuò)增靶核酸序列(例如通過PCR)，“嚴(yán)格條件”是允許引物對只雜交到靶核酸序列的條件，具有相應(yīng)野生型序列(或其互補(bǔ)序列)的引物將結(jié)合到該靶核酸序列上并且優(yōu)選在DNA熱擴(kuò)增反應(yīng)中產(chǎn)生獨(dú)特?cái)U(kuò)增產(chǎn)物擴(kuò)增子。術(shù)語“特異于(靶序列)”表明探針或引物在嚴(yán)格雜交條件下只與含有靶序列的樣品中的靶序列雜交。如這里使用的，“擴(kuò)增的DNA”或“擴(kuò)增子”是指針對靶多核酸分子的多核酸擴(kuò)增方法的產(chǎn)物，該靶多核酸分子是多核酸模板的一部分。例如，為確定由有性雜交產(chǎn)生的玉米植株是否含有本發(fā)明的玉米植株MON88017植株的轉(zhuǎn)基因植物基因組DNA，可對提取自玉米植株組織樣品的DNA進(jìn)行多核酸擴(kuò)增方法，使用的引物對包括源自與插入的異源DNA(轉(zhuǎn)基因DNA)的插入位點(diǎn)鄰接的MON88017植株基因組DNA序列的引物，第二引物源自插入的異源DNA，以產(chǎn)生診斷MON88017植株DNA存在的擴(kuò)增子。診斷性擴(kuò)增子的長度以及具有的DNA序列也可診斷植物基因組DNA，擴(kuò)增子的DNA序列包括SEQ ID NO1或SEQ ID NO2。擴(kuò)增子的長度范圍可為引物對長度加上一個(gè)核苷酸堿基對，優(yōu)選加上大約五十個(gè)核苷酸堿基對，更優(yōu)選加上大約二百五十個(gè)核苷酸堿基對，甚至更優(yōu)選加上大約四百五十個(gè)核苷酸堿基對或更多的合并長度。可替代地，引物對可源自插入的異源DNA兩側(cè)的基因組序列以便產(chǎn)生包括整個(gè)插入多聚核苷酸序列的擴(kuò)增子(例如正向引物分離自SEQ ID NO3的基因組部分，反向引物分離自SEQ ID NO4的基因組部分，就擴(kuò)增了包括插入MON88017基因組的兩個(gè)MON53616 DNA片段表達(dá)盒的DNA分子，插入片段包括SEQ ID NO5的大約7125個(gè)核苷酸，圖2和圖5)。源自鄰接轉(zhuǎn)基因插入DNA的植物基因組序列的引物對成員位于插入DNA序列的一段距離之處，該距離可在一個(gè)核苷酸堿基對到大約兩萬核苷酸堿基對之間變化。術(shù)語“擴(kuò)增子”的使用明確排除了可能在DNA熱擴(kuò)增反應(yīng)中形成的引物二聚體。多核酸擴(kuò)增可通過現(xiàn)有技術(shù)已知的各種多核酸擴(kuò)增方法的任何一種來完成，包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。擴(kuò)增方法是現(xiàn)有技術(shù)已知的，并且描述于美國專利Nos.4,683,195和4,683,202以及PCRProtocolsA Guide to Methods and Applications，ed.Innis et al，Academic Press，San Diego，990。已經(jīng)開發(fā)展了PCR擴(kuò)增方法來擴(kuò)增最多22kb(千堿基)的基因組DNA和最多42kb的噬菌體DNA(Cheng et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 915695-5699，1994)。這些方法以及現(xiàn)有技術(shù)已知的其它DNA擴(kuò)增方法都可用于實(shí)施本發(fā)明。異源DNA插入序列或MON88017的側(cè)翼基因組DNA序列的驗(yàn)證(如果必要的話，校正)可通過由MON88017種子擴(kuò)增這些DNA分子，或者由保藏在ATCC的保藏號為PTA-5582的種子長成的植物擴(kuò)增這些DNA分子，擴(kuò)增中使用源自這里提供的序列的引物，接著通過對PCR擴(kuò)增子或其克隆的DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)DNA測序?；贒NA擴(kuò)增方法的DNA檢測試劑盒含有DNA引物分子，它們在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件下特異性雜交到靶DNA上并擴(kuò)增診斷性擴(kuò)增子。試劑盒可提供基于瓊脂糖凝膠的檢測方法或者現(xiàn)有技術(shù)已知的檢測診斷性擴(kuò)增子的許多方法。含有與SEQ ID NO3或SEQ IDNO4的玉米基因組區(qū)的任何部分同源或互補(bǔ)的、以及與SEQ ID NO5的轉(zhuǎn)基因插入?yún)^(qū)的任何部分同源或互補(bǔ)的DNA引物的試劑盒是發(fā)明的一種目標(biāo)。特別地鑒別為在DNA擴(kuò)增方法中有用的引物對是SEQID NO6和SEQ ID NO7，其擴(kuò)增與MON88017的5′轉(zhuǎn)基因/基因組區(qū)的一部分同源的診斷性擴(kuò)增子，其中擴(kuò)增子包括SEQ ID NO1。用作DNA引物的其它DNA分子可選自DNA擴(kuò)增領(lǐng)域的技術(shù)人員所披露的MON88017轉(zhuǎn)基因/基因組DNA序列(SEQ ID NO5)。由這些方法產(chǎn)生的診斷性擴(kuò)增子可通過許多技術(shù)檢測。一種這樣的方法是遺傳比特分析(Nikiforov，et al.Nucleic Acid Res.224167-4175，1994)，其中設(shè)計(jì)了與鄰接的側(cè)翼基因組DNA序列和插入DNA序列都重疊的DNA寡核苷酸。將寡核苷酸固定在微量滴定板的孔中。在PCR感興趣的區(qū)域之后(使用的引物一種在插入序列中，一種在鄰接的側(cè)翼基因組序列中)，使用DNA聚合酶和特異于預(yù)期的下一個(gè)堿基的標(biāo)記的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTPs)，可將單鏈PCR產(chǎn)物雜交到固定的寡核苷酸上，用作單堿基延伸反應(yīng)的模板?？苫跓晒饣駿LISA來讀出。由于成功的擴(kuò)增、雜交和單堿基延伸而產(chǎn)生的信號表明轉(zhuǎn)基因/基因組序列的存在。另一種方法是由Winge描述的Pyrosequencing技術(shù)(Innov.Pharma.Tech.0018-24，2000)。在該方法中，設(shè)計(jì)了與鄰接的基因組DNA和插入DNA接合區(qū)都重疊的寡核苷酸。將寡核苷酸雜交到來自感興趣區(qū)域的單鏈PCR產(chǎn)物(一種引物在插入序列中，一種在側(cè)翼基因組序列中)，在DNA聚合酶、ATP、硫酸化酶、熒光素酶、腺苷三磷酸雙磷酸酶、腺苷酰硫酸以及熒光素存在下溫育。單獨(dú)加入DNTPs，摻入引起了可測定的光信號。由于成功的擴(kuò)增、雜交以及單堿基或多堿基延伸而產(chǎn)生的光信號表明轉(zhuǎn)基因/基因組序列的存在。如Chen et al.所描述的熒光偏振是可用來檢測本發(fā)明擴(kuò)增子的方法。使用該方法，設(shè)計(jì)與基因組側(cè)翼和插入DNA接合區(qū)都重疊的寡核苷酸。將寡核苷酸雜交到來自感興趣區(qū)域的單鏈PCR產(chǎn)物(一種引物在插入DNA中，一種在側(cè)翼基因組DNA序列中)，在DNA聚合酶和熒光標(biāo)記的ddNTP存在下溫育。單堿基延伸產(chǎn)生了ddNTP的摻入。摻入的測定可使用熒光計(jì)測定偏振變化。由于成功的擴(kuò)增、雜交和單堿基延伸而產(chǎn)生的偏振變化表明轉(zhuǎn)基因/基因組序列的存在。Taq man(PE Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)被描述為檢測和定量DNA序列存在的方法，根據(jù)廠商提供的用法說明可充分理解。簡要的說，設(shè)計(jì)與基因組側(cè)翼和插入DNA接合區(qū)都重疊的FRET寡核苷酸探針。在耐熱聚合酶和dNTPs存在下循環(huán)FRET探針和PCR引物(一種引物在插入DNA序列中，一種在側(cè)翼基因組序列中)。FRET探針的雜交引起熒光部分從FRET探針上的淬滅部分裂解并釋放。由于成功的擴(kuò)增和雜交而產(chǎn)生的熒光信號表明轉(zhuǎn)基因/基因組序列的存在。分子信標(biāo)被描述用于序列檢測，如Tyangi，et al.(NatureBiotech.14303-308，1996)所描述的。簡要的說，設(shè)計(jì)與基因組側(cè)翼和插入DNA接合區(qū)都重疊的FRET寡核苷酸探針。FRET探針的獨(dú)特結(jié)構(gòu)導(dǎo)致它包含將熒光和淬滅部分保持緊鄰的二級結(jié)構(gòu)。在耐熱聚合酶和dNTPs存在下循環(huán)FRET探針和PCR引物(一種引物在插入DNA序列中，一種在側(cè)翼基因組序列中)。在成功的PCR擴(kuò)增后，F(xiàn)RET探針雜交到靶序列上引起了探針二級結(jié)構(gòu)的去除以及熒光和淬滅部分的空間分離。導(dǎo)致熒光信號產(chǎn)生。由于成功的擴(kuò)增和雜交而產(chǎn)生的熒光信號表明側(cè)翼/轉(zhuǎn)基因插入序列的存在。使用這里公開的組合物和DNA檢測現(xiàn)有技術(shù)中公知的方法可開發(fā)DNA檢測試劑盒。試劑盒用于鑒別樣品中的玉米植株MON88017 DNA，可應(yīng)用于培育含有MON88017 DNA的玉米植株的方法。試劑盒含有作為引物或探針有用的DNA分子，其與SEQ IDNO1、2、3、4或5的至少一部分同源或互補(bǔ)。DNA分子可用在DNA擴(kuò)增方法(PCR)中或者作為多核酸雜交方法，即Southern分析、Northern分析中的探針。質(zhì)粒載體MON53616用于生產(chǎn)含有兩個(gè)表達(dá)盒的玉米事件MON88017表達(dá)盒一包括帶有復(fù)制的增強(qiáng)子的CaMV 35S啟動子，連接到小麥CAB 5′前導(dǎo)序列，再連接到水稻肌動蛋白1內(nèi)含子，再連接到CRY3Bb1編碼區(qū)，再連接到小麥Hsp17 3′聚腺苷化序列；連接到表達(dá)盒二，其包括水稻肌動蛋白1啟動子，連接到水稻肌動蛋白內(nèi)含子(其驅(qū)動融合到CP4 EPSPS編碼區(qū)的葉綠體運(yùn)輸肽轉(zhuǎn)錄)，再連接到NOS 3′聚腺苷化區(qū)，所連接的表達(dá)盒的序列包含在SEQ ID NO5中。下面的實(shí)施例是用來例證發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案的實(shí)施例的。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，下面實(shí)施例中公開的技術(shù)代表發(fā)明人所發(fā)現(xiàn)的在發(fā)明的實(shí)施中起良好作用的方法，因此可以認(rèn)為構(gòu)成了用于其實(shí)施的優(yōu)選方式的實(shí)施例。然而，根據(jù)目前的公開內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在所公開的具體實(shí)施方案中可以進(jìn)行許多改變而仍然獲得不脫離發(fā)明精神和范圍的相似的或類似的結(jié)果。實(shí)施例[Para63]實(shí)施例1[Para64]轉(zhuǎn)基因玉米植株MON88017的產(chǎn)生是通過用源自MON53616(圖1)的DNA片段進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米細(xì)胞轉(zhuǎn)化。使用三親本交配方法(Ditta et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.777347-7351，1980)將植物轉(zhuǎn)化構(gòu)建體MON53616交配進(jìn)農(nóng)桿菌中。將包含兩個(gè)轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)盒的MON53616的DNA片段插入玉米植株細(xì)胞基因組中，將玉米植株細(xì)胞再生為玉米植株MON88017。插入MON88017基因組中的插入片段的組構(gòu)示于圖2。MON88017和它的子代具有草甘膦耐受性以及對玉米根蟲幼蟲攝食損傷的抗性?；旧习催@里的描述進(jìn)行玉米轉(zhuǎn)化。含有MON53616的農(nóng)桿菌液體培養(yǎng)物起始于甘油儲備液或者新鮮劃線的平板，在含有50mg/l(毫克每升)卡那霉素、50mg/l鏈霉素或50mg/l壯觀霉素、有200μM乙酰丁香酮(AS)的25mg/l氯霉素的液體LB培養(yǎng)基中，pH 7.0，于26℃-28℃振蕩(大約150轉(zhuǎn)每分鐘，rpm)過夜生長到對數(shù)生長中期。將農(nóng)桿菌細(xì)胞重懸浮在接種培養(yǎng)基(液態(tài)CM4C，如美國專利6,573,361表8中所述)中，將細(xì)胞密度調(diào)節(jié)到使重懸浮細(xì)胞在分光光度計(jì)中于660nm波長下測定時(shí)具有1的光密度(即OD660)。用農(nóng)桿菌接種新鮮分離的II型未成熟的HillxLH198和Hill玉米胚，在23℃黑暗中共培養(yǎng)2-3天。然后將胚轉(zhuǎn)移到補(bǔ)充了500mg/l羧芐青霉素(Sigma-Aldrich，St Louis，MO)和20μM AgNO3)的延遲培養(yǎng)基(N61-100-12；如美國專利5,424,412表1所述)中，在28℃溫育4到5天。所有隨后的培養(yǎng)物都保持在這個(gè)溫度。在接種一周后將玉米胚芽鞘去除。將胚轉(zhuǎn)入第一選擇培養(yǎng)基(N61-0-12，如美國專利5,424,412表1所述)，所述培養(yǎng)基補(bǔ)充了500mg/l羧芐青霉素和0.5mM草甘膦。兩周后，將存活組織轉(zhuǎn)移到第二選擇培養(yǎng)基(N61-0-12)，所述培養(yǎng)基補(bǔ)充了500mg/l羧芐青霉素和1.0mM草甘膦。將存活的愈傷組織在1.0mM草甘膦上每兩周傳代培養(yǎng)，產(chǎn)生大約3個(gè)傳代培養(yǎng)物。當(dāng)鑒別到草甘膦耐受性組織時(shí)，將組織擴(kuò)大進(jìn)行再生。為再生，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基(MSOD，如美國專利5,424,412表1所述)中，所述培養(yǎng)基補(bǔ)充了0.1μM脫落酸(ABA；Sigma-Aldrich，St Louis，MO)，溫育兩周。將再生的愈傷組織轉(zhuǎn)移到高蔗糖培養(yǎng)基中溫育兩周。將小苗轉(zhuǎn)移到MSOD培養(yǎng)基(不含ABA)培養(yǎng)皿中溫育兩周。然后將帶根的植株轉(zhuǎn)移到土壤中。玉米細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法領(lǐng)域的技術(shù)人員可以修改該方法以提供含有本發(fā)明DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因玉米植株，或者使用其它方法諸如粒子槍，已知其提供轉(zhuǎn)基因單子葉植物。MON88017植株和種子具有可再生部分。種子的可再生部分包括但不限于胚、子葉、以及芽或根的分裂組織。發(fā)明也包括玉米植株MON88017的植株部分，包括但不限于花粉、胚珠、枝條、根和葉。發(fā)明也包括MON88017種子的可提取成分，包括但不限于蛋白質(zhì)、粗粉、玉米粉以及油。實(shí)施例2[Para69]玉米植株MON88017是從許多轉(zhuǎn)基因玉米植株中選擇出的，對草甘膦植物性和再現(xiàn)性損傷有耐受性。目前商品品質(zhì)轉(zhuǎn)基因植物的成功生產(chǎn)需要產(chǎn)生大量轉(zhuǎn)基因植株。在本發(fā)明中，MON88017是用包括pMON53616的不同DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的大約472個(gè)R0事件中的一種植株。MON88017事件是通過一系列分子分析、草甘膦耐受篩選、昆蟲抗性篩選以及表達(dá)分析篩選而從許多事件中選擇出來的。轉(zhuǎn)基因玉米植株對玉米根蟲攝食損傷抗性是通過溫室和田間篩選來分析的。使用由lowa State University的Oleson和Tollefson開發(fā)的節(jié)損傷標(biāo)準(zhǔn)(NIS)來評定根損傷，這種等級劃分法使用0-3的數(shù)值來評定對玉米根造成的損傷。0.00的數(shù)值描述無攝食損傷并且是最低評定，1.00描述了在大約兩英寸的莖干之中一個(gè)節(jié)或相當(dāng)于整個(gè)節(jié)被吃光，2.00描述了兩個(gè)完整節(jié)被吃掉，3.00描述了三個(gè)或更多節(jié)被吃掉，并且是最高評定。在完整節(jié)之間被吃掉的損傷記錄為節(jié)點(diǎn)損失的百分比，即1.50描述了1 1/2個(gè)節(jié)被吃掉、0.25描述了一個(gè)節(jié)的1/4被吃掉。通過在每直英尺的行施加1500-2000個(gè)卵而用玉米根蟲幼蟲人工侵染處于V3-V4生長階段的大田區(qū)塊。殺蟲劑處理的行是用Tefluthrin殺蟲劑(Force3G，Zeneca Ag Products)以每1000英尺行5盎司的比率處理的。MON88017在多次試驗(yàn)中顯示出0.08到0.11之間的根損傷率(RDR)。無殺蟲劑處理的等值線顯示了1.28的平均RDR。殺蟲劑處理不含殺蟲蛋白的玉米植株顯示了0.44的平均RDR。用草甘膦除草劑處理轉(zhuǎn)基因玉米植株來確定對除草劑的耐受性水平。試驗(yàn)地塊用草甘膦(RoundupWeatherMax，MonsantoCo，St Louis，MO)噴灑，在生長季節(jié)期間施加兩次，一次在V4、一次在V8生長階段，比率為每英畝1.125和2.25磅活性成分。在收獲時(shí)測定玉米種子產(chǎn)量，作為相對于未噴灑(WeatherMax 0)的MON8801 7地塊的百分比產(chǎn)量。表1中顯示的結(jié)果證明MON88017對草甘膦高度耐受，并且沒有降低產(chǎn)量，令人驚訝的是，經(jīng)處理的地塊比處理的地塊平均產(chǎn)量更高。表1.用草甘膦處理的與未經(jīng)處理的MON88017相比的百分比產(chǎn)率[Para73]處理 重復(fù)平均 表1圖例在V4-V8葉階段的每種WeatherMax處理的百分比產(chǎn)率與在0到V4葉階段的WeatherMax處理的百分比產(chǎn)率相比較，用每種重復(fù)處理中0-V4處理的結(jié)果確定100％產(chǎn)率基線。實(shí)施例3[Para76]通過首先將谷粒加工成細(xì)粉而從玉米粒中提取出MON88017基因組DNA和對照物質(zhì)。將大約6克加工過的谷粒轉(zhuǎn)移到50ml(毫升)錐形管中，然后將約16ml CTAB提取緩沖液[1.5％(w/v)CTAB，75mM Tris-HCI pH 8.0，100mM EDTA pH 8.0，1.05M NaCI，和0.75％(w/v)PVP(MW 40,000)]以及8微升RNase(10mg/ml，Roche)加入到加工過的谷粒中。將樣品在65℃間歇攪拌溫育30-60分鐘，然后使其冷卻到室溫。將大約15ml的氯仿∶異戊醇(24∶1(v/v))加入到樣品中。將懸浮液混合5分鐘，經(jīng)約16,000x g室溫離心5分鐘分離兩相。將水層(上層)轉(zhuǎn)移到干凈的50ml錐形管中。將大約1/10體積(約1.5ml)的10％CTAB緩沖液[10％(w/v)CTAB和0.7M NaCI]以及等體積的氯仿∶異戊醇[24∶1(v/v)]加入到水相，然后混合5分鐘。將樣品經(jīng)約16,000xg離心5分鐘分離各相。去除水層(上層)，與等體積(約15ml)的CTAB沉淀緩沖液[1％(w/v)CTAB，50mM Tris pH 8.0，和10mM EDTA pH 8.0]混合，使其在室溫放置1-2小時(shí)。將樣品經(jīng)約10,000xg室溫離心10分鐘沉淀DNA。棄去上清液，將沉淀溶于大約2ml的高鹽TE緩沖液(10mMTris-HCI pH 8.0，10mM EDTA pH 8.0，和1M NaCl)中。在37℃進(jìn)行平緩旋轉(zhuǎn)以幫助溶解沉淀。如果必要，將樣品經(jīng)約23,000xg室溫離心2分鐘以沉淀并去除碎片。加入大約1/10體積(約150μl)的3M NaOAc(pH 5.2)和2體積(約4ml，相對于上清液)的100％冰乙醇以沉淀DNA。將沉淀的DNA加入含有70％乙醇的微離心管中。DNA在微離心管中以最大速度(約14,000rpm)沉淀約5分鐘，真空干燥，重新溶解在TE緩沖液(pH 8.0)中。然后將DNA貯于4℃冰箱中。用選擇出的限制酶例如SspI、EcoRV、ScaI和SmaI在200μl的酶限制性緩沖液中于37℃消化10μg基因組DNA超過4小時(shí)，然后在70-80℃滅活酶15分鐘。用苯酚和氯仿提取DNA，用EtOH沉淀，溶于200μl中。然后讓DNA在1ml連接緩沖液和T4DNA連接酶中于4℃自身連接過夜。在70-80℃滅活連接反應(yīng)15分鐘，用EtOH沉淀，溶于200μl中。然后將DNA用作PCR模板，PCR采用CP4 EPSPS或CRY3Bb編碼區(qū)內(nèi)部的特異性引物，使用High Fidelity ExpandSystem(Roche)按照廠商提供的方案進(jìn)行。用嵌套引物進(jìn)行的第二輪PCR用于特異性擴(kuò)增。然后克隆PCR產(chǎn)物用于序列分析。使用Universal GenomeWalker試劑盒(cat#K1807-1，Clonetech，PaloAlto，CA)分離5′和3′轉(zhuǎn)基因/基因組區(qū)DNA，使用其中包括的銜接引物AP1和AP2以及廠商提供的方案。利用PCR從MON88017基因組DNA分離5′(SEQ ID NO3，圖3)和3′(SEQ ID NO4，圖4)轉(zhuǎn)基因/基因組DNA。用限制酶消化總基因組DNA(約10μg)。37℃消化過夜后使用QIAquick PCR純化柱純化DNA。用50μl水將DNA從柱上洗脫然后稀釋到1ml。將稀釋的洗脫液(85μl)與10μl緩沖液(10X)和5μl T4連接酶混合以環(huán)化片段。16℃溫育過夜后，將連接酶在70℃熱滅活。用一系列嵌套引物PCR擴(kuò)增樣品。分離3′轉(zhuǎn)基因/基因組區(qū)的引物組合包括SEQID NO8、SEQ ID NO9和AP1作為第一引物，SEQ ID NO10和AP2作為第二引物，SEQ ID NO11用作測序引物；5′轉(zhuǎn)基因/基因組區(qū)的分離包括SEQ ID NO12、SEQ ID NO14和AP1作為第一引物，SEQ ID NO13、SEQ ID NO15和AP2作為第二引物。PCR條件包括首次PCR＝7個(gè)循環(huán)的94℃2秒，72℃10分鐘；37個(gè)循環(huán)的94℃2秒，67℃10分鐘；1個(gè)循環(huán)的67℃10分鐘；第二次和第三次PCR＝5個(gè)循環(huán)的94℃2秒，72℃10分鐘；24個(gè)循環(huán)的94℃2秒，67℃10分鐘；1個(gè)循環(huán)的67℃10分鐘?？商娲?，經(jīng)PCR DNA擴(kuò)增MON88017事件的5′和3′轉(zhuǎn)基因/基因組插入?yún)^(qū)可以以這樣的條件進(jìn)行，包括7個(gè)循環(huán)的94℃25秒，72℃3分鐘；37個(gè)循環(huán)的94℃25秒，67℃3分鐘；1個(gè)循環(huán)的67℃7分鐘。所有隨后的擴(kuò)增以下面的條件進(jìn)行7個(gè)循環(huán)的94℃2秒，72℃4分鐘；37個(gè)循環(huán)的94℃2秒，67℃4分鐘；1個(gè)循環(huán)的67℃7分鐘。所有擴(kuò)增子在0.8％瓊脂糖凝膠上用溴乙錠染色顯現(xiàn)。用于測序的DNA的制備是通過直接用QlAquick PCR純化試劑盒(cat#28104，Qiagen Inc.，Valencia，CA)純化PCR樣品，或者通過從凝膠上提取合適片段并使用QIAquick Gel Extraction試劑盒(cat#28704，Qiagen Inc.)。使用TOPO TA Cloning試劑盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)亞克隆MON88017轉(zhuǎn)基因/基因組插入片段的側(cè)翼區(qū)域的DNA片段。5′轉(zhuǎn)基因/基因組區(qū)域的DNA序列示于圖3，3′轉(zhuǎn)基因/基因組區(qū)域的DNA序列示于圖4，完整的轉(zhuǎn)基因插入片段和相連接的側(cè)翼基因組DNA示于圖5。通過重疊PCR產(chǎn)物從MON88017基因組DNA中分離全長轉(zhuǎn)基因/基因組插入序列(SEQ ID NO5，圖5)。設(shè)計(jì)系列DNA引物來產(chǎn)生擴(kuò)增子，其含有來自MON88017基因組的轉(zhuǎn)基因插入片段和鄰接的側(cè)翼基因組區(qū)的一部分的DNA片段。對DNA片段測序，將序列合并形成片段序列的毗連群(contig)，就是本發(fā)明的SEQ ID NO5。DNA引物對組合是SEQ ID NO16和SEQ ID NO17，SEQ IDNO18和SEQ ID NO17，SEQ ID NO19和SEQ ID NO20，SEQID NO21和SEQ ID NO22，SEQ ID NO23和SEQ ID NO24，SEQ ID NO25和SEQ ID NO26，SEQ ID NO25和SEQ ID NO27。所有PCR反應(yīng)都使用總基因組DNA。所有擴(kuò)增子在0.8％瓊脂糖凝膠上用溴乙錠染色顯現(xiàn)。用于測序的DNA的制備通過直接用QlAquick PCR純化試劑盒純化PCR樣品，或者通過從膠上提取合適片段并使用QIAquick Gel Extraction試劑盒。使用DNA序列分析設(shè)備(ABI PrismTM377，PE Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)和DNASTAR序列分析軟件(DNASTAR Inc.，Madison，WI)生產(chǎn)DNA序列。實(shí)施例4[Para83]使用DNA事件引物對來產(chǎn)生診斷玉米事件MON88017的擴(kuò)增子。診斷MON88017的擴(kuò)增子包含至少一個(gè)接合序列SEQ ID NO1或SEQ ID NO2。將產(chǎn)生MON88017的診斷性擴(kuò)增子的事件引物對如表2所示，其中的引物對包括但不限于用于5′擴(kuò)增子序列的SEQ IDNO6和SEQ ID NO7。引物SEQ ID NO6在玉米基因組中的位置如圖3所示，開始于核苷酸952位。引物SEQ ID NO7在轉(zhuǎn)基因插入片段中的位置如圖5所示，開始于核苷酸450位。在MON88017DNA的DNA擴(kuò)增方法中使用SEQ ID NO6和SEQ ID NO7得到的期望擴(kuò)增子大小是大約550bps。除了這些引物對，任何源自SEQ IDNO3或SEQ ID NO4的引物對是本發(fā)明的方面，其在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中產(chǎn)生診斷MON88017或其子代的擴(kuò)增子。包含SEQ ID NO3或其互補(bǔ)序列的至少11個(gè)連續(xù)核苷酸的任何單一的分離DNA多核苷酸引物分子是發(fā)明的一方面，其在產(chǎn)生診斷MON88017擴(kuò)增子的DNA擴(kuò)增方法中是有用的。包含SEQ ID NO4或其互補(bǔ)序列的至少11個(gè)連續(xù)核苷酸的任何單一的分離DNA多核苷酸引物分子是發(fā)明的一方面，其在產(chǎn)生診斷MON88017擴(kuò)增子的DNA擴(kuò)增方法中是有用的。用于這種分析的擴(kuò)增條件的例子例舉在表2和表3中，然而，這些方法的任何修正或者使用與SEQ ID NO3或SEQ ID NO4同源或互補(bǔ)的DNA引物或者M(jìn)ON88017轉(zhuǎn)基因插入片段(SEQ ID NO5)中含有的遺傳元件的DNA序列都在現(xiàn)有技術(shù)之內(nèi)，其產(chǎn)生診斷MON88017的擴(kuò)增子。診斷性擴(kuò)增子包含與至少一種轉(zhuǎn)基因/基因組接合DNA (SEQ ID NO1或SEQ ID NO2)或其實(shí)質(zhì)性部分同源或互補(bǔ)的DNA分子。用于事件MON88017植物組織樣品的分析應(yīng)當(dāng)包括來自事件MON88017的陽性組織對照、來自非事件MON88017的玉米植株的陰性對照以及不含玉米基因組DNA的陰性對照。將擴(kuò)增內(nèi)源玉米DNA分子的引物對將用作DNA擴(kuò)增條件的內(nèi)部對照，這些引物對的例子是SEQ ID NO28和SEQ ID NO29，其擴(kuò)增大約239bp的DNA片段。另外的引物序列可由DNA擴(kuò)增方法領(lǐng)域的技術(shù)人員從SEQ IDNO3、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5中選擇，由示于表2和表3的方法產(chǎn)生擴(kuò)增子的條件可以不同，但是都產(chǎn)生診斷MON88017 DNA的擴(kuò)增子。用表2和表3的方法修正來使用這些DNA引物在發(fā)明的范圍中。由至少一種源自SEQ ID NO3、SEQ ID NO4或SEQ IDNO5的DNA引物序列產(chǎn)生的診斷MON88017的擴(kuò)增子是發(fā)明的一方面。含有源自SEQ ID NO3或SEQ ID NO4或SEQ ID NO5的DNA檢測試劑盒是發(fā)明的一方面，當(dāng)它用于DNA擴(kuò)增方法時(shí)產(chǎn)生MON88017的診斷性擴(kuò)增子。玉米植物或種子是發(fā)明的一方面，其中當(dāng)在DNA擴(kuò)增方法中測試時(shí)它的基因組產(chǎn)生診斷MON88017的擴(kuò)增子?？墒褂萌绫?所示的Stratagene Robocycler、MJ Engine、Perkin-Elmer 9700或者Eppendorf Mastercycler Gradient熱循環(huán)儀或者通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法和裝置進(jìn)行MON88017擴(kuò)增子的分析。表2.用于鑒別MON88017的5′轉(zhuǎn)基因插入片段/基因組接合區(qū)的PCR程序和反應(yīng)混合物條件。 表3.用于各種商業(yè)供應(yīng)的熱循環(huán)儀的推薦PCR參數(shù)。
使用下面的循環(huán)參數(shù)在Stratagene Robocycler、MJEngine、Perkin-Elmer 9700或者Eppendorf Mastercycler Gradient熱循環(huán)儀中進(jìn)行DNA擴(kuò)增。MJ Engine或Eppendorf MastercyclerGradient熱循環(huán)儀應(yīng)當(dāng)以計(jì)算出的模式運(yùn)行。以設(shè)置為最大的變速運(yùn)行Perkin-Elmcr 9700熱循環(huán)儀。實(shí)施例5[Para90]對分離自如實(shí)施例3所述的MON88017和對照玉米組織的基因組DNA進(jìn)行Southern印跡分析。使用Hoefer DyNA Quant 200熒光計(jì)(Pharmacia，Uppsala，Sweden)以Roche分子大小標(biāo)志IX作為DNA校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行DNA樣品定量。將大約20μg來自測試物質(zhì)的基因組DNA和10μg來自對照物質(zhì)的基因組DNA用于限制酶消化。對于插入穩(wěn)定性分析，使用大約10μg來自測試物質(zhì)的基因組DNA。使用1.00單位合適的限制酶于約500μl總體積中于37℃進(jìn)行過夜消化。消化之后，樣品的沉淀是通過加入1/10體積(50μl)的3M NaOAc(pH 5.2)和2體積(1ml，相對于原始消化體積)的100％乙醇，接著通過在-20℃冰箱中溫育至少30分鐘。消化的DNA在微型離心機(jī)中以最大速度沉淀，用70％乙醇漂洗，干燥，再溶解在TE緩沖液中。通過PCR擴(kuò)增pMON53616模板DNA的植物表達(dá)盒部分來制備DNA探針。通過用隨機(jī)引物方法(RadPrime DNA LabelingSystem，Life Technologies)用32P-dCTP(6000Ci/mmol)標(biāo)記大約25ng的每種探針(除了NOS 3′和TaHspl 73′聚腺苷化序列)。通過PCR使用25ng的DNA探針模板按下面的方式標(biāo)記NOS 3′和tahspl 7 3′聚腺苷化序列特異于模板的有義和反義引物(各0.25mM)；1.5mMMgCl2；dATP、dGTP和dTTP各3mM；約100mCi的32P-dCTP(6000Ci/mmol)；以及2.5單位的Taq DNA聚合酶，終體積20ml。循環(huán)條件如下1個(gè)循環(huán)的94℃3分鐘；2個(gè)循環(huán)的94℃45秒，52℃30秒，72℃2分鐘；1個(gè)循環(huán)的72℃10分鐘。所有的放射性標(biāo)記探針使用Sephadex G-50柱(Roche，Indianapolis，IN)純化。用作進(jìn)行標(biāo)記輔助的育種方法或者檢測樣品中的MON88017 DNA的探針的合成DNA分子可以包含SEQ ID NO1和SEQ ID NO2中所述的轉(zhuǎn)基因/基因組接合DNA分子的DNA序列或其實(shí)質(zhì)性部分。實(shí)施例6[Para95]用于鑒別來自含有事件MON88017的純合子代雜合的方法描述在接合性分析中，用于該分析的條件的例子描述在表4和表5中。用于接合性分析的DNA引物是引物(SEQ ID NO30)、(SEQ IDN031)、(SEQ ID NO32)、6FAMTM標(biāo)記的引物(SEQ ID NO33)和VICTM標(biāo)記的引物(SEQ ID NO34)，6FAM和VIC是連接到DNA引物上的Applied Biosystems(Foster City，CA)的熒光染料產(chǎn)品。當(dāng)用于這些反應(yīng)方法中時(shí)，SEQ ID NO30、SEQ ID NO31和SEQID NO32產(chǎn)生非轉(zhuǎn)基因玉米的DNA擴(kuò)增子、含有事件MON88017 DNA的雜合玉米的兩種DNA擴(kuò)增子、以及不同于其它非MON88017玉米植株的純合MON88017玉米的DNA擴(kuò)增子。對于該分析的對照來說，應(yīng)當(dāng)包括來自含有事件MON88017 DNA的純合和雜合玉米的陽性對照、來自非轉(zhuǎn)基因玉米的陰性對照、以及不含模板DNA的陰性對照。優(yōu)化該分析，以用于Stratagene Robocycler、MJEngine、Perkin-Elmer 9700或者Eppendorf Mastercycler Gradient熱循環(huán)儀。其它本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法和裝置是本領(lǐng)域技術(shù)水平之內(nèi)的，它們產(chǎn)生擴(kuò)增子來對與MON88017植株雜交得到的子代的接合性進(jìn)行診斷。表4.接合性分析反應(yīng)溶液 表5.接合性分析熱循環(huán)條件 使用下面的循環(huán)參數(shù)在Stratagene Robocycler、MJEngine、Perkin-Elmer 9700或Eppendorf Mastercycler Gradient熱循環(huán)儀中進(jìn)行DNA擴(kuò)增。當(dāng)在Eppendorf Mastercycler Gradient或MJ Engine中運(yùn)行PCR時(shí)，熱循環(huán)儀應(yīng)當(dāng)以計(jì)算出的模式運(yùn)行。當(dāng)在Perkin-Elmer 9700中運(yùn)行時(shí)，以設(shè)置為最大的變速運(yùn)行熱循環(huán)儀。上面公開的并在權(quán)利要求中敘述的玉米MON88017種子已經(jīng)根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，10801University Boulevard，Manassas，Va.20110。ATCC保藏號是PTA-5582。保藏將在保藏中心保持30年的時(shí)期、或者最后請求之后5年、或者專利的有效期內(nèi)中最長的一段時(shí)間，在那個(gè)時(shí)期期間將根據(jù)必要性提供代替品。實(shí)施例7[Para102]可由玉米事件MON88017生產(chǎn)諸如食品和日用品這樣的產(chǎn)品，如果在這些食品和日用品中以足夠水平被檢測到，這些食品和日用品預(yù)期含有能夠診斷玉米事件MON88017材料在這些日用品和食品中存在的核苷酸序列。這些食品和日用品的例子包括但不限于玉米油、玉米粗粉、玉米面、玉米面筋、玉米餅、玉米淀粉、以及打算作為食物源供動物消費(fèi)的任何其它食品、或者另外打算作為膨脹劑、或者打算作為化妝組合物中的成分用于化妝用途等。基于探針或引物對的核酸檢測方法和/或試劑盒可以被開發(fā)來允許檢測生物樣品中諸如SEQ ID NO1或SEQ ID NO2這樣的MON88017核苷酸序列，其中探針序列或引物序列選自如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ IDNO3、SEQ ID NO4和SEQ ID NO5中所示的序列，這樣的檢測能診斷這種樣品中玉米事件MON88017。已經(jīng)圖解和詳述了本發(fā)明的原理，對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說應(yīng)當(dāng)顯而易見的是，發(fā)明可以在不偏離這些原理下在排列和細(xì)節(jié)方面進(jìn)行修改。我們要求所附權(quán)利要求書的精神和范圍之內(nèi)的所有改進(jìn)的權(quán)利。本說明書中所引用的所有出版物和公布專利文件都引入這里作為參考，其程度等同于具體并分別指出各個(gè)出版物或?qū)＠暾埍灰米鳛閰⒖肌?br> 關(guān)于保藏的微生物或其它生物材料的說明(PCT 13bis條) PCT/RO/134表(1998年7月；2004年1月重新印刷)
序列表<110>Monsanto Technology LLCBeazley，KimCoombe，TimGroth，MarkHinchey，TerriPershing，JayVaughn，TyZhang，Bei<120>玉米植株MON88017和組合物以及檢測它們的方法<130>38-15(53143)<150>60/529,477<151>2003-12-15<160>34<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>玉米基因組和非玉米轉(zhuǎn)基因插入片段的嵌合DNA<400>1tgacggtgac gatatattca 20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>玉米基因組和非玉米轉(zhuǎn)基因插入DNA的嵌合DNA<400>2cagttttaaac agagtcgggt 20<210>3<211>1461<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>玉米基因組和非玉米轉(zhuǎn)基因插入DNA的嵌合DNA<400>3gaccagcgtc tcccgccgca cccgcagtct gcaccgtaga gatcggatgt acaggcatgt 60agcattaggc tattcagcgg ctctcgtatc ttattcccta ccatctattt tatctacact 120gtataatact ccctccgttt attgtttatt tgtcgttgaa tagttcaata tttgcactgt 180ccagcgacaa ctaaaatgaa acggagtgag gtagtgtttt gtacaaccat atatagaggt 240gcccaaacgg gcggcccggc ccgggcccgt caggcccgac ggttaatcgg gccgtgcccg 300gccggccccg tgccgtagcc gtggcccagg cacggcgtgc cgggccagcc gtttaactgg 360tcacgttctc ccgcctaact gaaggacact aaccaatata actcgtgagc atttgttgta 420aatagctaat ataaaatgta aatatatata ctatgtttta taaaataaaa aatatataat 480cgtgccggcc aggccggcac tgcgggccaa gacagcggcc caagcacgtc acggttctcg 540tgccgggccg gccccggcat cgtgtttcag gccggtccgt taggcacggc tcatttggcc 600ctctataacc atatatcata ttcatcgacg accttgggct aaggcagacc gacggccgcc 660ctaggcccca gatctataga ggcttaatgc taaatataaa ttcagtagtt agactatcaa 720
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<223>玉米基因組和非玉米轉(zhuǎn)基因插入DNA的嵌合DNA<400>4caaactccac atgggcttct cgggcgacaa gaatgaactg atcattggtg ctgagtcctt 60cgtctccaac gagaagatct acatcgacaa gatcgagttc atccccgtcc agctgtgata 120ggaactctga ttgaattctg catgcgtttg gacgtatgct cattcaggtt ggagccaatt 180
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<223>玉米基因組和非玉米轉(zhuǎn)基因插入DNA的嵌合DNA<400>5tacccgatca gagcgctaag cagcagaatc gtgtgacaac gctagcagct ctcctccaac 60acatcatcga caagcacctt ttttgccgga gtatgacggt gacgatatat tcaattgtaa 120atggcttcat gtccgggaaa tctacatgga tcagcaatga gtatgatggt caatatggag 180aaaaagaaag agtaattacc aatttttttt caattcaaaa atgtagatgt ccgcagcgtt 240attataaaat gaaagtacat tttgataaaa cgacaaatta cgatccgtcg tatttatagg 300
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<210>9<211>30<212>DNA<213>小麥<400>9tgtaatcggc taatcgccaa cagattcggc 30<210>10<211>32<212>DNA<213>小麥<400>10cggccgctcg agcaggacc gcagaagcta gc 32<210>11<211>33<212>DNA<213>小麥<400>11gatggggatc agattgtcgt ttcccgcctt cag 33<210>12<211>27<212>DNA<213>水稻<400>12cactttgggc caccttttat taccgat 27<210>13<211>29<212>DNA<213>水稻
<400>13ctgatgtttt cacttttgac caggtaatc29<210>14<211>28<212>DNA<213>水稻<400>14taattactct ttctttttct ccatattg 28<210>15<211>26<212>DNA<213>水稻<400>15catactcatt gctgatccat gtagat 26<210>16<211>24<212>DNA<213>玉米<400>16cctattttaa attttgtcct gaac 24<210>17<211>27<212>DNA<213>水稻<400>17gatcgtggat agcactttgg gctttag 27
<210>18<211>29<212>DNA<213>玉米<400>18accgccacct atcatatacat acatgatc29<210>19<211>27<212>DNA<213>水稻<400>19aggtggccca aagtgaaatt tactctt 27<210>20<211>28<212>DNA<213>擬南芥<400>20gcagatctac atccgagagc cccattcc 28<210>21<211>28<212>DNA<213>水稻<400>21tcgatctttg gccttggtag tttgggtg 28<210>22<211>28<212>DNA<213>根癌農(nóng)桿菌
<400>22gctcatcagg cagccttcgt atcgggag 28<210>23<211>27<212>DNA<213>根癌農(nóng)桿菌<400>23ctcgatcacc gcatcgccat gagcttc 27<210>24<211>28<212>DNA<213>蘇云金芽孢桿菌<400>24aagacctggg cgtccttcag caacagga 28<210>25<211>28<212>DNA<213>蘇云金芽孢桿菌<400>25cctggaaggc cttcatggcc caagtcga 28<210>26<211>27<212>DNA<213>玉米<400>26aacagaggcg tgaccggtca gcgactc 27
<210>27<211>28<212>DNA<213>玉米<400>27tccttcgcgt aggaagtagg cacacgag 28<210>28<211>20<212>DNA<213>玉米<400>28cgtggtgatc acaaacagta 20<210>29<211>21<212>DNA<213>玉米<400>29ctatatgaca gacccatcgt t21<210>30<211>20<212>DNA<213>玉米<400>30cacatcatcg acaagcacct 20<210>31<211>22<212>DNA<213>玉米
<400>31gtatgccgga gttgaccatc ca 22<210>32<211>24<212>DNA<213>水稻<400>32ggacatgaag ccatttacaa ttga 24<210>33<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于接合性分析的標(biāo)記的引物<400>33tgacggtgac gatat 15<210>34<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于接合性分析的標(biāo)記的引物<400>34agaaggccgg agtcg 1權(quán)利要求
1.用作DNA探針分子或DNA引物分子的分離的DNA分子或其片段，其中所述DNA分子或其片段與選自SEQ ID NO1、SEQ IDNO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4和SEQ ID NO5的DNA分子同源或互補(bǔ)。
2.權(quán)利要求1的分離的DNA引物分子，包含SEQ ID NO3的至少11個(gè)連續(xù)核苷酸或其互補(bǔ)序列，用于DNA擴(kuò)增方法中產(chǎn)生包含SEQ ID NO1的擴(kuò)增子，其中所述擴(kuò)增子診斷玉米事件MON88017DNA。
3.權(quán)利要求1的分離的DNA引物分子，包含SEQ ID NO4的至少11個(gè)連續(xù)核苷酸或其互補(bǔ)序列，用于DNA擴(kuò)增方法中產(chǎn)生包含SEQ ID NO2的擴(kuò)增子，其中所述擴(kuò)增子診斷玉米事件MON88017DNA。
4.檢測樣品中相應(yīng)于玉米事件MON88017的DNA存在的方法，該方法包括(a)將含有DNA的樣品與DNA引物對接觸，其中所述DNA引物對包括至少一種權(quán)利要求1的DNA引物分子；(b)進(jìn)行多核酸擴(kuò)增反應(yīng)，從而產(chǎn)生擴(kuò)增子；以及(c)檢測所述擴(kuò)增子，其中所述擴(kuò)增子含有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2。
5.穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的玉米植株，當(dāng)通過權(quán)利要求4的方法分析時(shí)，它的DNA產(chǎn)生含有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的DNA擴(kuò)增子。
6.權(quán)利要求4的方法中，其中所述DNA引物對是SEQ ID NO6和SEQ ID NO7。
7.檢測樣品中相應(yīng)于玉米事件MON88017的DNA存在的方法，該方法包括(a)將含有DNA的樣品與探針接觸，所述探針在嚴(yán)格雜交條件下與玉米事件MON88017的基因組DNA雜交并且在嚴(yán)格條件下不與對照玉米植株基因組DNA雜交，其中所述探針與SEQ ID NO1或SEQ ID NO2同源或互補(bǔ)；以及(b)使樣品和探針經(jīng)受嚴(yán)格雜交條件；以及檢測探針與DNA的雜交。
8.草甘膦耐受的并且有玉米根蟲抗性的玉米植株，其中草甘膦耐受性狀與玉米根蟲抗性性狀發(fā)生在同一基因座，并且遺傳連鎖到標(biāo)志多核酸的互補(bǔ)序列上，其中所述標(biāo)志多核酸分子與選自SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的DNA分子同源或互補(bǔ)。
9.確定玉米事件MON88017子代的接合性的方法，包括(a)將含有玉米DNA的樣品與包括SEQ ID NO30、SEQ ID NO31和SEQ ID NO32的引物組接觸，當(dāng)用于與玉米事件MON88017基因組DNA進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，所述引物組能產(chǎn)生診斷玉米事件MON88017的第一擴(kuò)增子；(b)進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，從而產(chǎn)生第一擴(kuò)增子；(c)檢測第一擴(kuò)增子；(d)將含有玉米DNA的樣品與所述引物組接觸，當(dāng)用于與玉米植株基因組DNA進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，所述引物組能產(chǎn)生第二擴(kuò)增子，其含有與被鑒別為玉米事件MON88017的轉(zhuǎn)基因插入片段的玉米基因組區(qū)同源的天然玉米基因組DNA；(e)進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，從而產(chǎn)生第二擴(kuò)增子；(f)檢測第二擴(kuò)增子；(g)比較樣品中的第一和第二擴(kuò)增子，其中兩種擴(kuò)增子的存在表明樣品對于轉(zhuǎn)基因插入片段是雜合的。
10.產(chǎn)生對玉米根蟲幼蟲造成的根攝食損傷有抗性的并且耐受草甘膦除草劑施用的玉米植株的方法，包括(a)將第一草甘膦耐受/玉米根蟲抗性的玉米植株MON88017親本植株與缺少草甘膦耐受性和玉米根蟲攝食損傷的第二親本玉米植株有性雜交，從而產(chǎn)生許多子代植株；(b)用草甘膦處理所述子代植株；(c)選擇耐受草甘膦的所述子代植株，其中所述子代植株也對玉米根蟲攝食損傷有抗性。
11.由權(quán)利要求10的方法產(chǎn)生的雜種玉米種子，其中至少一個(gè)親本是玉米事件MON88017。
12.控制種植玉米事件MON88017的大田的雜草的方法，包括將含有有效劑量草甘膦的除草劑施加到種植所述玉米事件MON88017的大田的步驟。
13.命名為MON88017的玉米植株的種子，是具有已被保藏為ATCC保藏號PTA-5582的所述玉米植株的典型種子。
14.通過生長權(quán)利要求1的種子而產(chǎn)生的玉米植株MON88017或其部分。
15.權(quán)利要求2的玉米植株MON88017或其部分，包括花粉、胚珠、種子、根或葉。
16.權(quán)利要求2的玉米植株MON88017，進(jìn)一步包括其子代。
17.權(quán)利要求4的玉米植株MON88017，其中所述玉米植株或其子代的基因組包含選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3和SEQ ID NO4的DNA分子。
18.權(quán)利要求4的玉米植株MON88017或其部分，當(dāng)在包含由SEQID NO6和SEQ ID NO7組成的DNA引物對的DNA擴(kuò)增方法中測試時(shí)，其基因組產(chǎn)生診斷玉米植株MON88017的擴(kuò)增子。
19.權(quán)利要求5的玉米植株MON88017，其中所述玉米植株是對玉米根蟲和草甘膦耐受的。
20.權(quán)利要求的玉米植株MON88017，在其基因組中包含連鎖的MON53616的植株表達(dá)盒。
21.包含選自SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的至少大約11個(gè)到大約20個(gè)連續(xù)核苷酸的分離的核酸區(qū)段。
22.權(quán)利要求21所述的分離的核酸區(qū)段，用于核酸擴(kuò)增方法中檢測生物樣品中玉米事件MON88017核酸的存在。
23.由獲自玉米事件MON88017的基因組DNA純化或生產(chǎn)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含選自SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的序列或與該序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
24.檢測生物樣品中相應(yīng)于玉米事件MON88017的核苷酸存在的方法，該方法包括(a)將所述樣品與第一和第二引物接觸，其中所述第一引物是選自SEQ ID NO3和SEQ ID NO1的至少11個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，所述第二引物是選自SEQ ID NO1和SEQID NO5的反向互補(bǔ)序列的至少11個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列；(b)進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，從而產(chǎn)生復(fù)制子；(c)檢測所述復(fù)制子，其中所述復(fù)制子包含SEQ ID NO1；或者(d)將所述樣品與第一和第二引物接觸，其中所述第一引物是選自SEQ ID NO4和SEQ IDNO2的反向互補(bǔ)序列的至少11個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，所述第二引物是選自SEQ ID NO2和SEQ ID NO5的至少11個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列；(b)進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，從而產(chǎn)生復(fù)制子；和(c)檢測所述復(fù)制子，其中所述復(fù)制子包含SEQ ID NO2。
25.檢測生物樣品中一種或多種玉米事件MON88017多核苷酸的存在的方法，該方法包括(a)將樣品與探針在嚴(yán)格雜交條件下接觸，其中所述探針包含選自SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的序列的連續(xù)核苷酸序列或與該序列互補(bǔ)的連續(xù)核苷酸序列；(b)檢測所述探針與所述樣品的雜交，其中所述探針與所述樣品的所述雜交診斷所述樣品中所述一種或多種玉米事件MON88017多核苷酸的存在。
26.包含選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2和SEQ ID NO5的核苷酸序列的組合物，其中所述組合物是選自玉米粗粉、玉米面、玉米油、玉米須、玉米淀粉以及加工食品的日用品。
27.用于檢測生物樣品中玉米事件MON88017的存在的至少大約11個(gè)到大約20個(gè)連續(xù)核苷酸的探針或引物，其中所述連續(xù)核苷酸選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4和SEQ ID NO5。
28.如權(quán)利要求27中所述的探針或引物，其中所述探針或引物包括選自脫氧核糖核酸、核糖核酸和核苷酸類似物的核苷酸。
29.如權(quán)利要求28中所述的探針或引物，其中所述探針或引物用至少一種熒光團(tuán)標(biāo)記。
30.用于檢測生物樣品中玉米事件MON88017核苷酸的存在的長度為至少大約21個(gè)到大約50個(gè)或更多的連續(xù)核苷酸的探針或引物，選自SEQ ID NO3、SEQ ID NO4和SEQ ID NO5中所示的連續(xù)核苷酸。
31.包含玉米事件MON88017核苷酸序列的商品或日用品，其中所述序列選自SEQ ID NO1和SEQ ID NO2。
32.權(quán)利要求31的商品或日用品，選自玉米油、玉米淀粉、玉米粗粉、玉米面、化妝品和膨脹劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了命名為MON88017的玉米植株以及其所含的DNA組合物。也提供了基于DNA序列檢測玉米植株MON88017存在的分析方法，以及該DNA序列作為分子標(biāo)志在DNA檢測方法中的用途。
文檔編號C12Q1/68GK1933723SQ200480041699
公開日2007年3月21日 申請日期2004年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月15日
發(fā)明者K·A·比茲利, T·R·庫姆, M·E·格羅思, T·B·欣基, J·C·佩爾興, T·T·沃恩, 張蓓 申請人:孟山都技術(shù)有限公司