專利名稱：新的鈉通道的制作方法
新的鈉通道 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
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背景
所有細(xì)胞都依靠無機(jī)離子跨細(xì)胞膜的受調(diào)節(jié)的運(yùn)動(dòng)來進(jìn)行基本的 生理功能。電興奮性、突觸可塑性和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是在其中離子濃度變化 起到重要作用的過程的實(shí)例. 一般地，允許這些變化的離子通道是由 一個(gè)或多個(gè)亞基組成的蛋白質(zhì)孔洞，每個(gè)亞基含有兩個(gè)或多個(gè)跨腹結(jié) 構(gòu)域.大多數(shù)離子通道依靠對(duì)大小和電荷的物理偏愛性對(duì)特定的離 子，主要是Na+、 K\ Ca2+、或CT具有選擇性.電化學(xué)力，而不是主 動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，驅(qū)動(dòng)了離子跨越膜，因而單個(gè)通道可能容許每秒數(shù)百萬的粒 子通過.取決于通道的子類，通道開放、或"閘門"受電壓的變化或 受配體結(jié)合的緊密控制.由于涉及許多生理學(xué)過程，因此離子通道是 吸引人的治療靶點(diǎn)，而產(chǎn)生對(duì)特定組織類型中的特定通道具有特異性 的藥物仍然是主要的挑戰(zhàn).
電壓門控的離子通道響應(yīng)于膜電位的變化而開放.舉例來說，可 興奮細(xì)胞例如神經(jīng)元的去極化引起Na+離子的短暫流入，這傳播了神經(jīng) 沖動(dòng)。這種Na+濃度的變化由電壓門控的K+通道感知，其然后允許1^+離子流出。K+離子的流出使膜復(fù)極化.其他細(xì)胞類型依靠電壓門控的 Ca"通道來產(chǎn)生動(dòng)作電位。在不可興奮細(xì)胞中電壓門控的離子通道也 執(zhí)行重要的功能，例如分泌的調(diào)節(jié)、體內(nèi)平衡過程和有絲分裂過程. 配體門控的離子通道可以由細(xì)胞外的刺激，例如神經(jīng)遞質(zhì)(例如，谷 氨酸、5-羥色胺、乙酰膽堿)或細(xì)胞內(nèi)刺激(例如，cAMP、 Ca"和褲 酸化)打開.
鈉(Na+)通道包括電壓門控的和非電壓門控的種類.電壓門控 的Na+通道介導(dǎo)神經(jīng)元中動(dòng)作電位的再生所需的短暫Na+離子流入. 電壓門控的Na+通道可以進(jìn)一步分為亞型；已經(jīng)克隆了至少九種獨(dú)特 的電壓門控的Na+通道a亞基(Navl.l-1.9)，并已經(jīng)克隆了至少三種 相關(guān)的P亞基.電壓門控的Na+通道的a亞基類似于電壓門控的Ca2+ 通道的a亞基，含有四個(gè)重復(fù)區(qū)域，每個(gè)重復(fù)區(qū)域含有六個(gè)跨膜結(jié)構(gòu) 域。電壓門控的Na+通道在腦、肌肉、心臟、脊髄、子宮和感覺神經(jīng) 元中表達(dá).a亞基與輔助亞基相連，所述輔助亞基通過例如修改a亞 基的門控來調(diào)節(jié)通道的功能。
離子通道功能的遺傳的或藥理學(xué)擾動(dòng)可能具有顯著的臨床后果。 長(zhǎng)QT綜合癥、癲癇癥、嚢性纖維化和偶發(fā)的共濟(jì)失調(diào)是由離子通道亞 基中的突變引起的遺傳性疾病的幾個(gè)實(shí)例，由某些藥物觸發(fā)的毒性副 作用，例如心律不齊和發(fā)作(seizure)是由于對(duì)離子通道功能的干擾 (Sirois and Atchison, TVei/rWojdco/ogy, 17 (1 ) :63-84， 1996; Keating, M.T.，&i'em^272:681-685， 1996).調(diào)節(jié)離子通道活性的藥物具有在治 療許多病理狀況方面的應(yīng)用，包括疼痛、高血壓、心絞痛、心肌缺血、 孝喘、膀胱機(jī)能過度、脫發(fā)、疼痛、心力衰竭、痛經(jīng)、H型糖尿病、 心律不齊、移植排斥、發(fā)作、驚厥、癲癇癥、中風(fēng)、胃運(yùn)動(dòng)過強(qiáng)、精 神病、癌癥、肌肉萎縮和發(fā)作性睡病(Coghlan， M.J.，"a/.，/. CAe肌 44:1627-1653， 2001; Ackerman. M.J.， and Clapham， D.E.，A^ 336:1575-1586,1997).鑒定的離子通道的數(shù)目增多和對(duì)它們的復(fù)雜性 的進(jìn)一步了解今后將有助于在修改離子通道功能的治療方面的努力.
概述
在此提供了新的Na+通道亞基多肽、核酸和所述多肽和核酸的片 段。還提供了使用所述新的亞基多肽、核酸和其片段的方法.在一個(gè)方面，本發(fā)明表征了分離的鈉通道HI型a亞基(mNav1.3 a亞基)多肽，其中所述多肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列，在一 個(gè)實(shí)施方式中，所述多肽基本上由SEQIDNO:2的氨基酸序列組成.
在另一個(gè)方面，本發(fā)明表征了包括SEQ ID NO:2的至少IO個(gè)連 續(xù)氨基酸的分離的mNav1.3 a亞基多肽，其中所述多肽包括以下氨基酸 中的一個(gè)或多個(gè)異亮氨酸289、脯氨酸518、絲氨酸728、絲氨酸1355、 天冬酰胺1909、蘇氨酸1910和纈氨酸1921.
在另一個(gè)方面，本發(fā)明表征了編碼在此描述的多肽的分離的 mNav1.3 a亞基核酸分子，所述多肽例如包括SEQ ID NO:2的氨基酸序 列的鈉通道III類型a亞基(mNav1.3 a亞基)多肽.在一個(gè)實(shí)施方式 中，所述核酸包括SEQIDNO:l的核苷酸序列.在一個(gè)實(shí)施方式中， 所述核酸分子基本上由SEQ ID NO:l的核苷酸序列組成。在一個(gè)實(shí)施 方式中，所述核酸分子是SEQIDNO:l的核酸序列的等位基因.
在另一個(gè)方面，本發(fā)明表征了編碼在此描述的多肽的分離的 mNav1.3 a亞基核酸分子的片段，所述多肽例如包括SEQ ID NO:2的氨 基酸序列的鈉通道III類型a亞基(mNav1.3 a亞基)多肽，在一個(gè)實(shí)
施方式中，所述片段編碼以下的氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)異亮氨酸 289、脯氨酸518、絲氨酸728、絲氨酸1355、天冬酰胺1909、蘇氨酸 1910和纈氨酸1921.
在另一個(gè)方面，本發(fā)明表征了包括與啟動(dòng)子可操作連接的、編碼 在此描述的mNav1.3 a亞基的核酸或其片段的表達(dá)載體.
在另一個(gè)方面，本發(fā)明表征了包括編碼在此描述的mNav1.3 a亞 基的核酸或其片段的宿主細(xì)胞，
在另一個(gè)方面，本發(fā)明表征了與mNavl.3 a亞基多肽優(yōu)先地結(jié)合 的試劑，其中所述多肽包括SEQIDNO:2的氨基酸序列，
在另一個(gè)方面，本發(fā)明表征了與mNav1.3 a亞基多肽選擇性結(jié)合 的試劑，其中所述多肽包括SEQIDNO:2的氨基酸序列，和其中所述 試劑不與鈉通道I型或II型a亞基多肽結(jié)合.在一個(gè)實(shí)施方式中，所 述試刑是小分子、核酸或蛋白.在一個(gè)實(shí)施方式中，所述試劑調(diào)節(jié) mNa4.3a亞基多肽活性.在一個(gè)實(shí)施方式中，所述試劑是抗體或其抗 原結(jié)合片段.在一個(gè)實(shí)施方式中，所述抗體是多克隆抗體或單克隆抗 體。在另一個(gè)方面，本發(fā)明表征了藥物組合物，包括與mNav1.3 a 亞基多肽選擇性結(jié)合的試劑，其中所述多肽包含SEQ ID NO:2的氨基 酸序列；和藥學(xué)上可接受的栽體.
在另一個(gè)方面，本發(fā)明表征了調(diào)節(jié)細(xì)胞中mNav1.3 a亞基多肽活 性的方法，該方法包括提供包括mNavl.3a亞基多肽的鈉通道，其中 所述niNav1,3 a亞基多肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列；使所述通 道與一定量的、有效調(diào)節(jié)所述mNav:L3a亞基多肽的活性的mNav1.3 a 亞基多肽調(diào)節(jié)物接觸.在一個(gè)實(shí)施方式中，所述調(diào)節(jié)物是小分子、核 酸或蛋白.
在另一個(gè)方面，本發(fā)明表征了鑒定調(diào)節(jié)mNav1.3 a亞基多肽活性 的試劑的方法，該方法包括提供包含mNavl.3a亞基多肽的第一鈉通 道，其中所述mNav1.3 a亞基多肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列； 使所迷通道與測(cè)試化合物接觸；以及評(píng)估所述鈉通道的活性，其中相 對(duì)于參考值的活性變化是該化合物是調(diào)節(jié)所述通道的試劑的指示。
在一個(gè)實(shí)施方式中，所述測(cè)試化合物是小分子、肽或核酸.在一 個(gè)實(shí)施方式中，所迷鈉通道包含在生物樣品中，在一個(gè)實(shí)施方式中， 所述通道與多種測(cè)試化合物接觸.
在一個(gè)實(shí)施方式中，所述樣品包含細(xì)胞膜.在一個(gè)實(shí)施方式中， 所述樣品包含細(xì)胞.在一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是真核細(xì)胞.在一 個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是非洲爪塘(Xenopus)卵母細(xì)胞.在一個(gè)實(shí) 施方式中，所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
在一個(gè)實(shí)施方式中，所述活性包括調(diào)節(jié)鈉濃度.在一個(gè)實(shí)施方式 中，所述評(píng)估包括檢測(cè)鈉排出(Sodium flux),在一個(gè)實(shí)施方式中， 所述接觸在不存在測(cè)試化合物的情況下發(fā)生，產(chǎn)生第一鈉排出量.在 一個(gè)實(shí)施方式中，所述評(píng)估包括使用Na+流量分析(Na+flux assay). 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述分析使用膜片鉗電生理學(xué).在一個(gè)實(shí)施方式 中，所述分析使用二電極電壓鉗電生理學(xué).在一個(gè)實(shí)施方式中，所迷 評(píng)估包括使用鈉敏感性染料.在一個(gè)實(shí)施方式中，所述分析是高通量 分析，
在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括步驟提供包含mNay1.3 a亞基多肽的第二鈉通道，其中所述mNav1.3 a亞基多肽不同于第一 mNavl.3a亞基多肽(例如，第二鈉通道不同于包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的mNavl.3tt亞基多肽)；使所述第二鈉通道與所述測(cè)試化合 物接觸；評(píng)估所述第二鈉通道的活性.
該方法可進(jìn)一步包括比較存在測(cè)試化合物的情況下笫一鈉通道的 活性和存在測(cè)試化合物的情況下第二鈉通道的活性.在一個(gè)實(shí)施方式 中，提供了多種鈉通道.
在另一個(gè)方面，本發(fā)明表征了鑒定在治療與鈉通道電流(sodium channel current)調(diào)節(jié)有關(guān)的失調(diào)方面有用的試劑的方法，該方法包 括提供包含mNav1.3 a亞基多肽的鈉通道，其中所述多肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列；使所述通道與測(cè)試化合物接觸；以及評(píng)估所述通 道的活性，其中相對(duì)于參考值的活性變化是所述測(cè)試化合物是在與鈉 電流有關(guān)的失調(diào)方面有用的試劑的指示.在一個(gè)實(shí)施方式中，所述失 調(diào)是疼痛、感覺異常、中風(fēng)、頭外傷、神經(jīng)變性失調(diào)、或與神經(jīng)元的 超興奮性有關(guān)的失調(diào).
所述方法可以進(jìn)一步包括體內(nèi)施用所述化合物(例如，使用動(dòng)物 模型).所述方法可以進(jìn)一步包括為了體內(nèi)使用而修飾所述化合物. 所述方法可以進(jìn)一步包括評(píng)估由所述化合物對(duì)相關(guān)的人類Nav1.3 a亞 基多肽的調(diào)節(jié).
在另一個(gè)方面，本發(fā)明表征了治療患有與鈉通道電流相關(guān)的失調(diào) 的受試者的方法，所述方法包括鑒定選擇性結(jié)合mNavL3a亞基多肽 的試劑，向需要這種治療的受試者施用藥理學(xué)試劑，所述藥理學(xué)試劑 對(duì)于包含mNav1.3 a亞基多肽的鈉通道是有選擇性的.
在一個(gè)實(shí)施方式中，所述失調(diào)是疼痛、感覺異常、中風(fēng)、頭外傷、 神經(jīng)變性失調(diào)、或與神經(jīng)元的超興奮性有關(guān)的失調(diào).
附圖的簡(jiǎn)要說明
附

圖1描述了新的鼠Nav1.3 a亞基氨基酸序列與兩種人類Nav1.3 a 亞基序列和大鼠Nav1.3 a亞基序列的氨基酸序列比對(duì)，
附圖2描述了新的鼠Nav1.3 a亞基氨基酸序列與GenBank Acc. No.NM一018732的部分核苷酸序列編碼的氨基酸序列的氨基酸序列比 對(duì)。來自克隆mNavl.3野生型的預(yù)測(cè)的氨基酸序列與公開的部分小鼠 NavL3蛋白(登記號(hào)碼NM—018732)進(jìn)行比對(duì).相同的殘基高亮度顯 示，終止密碼子顯示為灰色，部分小鼠mNavl.3蛋白與克隆mNavl.3的比對(duì)從氨基酸853到1115.264-289的區(qū)域可能代表mNavl.3的可變 剪接區(qū)域.
附圖3是描述用新的鼠Nav1.3 a亞基轉(zhuǎn)染的、以一定電壓范閨去極 化的非洲爪蟾印母細(xì)胞中的鈉電流的圖表，
附圖4是描述用新的鼠Nav1.3 a亞基轉(zhuǎn)染的、以一定電壓范圍去極
化的非洲爪蟾卵母細(xì)胞中平均電流/電壓相互關(guān)系的圖表， 附圖5描述SEQ IDNOs:l-ll。
詳細(xì)說明
本發(fā)明部分基于對(duì)新的Na+通道III型a (Nav1.3 )亞基的鑒定. 該新的cDNA是從鼠腦組織分離的.該cDNA的編碼序列(SEQ ID NO:l)相應(yīng)于表l中所示序列的核苷酸8到核苷酸5947.該新的亞基 的預(yù)測(cè)的氨基酸序列在SEQ ID NO:2示出.在GenBank⑧中登記號(hào)碼 NM一006922、 AF225986和NM一013U9中發(fā)現(xiàn)了相關(guān)的人類和大鼠亞 基核苷酸序列(SEQIDNO:4、 SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8).已 經(jīng)克隆了相關(guān)的鼠Na+通道cDNA的片段，在GenBank⑧登記號(hào) NM—018732 (SEQ ID NO:IO)中發(fā)現(xiàn).SEQ ID NO:2與這個(gè)序列的比 對(duì)在附圖2中示出.
該新的鼠核酸序列含有與相關(guān)的人類和大鼠序列相比的差別.預(yù) 計(jì)這些差別編碼了獨(dú)特的多肽序列.在附圖1中描述了該新的小鼠 3+ 通道a亞基的預(yù)測(cè)的氨基酸序列與相關(guān)的大鼠和人類亞基進(jìn)行的比 對(duì)，
電壓門控的Na+通道
電壓門控的Na+通道是多亞基跨膜蛋白，具有大約260千道爾頓 (kD)的a亞基、大約35 kD的P 1亞基和大約35 kD的P 2亞基。這 些通道介導(dǎo)鈉離子流入細(xì)胞.a亞基形成通道的電壓敏感性的成孔部 分，p亞基調(diào)節(jié)a亞基的門控和細(xì)胞 一 細(xì)胞相互作用，Na+通道的ot亞 基含有四個(gè)重復(fù)的結(jié)構(gòu)域(I-IV).這些重復(fù)結(jié)構(gòu)域的每一個(gè)都含有六 個(gè)跨膜片段(S1感S6)(綜述在Baker， MD， and Wood, JN. rremfa !Vi 泡,m22 ( 1 ) :27-31， 2001 ) a
電壓門控的Na+通道響應(yīng)膜極化的變化經(jīng)歷靜止(極化；關(guān)通道； 可激活)、開放(去極化；開通道；激活)和關(guān)閉(去極化，關(guān)通道；鈍化)狀態(tài)的循環(huán).大多數(shù)電壓門控的Na+通道從開放快速地(即，數(shù) 毫秒內(nèi))關(guān)閉.離子導(dǎo)電a亞基的帶電區(qū)域?qū)δO化的變化敏感。
Na+通道允許電脈沖在可興奮細(xì)胞中產(chǎn)生和傳播.舉例來說，在 初級(jí)感覺神經(jīng)元(例如，脊后根神經(jīng)節(jié)(DRG)神經(jīng)元、三叉神經(jīng)神 經(jīng)元)中表達(dá)的Na+通道響應(yīng)刺激產(chǎn)生去極化上升支，其也是感覺信息 的傳遞所需的.
根據(jù)對(duì)河豚毒素(TTX)抑制的敏感性可以辨別Na+通道的亞型， 河豚毒素是河豚表達(dá)的胍鹽毒素.TTX以納摩爾范圍內(nèi)的濃度阻斷 Navl.l、 Navl,2和Nav1.3 a亞基通道的活性.通道的所有三種類型都 在腦中表達(dá).響應(yīng)于損傷的Na+通道水平的去調(diào)節(jié)(disregulation)可 以導(dǎo)致神經(jīng)元Na+通道的超興奮性.這種類型的去調(diào)節(jié)被認(rèn)為促進(jìn)了 慢性疼痛.例如，軸突橫斷引起某些Na+通道的下調(diào)和Nav1.3 a亞基 通道的上調(diào)(綜述在Waxman，S,G.，iVa似re及ev. 2:652-659， 2001)，這 導(dǎo)致神經(jīng)元的不適當(dāng)?shù)闹貜?fù)發(fā)放(firing).
如在此使用的，"鈉通道a亞基"或"Na+通道a亞基"是指在 細(xì)胞，例如神經(jīng)元細(xì)胞，例如，背根神經(jīng)節(jié)中涉及接收、傳導(dǎo)和發(fā)送 信號(hào)的蛋白。"鼠Na4.3a亞基"或"mNav1.3 a亞基"是指在此描述 的鼠的HI型a亞基.
如在此使用的，"Na+通道介導(dǎo)的活性"是指涉及Na+通道，例如， 腦細(xì)胞或肌細(xì)胞中的Na+通道的活性、功能或反應(yīng).Na+通道介導(dǎo)的活 性是在例如神經(jīng)系統(tǒng)(例如，中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng))、肌肉 組織、心臟組織和其他細(xì)胞和組織中接收、傳導(dǎo)和發(fā)送信號(hào)所涉及的 活性.Na+通道介導(dǎo)的活性包括，例如，Na+流入細(xì)胞的調(diào)控和感覺刺 激的傳遞.并且，如在此可互換使用的，"Na+通道a亞基活性"、"mNav1.3 通道活性"、"Na+通道a亞基的生物學(xué)活性"、或"Na+通道a亞基 的功能活性"，是指Na+通道a亞基蛋白、多肽或核酸分子的活性、功 能或反應(yīng)。
本發(fā)明的分離的蛋白，例如在此描述的mNav1.3 a亞基蛋白，具 有與SEQIDNO:2的氨基酸序列足夠同源的氨基酸序列，或由與SEQ IDNO:l足夠同源的核苷酸序列編碼，如在此使用的，術(shù)語"足夠同源 的"是指第一氨基酸或核苷酸序列，其含有與第二氨基酸或核苷酸序 列足夠或最小數(shù)量的同一或等同(例如，具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基)有共同的結(jié)構(gòu)域或基序或共同的功能活性.編碼SEQ ID NO:2的SEQ ID NO:l的核苷酸序列的所有筒并變體都認(rèn)為是與SEQ ID NO:l "足 夠同源的".
因此，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式表征了具有niNav1.3 a亞基活性
的分離的11^3^.3 0[亞基蛋白和多肽、片段和其變體.
長(zhǎng)度約5940個(gè)核苷酸的新的mNav1.3 a亞基編碼序列(SEQ ID NO:l)編碼長(zhǎng)度約1980個(gè)氨基酸殘基的蛋白.編碼這個(gè)新的亞基的基 因在腦中表達(dá)，例如，在腦、心臟和骨骼肌中表達(dá)Na"J通道.Nav1.3 通道可以在給定組織中以低水平或高水平表達(dá).某些在神經(jīng)元中表達(dá) 的Nav1.3通道在神經(jīng)元損傷后被上調(diào)(Waxman， SG， et al. J5/vw"及d 8886:5-14， 2000; Kim， CH， et al. MoZ. J5nn/t及d 95:153-161， 2001 ),
在以下小節(jié)中進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明的多種方面.
分岸^凝拔為、于
本發(fā)明的一個(gè)方面涉及編碼niNav1.3 a亞基多肽或其生物學(xué)活性
部分的分離的核酸分子，以及核酸片段，其足以用作雜交探針來鑒定 編碼在此描述的mNav1.3 a亞基的相關(guān)同種型的核酸分子，和用作PCR 引物用于mNav1.3 a亞基核酸分子的擴(kuò)增或突變的片段.如在此使用 的，術(shù)語"核酸分子"意圖包括DNA分子(例如，cDNA或基因組DNA) 和RNA分子(例如，mRNA )和使用核苷酸類似物產(chǎn)生的DNA或RNA 的類似物.核酸分子可以單鏈的或雙鏈，但優(yōu)選的是雙鏈DNA,
"分離的"核酸分子是與存在于該核酸的天然來源中的其他核酸 分子分離了的核酸分子."分離的"核酸不含在得出所述核酸的有機(jī) 體的基因組DNA中天然地側(cè)翼于所述核酸的序列(即，位于所述核酸 的5，和3，末端的序列).例如，在各種實(shí)施方式中，分離的mNav:L3a 亞基核酸分子可以含有少于約5kb、 4kb、 3 kb、 2kb、 1 kb、 0.5 kb或 0.1 kb的核苦酸序列，所述核苷酸序列在得出所述核酸的細(xì)胞的基因組 DNA中天然地側(cè)翼于所述核酸分子.此外，"分離的"核酸分子，例 如cDNA分子，當(dāng)通過重組技術(shù)產(chǎn)生時(shí)可以基本上不含其他細(xì)胞物質(zhì)、 或培養(yǎng)基，或當(dāng)化學(xué)合成時(shí)可以基本上不含化學(xué)藥品前體或其他化學(xué) 藥品?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)和在此提供的序列信息來分離本
發(fā)明的核酸分子，例如具有SEQ ID NO:l的核苷酸序列的核酸分子， 或其部分.使用SEQ ID NO:l的核酸序列的全部或部分作為雜交探 針，可以使用標(biāo)準(zhǔn)的雜交和克隆技術(shù)分離mNav1.3 ct亞基核酸分子。(例 如,描述于Sambrook, J.， Fritsh， E. F.， and Maniatis， T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd， ed.， Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor， N.Y"1989),
此外，包括SEQIDNO:l的全部或部分的核酸分子可以使用根據(jù) SEQ ID NO:l的序列設(shè)計(jì)的合成寡核苷酸引物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)來分離.
本發(fā)明的核酸可以使用cDNA、 mRNA或可選擇地使用基因組 DNA作為模板和合適的寡核苷酸引物根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增技術(shù)來擴(kuò) 增.這樣擴(kuò)增的核酸可以被克隆到合適的栽體中并通過DNA序列分析 來表征.此外，可以通過標(biāo)準(zhǔn)的合成技術(shù)，例如，使用自動(dòng)化DNA合 成儀來制備相應(yīng)于Na+通道a亞基核苷酸序列的寡核苷酸.
在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的分離的核酸分子包含mNav1.3 a 亞基核酸分子，其是SEQIDNO:l所示核苷酸序列的互補(bǔ)物，或這些 核苷酸序列的部分.與SEQ ID NO:l所示核苷酸序列互補(bǔ)的核酸分子 是一種與SEQ ID NO:l所示核普酸序列足夠互補(bǔ)從而可以與SEQ ID NO:l所示核苷酸序列雜交的核酸分子.
在再另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的分離的核酸分子包含與SEQ ID NO:l所示核苷酸序列的完整長(zhǎng)度有至少約75。/。、 85%、 95%或更高同 源性的核苷酸序列，或這個(gè)核苷酸序列的部分。
此外，本發(fā)明的核酸分子可以僅包含SEQIDNO:l的核酸序列的 一部分，例如，能用作探針或引物的片段或編碼mNavl.3a亞基蛋白的 生物學(xué)活性部分的片段.根據(jù)克隆mNav1.3 a亞基cDNA確定的核苷酸
序列容許產(chǎn)生探針和引物，其被設(shè)計(jì)用于從其他物種鑒定和/或克隆相 關(guān)的同種型以及同源物.所述探針/引物一般包含基本上純化的寡核苷 酸。所述寡核苷酸一般包含在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO:l的正義序 列、或SEQIDNO:l的反義序列、或SEQ ID NO:l的天然發(fā)生的等位 變體或突變體的至少約12或15個(gè)、優(yōu)選的約20或25個(gè)、更優(yōu)選的約30、 35、 40、 45、 50、 55、 60、 65或75個(gè)連續(xù)核苷酸雜交的核苷酸序 列區(qū)域.
根據(jù)mNa4.3 a亞基核苷酸序列的探針可以用于檢測(cè)編碼相關(guān)同 種型的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物.所述探針可進(jìn)一步包括連接于其上的標(biāo)記基團(tuán)，例 如，所述標(biāo)記基團(tuán)可以是放射性同位素、熒光化合物、酶或酶輔因子， 這種探針可用作診斷測(cè)試試劑盒的部分，用于鑒定表達(dá)或錯(cuò)誤表達(dá) mNavl,3tt亞基蛋白的細(xì)胞或組織，例如，通過測(cè)量來自受試者的細(xì)胞 樣品中編碼mNavl,3a亞基的核酸的水平，例如，檢測(cè)邁Nayl.3a亞基 mRNA水平或測(cè)定在將會(huì)影響mNav1.3 a亞基同種型表達(dá)的區(qū)域中基 因組mNav1.3 a亞基基因是否已經(jīng)突變或刪除.
通過分離編碼具有mNav1.3 a亞基生物學(xué)活性(在此描述了 mNavl.3a亞基蛋白的生物學(xué)活性)的多肽的、SEQIDNO:l的核苷酸 序列的一部分，表達(dá)所編碼的mNavl.3a亞基蛋白的部分(例如，通過 體外重組表達(dá))，并評(píng)定所編碼的mNavl.3 tt亞基蛋白的部分的活性，
可制備編碼"11^34.3(1亞基蛋白的生物學(xué)活性部分"的核酸片段。
本發(fā)明進(jìn)一步包括，由于遣傳密碼的簡(jiǎn)并性而不同于SEQ ID NO:l所示的核苷酸序列、并由此編碼與SEQIDNO:l所示核苷酸序列 所編碼的相同的mNav1.3 a亞基蛋白的核酸分子.在另一個(gè)實(shí)施方式
中，本發(fā)明的分離的核酸分子具有編碼一蛋白的核普酸序列，所述蛋 白具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列.
除了 SEQ ID NO:l所示的mNav1.3 a亞基核苷酸序列之外，本領(lǐng) 域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是，在群體中可能存在著導(dǎo)致mNav1.3 a亞基蛋 白的氨基酸序列變化的DNA序列多態(tài)性.由于天然的等位變異，這種 在mNav1.3 a亞基基因中的遺傳多態(tài)性可能存在于群體的個(gè)體之間.如 在此使用的，術(shù)語"基因"和"重組基因"是指包含編碼mNav1.3 a
亞基蛋白的開放閱讀框的核酸分子.這種天然的等位變異一般可引起 mNav1.3 a亞基基因的核苷酸序列中1-5%的變化，在mNav1.3 a亞基
基因中，作為天然等位變異的結(jié)果并且不改變mNav1.3 a亞基蛋白的功 能活性的、任何的和所有的這種核苷酸變異以及產(chǎn)生的氨基酸多態(tài)
性，都包括在本發(fā)明的范閨之內(nèi).
此外，編碼其他mNav1.3 a亞基通道家族成員并由此具有不同于 SEQ IDNO:l的mNav1.3 a亞基序列的核芬酸序列的核酸分子，包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi).例如，根據(jù)mNavl.3a亞基的核苷酸序列(例如， SEQIDNO:l)可以鑒定另一個(gè)mNavl,3a亞基cDNA,此外，編碼來
自不同物種的mNav1.3 a亞基蛋白并由此具有不同于SEQ ID NO:l的 mNavl.3a亞基序列的核苷酸序列的核酸分子，包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi).
相應(yīng)于本發(fā)明的mNav1.3 a亞基cDNA的天然等位變體和同源物 的核酸分子，可以根據(jù)它們與在此公開的mNav1.3 a亞基核酸的同源性 使用在此公開的cDNA或其部分作為雜交探針根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)雜交技術(shù)在嚴(yán) 格雜交條件下來分離.
因此，在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的分離的核酸分子長(zhǎng)度是至 少15、20、25、30或更多個(gè)核苷酸，并在嚴(yán)格條件下與包含SEQ ID NO:l 的核苷酸序列的核酸分子雜交.優(yōu)選的，所述分子在高度嚴(yán)格條件下 雜交.在其他實(shí)施方式中，所述核酸長(zhǎng)度是至少30、 300、 500、 700、 850、 950或2000個(gè)核苷酸.如在此使用的，術(shù)語"在嚴(yán)格條件下雜交" 意圖是描述雜交和洗滌的條件，在這種條件下彼此具有至少60%、 85 %或95%同源性的核苷酸序列一般仍然相互雜交.雜交條件是本領(lǐng)域 技術(shù)人員已知的，可以在Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y.， 6.3 a subuniU-6.3 a subunit.6, 1991中找到.中度 雜交條件定義為相當(dāng)于在2X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中在30TC下雜 交，隨后在IXSSC、 0.1% SDS中在50TC下洗滌，高度嚴(yán)格條件定義 為相當(dāng)于在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中在45TC下雜交，隨后在0.2 XSSC、 0.1%SDS中在651C下洗滌.
在中度或高度嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO:l的序列雜交的本發(fā)明 的分離的核酸分子可以相應(yīng)于天然發(fā)生的核酸分子.如在此使用的，
"天然發(fā)生的"核酸分子是指具有在自然中發(fā)生的核苷酸序列的RNA 或DNA分子(例如，編碼天然蛋白).
除了可能存在于群體中的mNav1.3 a亞基序列的天然發(fā)生的等位 變體之外，本領(lǐng)域技術(shù)人員將進(jìn)一步理解的是，可以通過突變向SEQ ID NO:l的核苷酸序列中導(dǎo)入變化，從而引起所編碼的mNav1.3 a亞基蛋 白的氨基酸序列的變化，而不改變mNa4,3a亞基蛋白的功能能力.例 如，可以在SEQlDNO:l的序列中進(jìn)行導(dǎo)致在"非必需"氨基酸殘基
."非必需"氨基酸殘基是可以在mNav1.3a亞基的野生型序列中改變而不改變生物學(xué)活性的殘基，而"必需"氨 基酸殘基是生物學(xué)活性所需的，例如，在本發(fā)明的mNavL3a亞基蛋白 之間保守的氨基酸殘基，預(yù)計(jì)是特別不能改變的.此外，在本發(fā)明的 mNav1.3 a亞基蛋白和其他mNav1.3 a亞基通道亞基之間保守的其他氨 基酸殘基很可能是不能改變的.
因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及編碼mNa4.3 a亞基蛋白的核酸 分子，所述mNavl,3a亞基蛋白含有對(duì)于活性不必需的氨基酸殘基的變 化.這種mNav1.3 a亞基蛋白在氨基酸序列上與SEQ ID NO:2不同， 而又保持了生物學(xué)活性.生物學(xué)活性可以通過在此描述的分析來測(cè) 量，例如Na+通道活性分析，例如Na+流入分析，在一個(gè)實(shí)施方式中， 分離的核酸分子包含編碼一蛋白的核苷酸序列，其中所述蛋白包含與 SEQIDNO:2有至少約65。/。、 75%、 85%、 95%或更高同源性的氨基
酸序列.
可以通過向SEQ ID NO:l的核苷酸序列中導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)核苷 酸替換、添加或刪除，從而在所編碼的蛋白中導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)氨基酸 替換、添加或刪除，來產(chǎn)生編碼與SEQID NO:2的蛋白同源的mNav1.3 a亞基蛋白的分離的核酸分子.可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如定點(diǎn)誘變和 PCR介導(dǎo)的誘變來向SEQIDNO:l中導(dǎo)入突變，可以在一個(gè)或多個(gè)預(yù) 測(cè)的非必需氨基酸殘基處進(jìn)行保守性氨基酸替換，"保守性氨基酸替 換"是在其中氨基酸殘基被替換為具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的一種 替換.本領(lǐng)域已經(jīng)定義了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族.這些家 族包括帶有堿性側(cè)鏈(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈 (例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電極性側(cè)鏈(例如，甘氨酸、天 冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性 側(cè)鏈(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨 酸、甲硫氨酸、色氨酸)、beta-分支的側(cè)鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、 異亮氨酸)和芳香族側(cè)鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨 酸)的氨基酸.由此，在mNavl.3a亞基蛋白中預(yù)測(cè)的非必需氨基酸殘 基優(yōu)選的被來自相同側(cè)鏈家族的另 一個(gè)氨基酸殘基替換。在對(duì)SEQ ID NO:l誘變之后，可以表達(dá)編碼的蛋白并且可以測(cè)定該蛋白的活性。
可以分析突變mNavl,3a亞基蛋白的(1)與非mNav1.3 a亞基蛋 白質(zhì)分子，例如，Na+通道pi或p2亞基，或TTX相互作用；或(2)調(diào)節(jié)膜興奮性的能力.
除了如上所述編碼mNav1.3 tt亞基蛋白的核酸分子之外，本發(fā)明 的另一個(gè)方面涉及與其反義的分離的核酸分子."反義"核酸包含與 編碼蛋白的"正義"核酸互補(bǔ)的核苷酸序列，例如，與雙鏈cDNA分 子的編碼鏈互補(bǔ)，或與mRNA序列互補(bǔ).因此，反義核酸可以與有義 核酸氫結(jié)合(hydrogen bond).反義核酸可以與整個(gè)mNav1.3 a亞基 編碼鏈互補(bǔ)，或僅與其一部分互補(bǔ).在一個(gè)實(shí)施方式中，反義核酸分 子與編碼mNa4,3a亞基的核苷酸序列的編碼鏈的"編碼區(qū)"反義.術(shù) 語"編碼區(qū)"是指包含被翻譯成氨基酸殘基的密碼子的核苷酸序列區(qū) 域(例如，mNavl,3a亞基的編碼區(qū)相應(yīng)于SEQIDNO:l).在一個(gè)實(shí) 施方式中，反義核酸分子與編碼mNav1.3 a亞基的核苷酸序列的編碼鏈 的"非編碼區(qū)"反義.術(shù)語"非編碼區(qū)"是指?jìng)?cè)翼于編碼區(qū)不被翻譯 成氨基酸的5，和3，序列(即，也稱為5，和3，非翻譯區(qū)).
給出在此公開的編碼mNav1.3 a亞基的編碼鏈序列(例如，SEQ ID NO:l)，本發(fā)明的反義核酸可以根據(jù)Watson和Crick堿基配對(duì)的規(guī)則 來設(shè)計(jì).反義核酸分子可以與mNav1.3 a亞基mRNA的完整編碼區(qū)互 補(bǔ)，但更優(yōu)選的是與mNav1.3 a亞基mRNA的編碼或非編碼區(qū)的僅一 部分反義的寡核苷酸.例如，反義寡核苷酸可以與圍繞著mNav1.3 a 亞基mRNA的翻譯起始位點(diǎn)的區(qū)域互補(bǔ).反義寡核苷酸的長(zhǎng)度可以 是，例如，約5、 10、 15、 20、 25、 30、 35、 40、 45或50個(gè)核苷酸. 本發(fā)明的反義核酸可以使用化學(xué)合成和酶連接反應(yīng)使用本領(lǐng)域已知的 方法來構(gòu)建.例如，可以使用天然發(fā)生的核苷酸或不同地修改的核苷 酸來化學(xué)合成反義核酸(例如，反義寡核苷酸)，目的是提高分子的 生物學(xué)穩(wěn)定性或提高反義和正義核酸之間形成的雙鏈體的物理穩(wěn)定 性，例如，可以使用硫代磷酯衍生物和吖啶取代的核苷酸.可用于產(chǎn) 生反義核酸的修改的核苷酸的實(shí)例包括5-氟尿嘧咬、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧咬、5-碘尿嘧啶、次黃噪呤、黃噪呤、4-acetylcy tosine、 5-(羧 基鞋基甲基)尿嘧咬，1，5-carboxymethylami nomethyl-2-硫尿嘧咬、5-
黃苷、N6-異丙烯基腺嘌呤、1-甲基鳥噪呤、1-甲基次黃苷、2，2-二甲基 鳥噪呤、2-甲基腺噪呤、2-甲基鳥噪呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、 N6-腺噪呤、7-甲基鳥嚷呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-
氫尿嘧咬、beta-D-galactosylqueosine、 次硫尿嘧焚、beta-D-mannosylqueosiiie、 5 ,-甲氧基羧甲基尿嘧梵、5-甲 氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、 wybutoxosine、偽尿嘧咬、queosine、 2-碟胞嘧咬、5-甲基-2-疏尿嘧咬、 2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、S-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、尿 嘧啶-5-氧乙酸(v) 、 5-甲基-2-硫尿嘧啶、3- (3-氨基-3-N-2-羧丙基) 尿嘧啶和2，6-二氨基嘌呤.做為選擇，可以使用表達(dá)栽體生物學(xué)地產(chǎn)生 反義核酸，在所述表達(dá)栽體中已經(jīng)按反義方向亞克隆了核酸(即，從 該插入的核酸轉(zhuǎn)錄的RNA將是感興趣的目標(biāo)核酸的反義反向的，在以 下小節(jié)中進(jìn)一步描迷了).
一般地將本發(fā)明的反義核酸分子施用給受試者或在原位產(chǎn)生，從 而它們與編碼mNav1.3 a亞基蛋白的細(xì)胞mRNA和/或基因組DNA雜 交或結(jié)合，從而抑制該蛋白的表達(dá)，例如，通過抑制轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。 根據(jù)常規(guī)的核苷酸互補(bǔ)性進(jìn)行雜交來形成穩(wěn)定的雙鏈體，或，例如， 對(duì)于與DNA雙鏈體結(jié)合的反義核酸分子來說，通過雙螺旋的大溝中的 特異性相互作用來雜交.本發(fā)明的反義核酸分子的施用途徑的實(shí)例包 括在組織部位直接注射.做為選擇，可以修改反義核酸分子以靶向選 定的細(xì)胞，然后全身地施用.例如，對(duì)于全身性施用，可以修改反義 分子使得它們特異性結(jié)合選定細(xì)胞表面表達(dá)的受體或抗原，例如，通 過將反義核酸分子連接到與細(xì)胞表面受體或抗原結(jié)合的肽或抗體上。 也可以施用在此描述的栽體將反義核酸分子遞送給細(xì)胞.為了達(dá)到反 義分子的足夠的細(xì)胞內(nèi)濃度，預(yù)想了栽體構(gòu)建體，在其中反義核酸分 子被置于強(qiáng)pol H或pol III啟動(dòng)子的控制下.
在又一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的反義核酸分子是a-異頭核酸分 子.a-異頭核酸分子與互補(bǔ)RNA形成特殊的雙鏈雜交物，其中，與普 通的P單元相反,鏈?zhǔn)窍嗷テ叫械?Gaultier et al. 7V"c7e/c JaVfa. 15:6625-6641， 1987).反義核酸分子也可以包含2 '-o-甲基核糖核苷酸 (Inoue et al. ( 1987) iV"c/e!c爿c!Vfc15:6131-6148)或嵌合的 RNA-DNA類似物(Inoue et al. Ffi^S JLe汰215:327-330， 1987 ),
在再另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的反義核酸是核酶。核酶是具有 核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，其能夠裂解含有與它們互補(bǔ)的區(qū) 域的單鏈核酸，例如，mRNA,因而，核酶(例如，錘頭核酶(描述于 (Haselhoff and Gerlach iV似",e 334:585-591， 1988))可用于催化性裂解mNav1.3 a亞基mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物從而抑制mNav1.3 a亞基mRNA的 翻譯.可以根據(jù)在此公開的mNavl,3a亞基cDNA的核苷酸序列(即， SEQ ID NO:l)設(shè)計(jì)具有對(duì)mNav1.3 a亞基編碼核酸的特異性的核酶. 例如，可以構(gòu)建四膜蟲L"19IVSRNA的衍生物，其中活性部位的核苷 酸序列與mNav1.3 a亞基編碼mRNA中要裂解的核苷酸序列互補(bǔ).參 見，例如，Cech et al.美國(guó)專利No.4，987，071;和Cech et al.美國(guó)專利 No.5，116，742,做為選擇，mNav1.3 a亞基mRNA可用于從RNA分子庫 (pool)中挑選具有特異性核糖核酸酶活性的催化性RNA,參見，例 如，Bartel， D. and Szostak， J. W. Scie/ice 261:1411-1418， 1993.
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，RNA干擾(RNAi)可以用于抑制 mNavl.3tt亞基蛋白的表達(dá).可以降低各種抑制性RNAi分子，那些抑 制mNav1.3 a亞基表達(dá)的分子可以配制為藥物組合物，來在在此描述的 治療方法中施用。
RNAi是一種術(shù)語，用于指一種機(jī)制，通過這種機(jī)制特定的mRNA 在宿主細(xì)胞中被降解，為了抑制mRNA，相應(yīng)于待沉默的基因(例如， 編碼mNa4.3 a亞基多肽的基因)的一部分的雙鏈RNA (dsRNA)被 導(dǎo)入到細(xì)胞中.dsRNA被消化成21-25個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的雙鏈體，稱為 短干擾RNA (或siRNA)，其與核酸酶復(fù)合物結(jié)合形成所稱的RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC).通過在siRNA鏈之一和內(nèi)源mRNA之 間的堿基配對(duì)相互作用，RISC靶向同源的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物.它然后裂解 mRNA的從siRNA 3，端起約12個(gè)核苷酸.(參見Sharp " a/.， Ge/ies "ev. 15:485-490， 2001， and Hammond " fl/" iVa似re及ev. (Jew. 2:110-119, 2001).研究在人類細(xì)胞，包括人類胚腎細(xì)胞和Hela細(xì)胞中成功地證 明了RNAi(參見，例如，Elbashir W a/.，7Vfl似re 411:494-498， 2001). 通過進(jìn)行RNA發(fā)夾序列的內(nèi)源表達(dá)(參見Paddison " fl/.， iVoc. A^/. Jcarf. 99:1443-1448， 2002)或通過小的(21-23nt) dsRNA的
轉(zhuǎn)染(綜述在Caplen，7VemfeiVi歷WecA. 20:49-51,2002)，可以在哺乳
動(dòng)物細(xì)胞中誘導(dǎo)基因沉默。
RNAi技術(shù)利用了標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)方法.dsRNA(在此，例如， 其相應(yīng)于編碼mNav1.3 a亞基多肽的序列)可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法產(chǎn)生(例 如，通過用T7 RNA聚合酶同時(shí)轉(zhuǎn)錄相應(yīng)于mNav1.3 a亞基序列的模板 DNA的兩條鏈；RNA也可以化學(xué)合成或重組產(chǎn)生).生產(chǎn)dsRNA的試劑盒是商業(yè)上可獲得的(來自，例如，New England Biolabs，Inc), 用于介導(dǎo)RNAi的RNA可以包括合成的或修改的核苷酸，例如硫代磷 酯核普酸。用dsRNA或用工程化以產(chǎn)生dsRNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方 法也是本領(lǐng)域常規(guī)的.
已經(jīng)報(bào)道了在用mRNA-cDNA雜交構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中 與RNAi所觀察到的相類似的基因沉默效果(Lin "a/.，歷oc/^饑 J8/印/^s.281:639-644， 2001)。因此，含有mNav1.3 a亞基 序列的mRNA-cDNA雜交物，以及含有mNav1.3 a亞基序列的雙鏈體 (例如，含有21-23 bp單體的雙鏈體)，在本發(fā)明的范圍之內(nèi).可以 根據(jù)在此描述的分析測(cè)試雜交物和雙鏈體的活性(即，它們可以充當(dāng) 測(cè)試試劑)，展現(xiàn)出抑制活性的那些可以用來治療患者，所述患者患 有，或可能發(fā)展出與mNavl.3a亞基活性有關(guān)的疾病或狀況，例如神經(jīng)
性疼痛.
本發(fā)明的dsRNA分子(相應(yīng)于mNav1.3 a亞基基因的一部分的雙 鏈RNA分子)可以按各種方式變化，例如，它們可以包括3，羥基以及， 如上所述，可以含有21、 22或23個(gè)連續(xù)核苷酸的鏈.此外，在3，末 端、5，末端、或在兩端，它們可以是平端的，或包括突出末端.例如， RNA分子的至少一條鏈可以具有長(zhǎng)度約1到約6個(gè)核苷酸的3，突出(例 如，1-5、 1-3、 2-4或3-5個(gè)核苷酸(無論是嘧啶核苷酸還是嘌呤 核苷酸).當(dāng)兩條鏈都包括突出時(shí)，對(duì)于每條鏈，突出的長(zhǎng)度可以是 相同的或不同的.為了進(jìn)一步提高RNA雙鏈體的穩(wěn)定性，可以針對(duì)降 解來穩(wěn)定3，突出(通過，例如，包括入噪呤核苷酸，例如腺苷酸或?yàn)?嚷呤核苷酸，或通過修改的類似物替換嘧啶核苷酸(例如，用2'-脫 氧胸腺嘧啶核苷來替換尿嘧啶核苷2核苷酸3，突出的替換，有耐受性 并且不影響RNAi的效率)，構(gòu)成雙鏈體或雜交抑制物的，或僅作為反 義RNA寡核苷酸的單鏈mNav1.3 a亞基RNA分子，也在本發(fā)明的范 圍之內(nèi)。任何dsRNA都可以用于本發(fā)明的方法，只要它與感興趣的目 標(biāo)基因，例如，mNa4.3a亞基基因有足夠介導(dǎo)RNAi的同源性.雖然 如上所述雙鏈體具有21-23個(gè)核苷酸，但本發(fā)明不受此限制；在可以 施用的dsRNA的長(zhǎng)度方面沒有上限(例如，dsRNA可以從基因的約21 個(gè)堿基對(duì)到基因的全長(zhǎng)，或更多(例如，50-100、 100-250、 250-500、 500-1000，或超過1000個(gè)堿基對(duì)).當(dāng)將這些核酸施用給人類時(shí)，它們可以降低mNavl,3 a亞基 mRNA水平，從而抑制mNav1.3 a亞基的表達(dá)，將細(xì)胞或有機(jī)體維持 在某些情況下，在這些情況中mNav1.3 a亞基mRNA被降解，從而在 細(xì)胞或有機(jī)體中介導(dǎo)RNAi.做為選擇，可以從個(gè)體獲得細(xì)胞，在體外 處理，并重新導(dǎo)入到個(gè)體中.
在又一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的mNav1.3 a亞基核酸分子可以在 堿基部分、糖部分或磷酸醋主干進(jìn)行修改來改善，例如，分子的穩(wěn)定
主干來產(chǎn)生肽核酸，(參見Hyrup B. et al. 說'卯rgflm'c在Aferf/ci/tfl/ CAe附^/j 4( 1): 5-23， 1996).如在此使用的，術(shù)語"肽核酸"或"PNA" 是指核酸模擬物例如DNA模擬物，在其中脫氧核糖褲酸醋主干被偽肽 主千替代，僅保留四個(gè)天然的核堿基.已經(jīng)顯示了 PNA的中性主干允 許在低離子強(qiáng)度的條件下與DNA和RNA特異性雜交.可以使用標(biāo)準(zhǔn) 的固相肽合成方案，例如在Hyrup B. et al. supra; Perry-O'Keefe et al. 尸wc. iVW/. Jcarf. 5W. 93: 14670-675， 1996中描述的，來進(jìn)行RNA寡聚 物的合成.
mNav1.3 ot亞基核酸分子的PNA可以用于治療和診斷應(yīng)用.例 如，PNA可以用作反義或抗基因(antigene)試劑，用于通過例如誘導(dǎo) 轉(zhuǎn)錄或翻譯延滯或抑制復(fù)制來序列特異性地調(diào)節(jié)基因表達(dá).mNav1.3 a 亞基核酸分子的PNA也可以用于基因中的單堿基對(duì)突變分析，(例如， 通過PNA指導(dǎo)的PCR鉗)；當(dāng)與其他酶組合使用時(shí)作為"人工限制 性內(nèi)切酶"，(例如，SI核酶(Hyrup B.,同上))；或作為探針或 引物用于DNA測(cè)序或雜交(Hyrup B. et al"同上；Perry-O'Keefe, 同上)。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，通過給PNA連接親油性的或其他輔助基 團(tuán)，通過PNA-DNA嵌合體的形成，或通過使用脂質(zhì)體或本領(lǐng)域已知 的其他藥物遞送技術(shù)，可以修改mNav1.3 a亞基的PNA (例如，來增 強(qiáng)它們的穩(wěn)定性或細(xì)胞攝取).
在其他實(shí)施方式中，寡核苷酸可以包括其他附加的基團(tuán)，例如肽 (例如，用于體內(nèi)靶向宿主細(xì)胞受體)，或促進(jìn)跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)(參見， 例如Letsinger et al. /Voc. TVfl". Jcflrf. 5W. US. 86:6553-6556， 1989j Lemaitre et al.7Va汰5W.84:648-652， 1987; PCT '〉開No.W088/09810))或跨血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)(參見，例如，PCT公開 No.W089/10134)的試劑.此外，可以用雜交觸發(fā)的裂解試劑(參見， 例如Krol et al.說o-rec/im^ies 6:958-976， 1988)或插入試劑(參見， 例如Zon 7V^/m5:539-549， 1988)來修飾寡核苷酸.為此，寡核 苷酸可以與另一個(gè)分子結(jié)合(例如，肽、雜交觸發(fā)的交聯(lián)劑、轉(zhuǎn)運(yùn)試 劑、或雜交觸發(fā)的裂解試劑).
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本發(fā)明一個(gè)方面涉及分離的mNav1.3 a亞基蛋白和其生物學(xué)活性 部分，以及適合用作免疫原來產(chǎn)生抗mNavl.3 a亞基抗體的多肽片段， 在一個(gè)實(shí)施方式中，可以使用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白純化技術(shù)通過合適的純化方 案從細(xì)胞或組織來源分離天然mNav1.3 a亞基蛋白.在另一個(gè)實(shí)施方式 中，通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生mNa4,3a亞基蛋白.作為對(duì)重組表達(dá)的 替代，可以使用標(biāo)準(zhǔn)的肽合成技術(shù)來化學(xué)地合成mNav1.3 a亞基蛋白或 多肽。
"分離的"或"純化的"蛋白或其生物學(xué)活性部分基本上不含來 自得出該mNav1.3 a亞基蛋白的細(xì)胞或組織來源的細(xì)胞物質(zhì)或其他污 染蛋白，或當(dāng)化學(xué)合成時(shí)基本上不含化學(xué)藥品前體或其他化學(xué)藥品. 用語"基本上不含細(xì)胞物質(zhì)"包括制備mNavl.3a亞基蛋白，其中蛋白 從細(xì)胞的細(xì)胞組分分離，所述蛋白分離自所述細(xì)胞或由所述細(xì)胞重組 產(chǎn)生。在一個(gè)實(shí)施方式中，用語"基本上不含細(xì)胞物質(zhì)"包括制備 mNav1.3 a亞基蛋白，所述mNav1.3 a亞基蛋白具有低于約30% (干重) 的非mNavL3a亞基蛋白(在此也稱為"污染蛋白")，更優(yōu)選的低于 約20%、 10%或5%的非mNavl,3a亞基蛋白，當(dāng)所述mNav1.3 a亞基 蛋白或其生物學(xué)活性部分是重組產(chǎn)生的時(shí)，同樣優(yōu)選的是它基本上不 含培養(yǎng)基，即，培養(yǎng)基低于蛋白制品體積的約20%、 10%或5%.
用語"基本上不含化學(xué)藥品前體或其他化學(xué)藥品"包括制備 mNav1.3 a亞基蛋白，其中所述蛋白從在該蛋白的合成中所涉及的化學(xué) 藥品前體或其他化學(xué)藥品中分離.用語"基本上不含化學(xué)藥品前體或 其他化學(xué)藥品"包括制備niNav1.3 a亞基蛋白，其具有低于約30%、 20%、 10%或5% (干重)的化學(xué)藥品前體或非mNa4.3a亞基化學(xué)藥如在此使用的，mNav1.3 a亞基蛋白的"生物學(xué)活性部分"包括 mNav1.3 a亞基蛋白的片段，其參與mNav1.3 a亞基分子與非mNav1.3 a 亞基分子之間的相互作用.mNav1.3 a亞基蛋白的生物學(xué)活性部分包括 包含氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列來源于mNav1.3 a亞基蛋白的氨 基酸序列，例如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列，或與之足夠同源， 所述肽包括比全長(zhǎng)mNavl.3a亞基蛋白少的氨基酸，并展現(xiàn)出mNav1.3 a亞基蛋白的至少 一種活性. 一般地，生物學(xué)活性部分包含具有mNavl .3 a亞基蛋白的至少一種活性的結(jié)構(gòu)域或基序，所述活性例如結(jié)合P 1或 0 2 Na+通道亞基.mNav1.3 a亞基蛋白的生物學(xué)活性部分可以用作把 點(diǎn)，用于開發(fā)調(diào)節(jié)Na+通道介導(dǎo)的活性的試劑，
在一個(gè)實(shí)施方式中，mNav1.3 a亞基蛋白的生物學(xué)活性部分包含 至少一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。mNav1.3 a亞基蛋白的生物學(xué)活性部分介導(dǎo) mNav1.3 a亞基活性并包括mNav1.3 a亞基蛋白的一種或多種特征.在 其中蛋白的其他區(qū)域被刪除的生物學(xué)活性部分，可以通過重組技術(shù)來 制備，并對(duì)其評(píng)估天然mNav1.3 a亞基蛋白的一種或多種功能活性.
在一個(gè)實(shí)施方式中，mNav1.3 a亞基蛋白具有SEQ ID NO:2所示 的氨基酸序列，或基本上與SEQIDNO:2同源，并保持了 SEQIDNO:2 的蛋白的功能活性，而由于天然的等位變異或突變?cè)诎被嵝蛄猩嫌?不同，如在關(guān)于核苷酸的小節(jié)中詳細(xì)描述的.
因此，在另一個(gè)實(shí)施方式中，mNavl .3 a亞基蛋白是包含與SEQ ID NO:2有至少約50。/n、 75%、 85%、 95%、 99%或更高特異性的氨基酸 序列的蛋白.
為了確定兩個(gè)氨基酸序列或兩個(gè)核酸的同源性百分比，根據(jù)最優(yōu) 的比較目的對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)(例如，可以在笫一氨基酸或核酸序列中 導(dǎo)入缺口來優(yōu)化與笫二氨基酸或核酸序列的比對(duì)，并且對(duì)于比較目的 可以忽略非同源序列).用于比較目的比對(duì)的參考序列的長(zhǎng)度可以是 該參考序列長(zhǎng)度的至少50%、甚至70%、 80%或90%.然后比較相應(yīng)
氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸殘基或核苷酸.當(dāng)?shù)谝恍蛄兄械?一個(gè)位置被與第二序列中相應(yīng)位置相同的氨基酸殘基或核苷酸占據(jù) 時(shí)，則該分子在這個(gè)位置是同源的(即，如在此使用的，氨基酸或核 酸"同源性"相當(dāng)于氨基酸或核酸"同一性").兩個(gè)序列之間的同 源性百分比是序列共有的同一的位置數(shù)目的函數(shù)(即，同源性％ -同一的位置數(shù)/總位置數(shù)x100).
可以使用數(shù)學(xué)算法來完成兩個(gè)序列之間的序列比較和同源性百分 比的確定.用于序列比較的數(shù)學(xué)算法一個(gè)非限制性實(shí)例是Karlin and Altschul iVfl汰t/A4 87:2264-68， 1990的算法，在Karlin and Altschul尸roc. iVa". Jcc^. 5W. t/5L4 90:5873-77， 1993中進(jìn)行了修 改，這種算法被合并到Altschul， et al. / Mo/. 215:403-10， 19卯的 NBLAST和XBLAST程序中(版本2.0).可以用NBLAST程序進(jìn)行 BLAST核苷酸檢索，分值- 100，字長(zhǎng)- 12,來獲得與本發(fā)明的mNav1.3 ot亞基核酸分子同源的核苷酸序列.可以用XBLAST程序進(jìn)行BLAST 蛋白檢索，分值-50，字長(zhǎng)-3，來獲得與本發(fā)明的mNav1.3 oc亞基蛋 白分子同源的氨基酸序列。為了獲得用于比較目的的有缺口的比對(duì)， 可以利用如Altschul et al" iV"c/"c25 (17) : 3389-3402， 1997 中描述的Gapped BLAST.當(dāng)利用BLAST和Gapped BLAST程序時(shí)， 可以使用各個(gè)程序(例如，XBLAST和NBLAST )的默i人參數(shù)。參見 國(guó)家生物技術(shù)信息中心的網(wǎng)站，用于序列比較的數(shù)學(xué)算法的另一個(gè)非 限制性實(shí)例是Myers and Miller, CABIOS (1989)的算法.這種算法被 合并到ALIGN程序(版本2.0)中，其是GCG序列比對(duì)軟件包中的一 部分.當(dāng)利用ALIGN程序來比較氨基酸序列時(shí)，可以使用PAMI120 加權(quán)殘基表、12的缺口長(zhǎng)度罰分和4的缺口罰分.
本發(fā)明還提供了 mNav1.3 oc亞基嵌合或融合蛋白.如在此使用 的，mNav1.3 ot亞基"嵌合蛋白"或"融合蛋白"包含與非mNav1.3 a 亞基多肽可操作連接的mNav1.3 ct亞基多肽。"mNav1.3 oc亞基多肽" 是指具有相應(yīng)于mNav1.3 cc亞基的氨基酸序列的多肽，而"非mNav1.3 a亞基多肽"是指具有相應(yīng)于與mNav1.3 ct亞基蛋白基本上不同源的 蛋白的氨基酸序列，所述蛋白例如，不同于mNa4,3 a亞基蛋白并來 源于相同或不同有機(jī)體的蛋白，或不含有在此描述的mNav1.3 a亞基 蛋白的一種或多種特征的蛋白，在mNav1.3 ot亞基融合蛋白中， mNav1.3 ot亞基多肽可以相應(yīng)于mNav1.3 a亞基蛋白的全部或部分. 在特定的實(shí)施方式中，mNavl.3 a亞基融合蛋白包含mNa4.3 cx亞基 蛋白的至少一個(gè)生物學(xué)活性部分.在另一個(gè)實(shí)施方式中，mNav1.3 a 亞基融合蛋白包含mNav1.3 a亞基蛋白的至少兩個(gè)生物學(xué)活性部分. 在所述融合蛋白中，術(shù)語"可操作連接的"意圖是指出niNav1.3 ct亞基多肽和非inNav1.3 a亞基多肽是按閱讀框相互融合的，非mNav1.3 ot亞基多肽可以與mNavl,3 a亞基多肽的N-末端或C-末端融合.
例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，所述融合蛋白是GST-mNav1.3 ot亞 基融合蛋白，其中mNavl.3 a亞基序列被融合到GST序列的C-末端. 這種融合蛋白可以便于重組mNav1.3 ot亞基的純化，
在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述融合蛋白是在其N-末端含有異源信號(hào) 序列的mNa4.3 oc亞基蛋白.在某些宿主細(xì)胞(例如，哺乳動(dòng)物宿主 細(xì)胞)中，mNav1.3 ot亞基的表達(dá)可以通過使用異源信號(hào)序列來提高.
本發(fā)明的mNav1.3 ot亞基融合蛋白可以摻入藥物組合物并體內(nèi) 施用給受試者，mNav1.3 oc亞基融合蛋白可以用來影響mNav1.3 ct亞 基底物的生物利用率.對(duì)于治療與Na+通道活性有關(guān)的失調(diào)，例如，神 經(jīng)性疼痛，使用mNav1.3 a亞基融合蛋白可能是治療上有用的。
此外，本發(fā)明的mNa4.3 a亞基融合蛋白可用作免疫原來在受試 者中產(chǎn)生抗niNav1.3 a亞基抗體，來純化mNav1.3 a亞基配體，和用 于篩選分析以鑒定抑制mNavl.3 a亞基與mNav1.3 a亞基底物的相互 作用的分子.
本發(fā)明的mNav1.3 a亞基嵌合或融合蛋白可以通過標(biāo)準(zhǔn)的重組 DNA技術(shù)產(chǎn)生.例如，根據(jù)常規(guī)技術(shù)將編碼不同多肽序列的DNA片 段按閱讀框連接在一起，例如，通過使用平端的或交錯(cuò)端的末端用于 連接，限制性內(nèi)切酶消化以提供合適的末端，視情況填補(bǔ)粘性末端， 堿性磷酸酶處理以避免不希望的接合，和酶連接.融合基因可以通過 常規(guī)技術(shù)，包括自動(dòng)化DNA合成儀，來合成.做為選擇，可以使用錨 引物來進(jìn)行基因片段的PCR擴(kuò)增，所述錨引物產(chǎn)生兩個(gè)連續(xù)基因片段 之間的互補(bǔ)的突出，其隨后可以退火和再擴(kuò)增以產(chǎn)生嵌合基因序列(參 見,例如Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992 ).此外許多以及編碼融合部分的表達(dá)栽體(例 如，GST多肽)是商業(yè)上可獲得的.mNa4.3a亞基編碼核酸可以克隆 到這種表達(dá)栽體中，從而融合部分按閱讀框連接到mNav1.3 a亞基蛋白 上.
本發(fā)明還涉及作為mNav1.3 a亞基激動(dòng)劑(模擬物)或作為 mNavl.3a亞基拮抗劑起作用的mNav:L3a亞基蛋白的變體.可以通過 誘變，例如，離散點(diǎn)突變或?qū)nNav1.3 a亞基蛋白的截?cái)鄟懋a(chǎn)生mNav1.3a亞基蛋白的變體.mNav1.3 a亞基蛋白的激動(dòng)劑可以基本上保持 mNav1.3 a亞基蛋白的天然發(fā)生形式的相同的生物學(xué)活性，或其生物學(xué) 的活性的子集.mNav1.3 a亞基蛋白的拮抗劑可以通過例如竟賽地調(diào)節(jié) mNav1.3 a亞基蛋白的Na+通道介導(dǎo)的活性，來抑制mNav1.3 a亞基蛋 白的天然發(fā)生的形式的一種或多種活性。因而，通過用有限功能的變 體處理可以引發(fā)特定的生物學(xué)效果.在一個(gè)實(shí)施方式中，用具有所述 蛋白的天然發(fā)生形式的生物學(xué)活性子集的變體治療受試者，相對(duì)于用 mNav1.3 a亞基蛋白的天然發(fā)生形式治療，在受試者中有較少的副作 用。
在一個(gè)實(shí)施方式中，作為mNa4,3 a亞基激動(dòng)劑(模擬物)或作 為mNav1.3 a亞基拮抗劑起作用的mNav1.3 a亞基蛋白變體可以通過根 據(jù)mNav1.3 a亞基蛋白激動(dòng)劑或者拮抗劑活性篩選mNav1.3 a亞基蛋白 的突變體，例如，截?cái)嗤蛔凅w的組合庫來鑒定.在一個(gè)實(shí)施方式中， mNavl.3 a亞基變體的多樣化的庫通過核酸水平的組合誘變來產(chǎn)生，并 由多樣化的基因文庫編碼?？梢酝ㄟ^例如，將合成寡核苷酸的混合物 酶連接到基因序列中，從而作為單獨(dú)的多肽或選擇性地作為其中含有 mNav1.3 a亞基序列組的更大的融合蛋白的組(例如，對(duì)于噬菌體展 示)，可能的mNav1.3 a亞基序列的簡(jiǎn)并組是可表達(dá)的，來產(chǎn)生mNav1.3 a亞基變體的多樣化庫.存在著可用于從簡(jiǎn)并寡核苷酸序列產(chǎn)生可能的 mNav1.3 a亞基變體庫的各種方法.可以在自動(dòng)DNA合成儀中進(jìn)行簡(jiǎn) 并基因序列的化學(xué)合成，合成基因然后可以連接到適合的表達(dá)栽體 中。使用基因的簡(jiǎn)并組允許在混合物中提供編碼期望的、可能的 mNav1.3 a亞基序列組的所有序列.合成簡(jiǎn)并寡核苷酸的方法是本領(lǐng)域 已知的(參見，例如Narang， S. A. 7^rflAWrort 39:3， 1983; Itakura et al.
及ev.53:323， 1984; Itakura et al. 5"度e 198:1056， 1984; Ike et al. iVwc/e/c ^c/rf及m. 11:477， 1983
此外，mNav1.3 a亞基蛋白編碼序列的片段的庫可以用來產(chǎn)生 mNav1.3 a亞基片段的多樣化群體，用于mNav1.3 a亞基蛋白變體的篩 選和隨后的選擇.
在此描述的mNav1.3 a亞基蛋白可以用可檢測(cè)物質(zhì)直接或間接地 標(biāo)記，以便于檢測(cè)結(jié)合的或未結(jié)合的結(jié)合試劑.適合的可檢測(cè)物質(zhì)包 括各種酶、輔基、熒光材料、發(fā)光材料和放射性物質(zhì).分離的mNav1.3 a亞基蛋白或其部分或片段可被用作免疫原來使 用多克隆和單克隆抗體制備的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)產(chǎn)生結(jié)合mNav1.3 a亞基的抗 體，可以使用全長(zhǎng)mNavl,3a亞基蛋白，或做為選擇，本發(fā)明提供了用 作免疫原的mNav1.3 a亞基的抗原性肽片段.mNav1.3 a亞基的抗原性 肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或SEQ ID NO:2的氨基酸序列的 至少8個(gè)氨基酸殘基，并包括mNavl,3a亞基的表位，從而針對(duì)該肽產(chǎn) 生的抗體與mNavl,3a亞基形成特定的免疫復(fù)合物.優(yōu)選的，抗原性肽 包含至少IO、 15、 20或30個(gè)氨基酸殘基.
mNav1.3 a亞基免疫原一般用于通過使用該免疫原免疫適合的受 試者(例如，兔、山羊、小鼠或其他哺乳動(dòng)物)來制備抗體.適合的 免疫原性制品可以含有，例如，重組表達(dá)的mNavl,3a亞基蛋白或化學(xué) 合成的mNavl,3a亞基多肽.該制品可以進(jìn)一步包括佐劑，例如弗氏完 全或不完全佐劑，或類似的免疫刺激性試劑.用免疫原性mNav1.3 a 亞基制品免疫適合的受試者誘導(dǎo)了多克隆抗mNav1.3 a亞基抗體反 應(yīng).
因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及抗mNav1.3 a亞基抗體.如在此 使用的術(shù)語"抗體"是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活 性部分，即，含有特異性地與抗原例如mNa4Ja亞基結(jié)合(免疫反應(yīng)) 的抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子.免疫球蛋白分子的免疫活性部分的實(shí)例包括F (ab)和F (ab') 2片段，可通過用酶，例如胃蛋白酶處理抗體產(chǎn)生。 本發(fā)明提供了結(jié)合mNav1.3 a亞基的多克隆和單克隆抗體，如在此使用 的，術(shù)語"單克隆抗體"或"單克隆抗體組合物"是指抗體分子的群 體，其僅含有能與mNav1.3 a亞基的特定表位免疫反應(yīng)的一類抗原結(jié)合 位點(diǎn).因而單克隆抗體組合物一般展現(xiàn)了對(duì)于其免疫反應(yīng)的特定 mNav1.3 a亞基蛋白的單一結(jié)合親合性。
如上所述通過用mNav1.3 a亞基免疫原免疫適合的受試者可以制 備多克隆抗mNavl,3a亞基抗體.可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如，用使用了 固定化mNavl.3a亞基的酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)，可以監(jiān)視免疫 的受試者中在時(shí)間上抗mNavl.3a亞基抗體滴度.如杲需要，可以從哺 乳動(dòng)物(例如，從血液)分離針對(duì)mNavl.3a亞基的抗體分子，通過已 知技術(shù)，例如蛋白A層析來進(jìn)一步純化，以獲得IgG級(jí)分.在免疫后 的適當(dāng)時(shí)間，例如，當(dāng)抗mNav:L3a亞基抗體滴度最高時(shí)，可以從受試者獲得抗體生產(chǎn)細(xì)胞，用于通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備單克隆抗體，例如，最
初由Kohler and Milstein (l975) JVa似"256:495_497描述的雜交瘤技 術(shù)(也參見Brown et al. / /附附mwo/. 127:539-46， 1981; Brown et al. j.
Oie/ft 255:4980-83， 1980; Yeh et al. iVoc. Wa".爿caA 5W. 76:2927-31， 1976; and Yeh et al. /W. / Cancer 29:269-75， 1982 )，更新 近的人類B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor et al. 7> w"/io/ 7V，rf^ 4:72， 1983 ), EBV雜交瘤技術(shù)(Cole et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss， Inc., pp, 77-96， 1985)或三瘤(trioma)技術(shù)。 生產(chǎn)單克隆抗體雜交瘤的技術(shù)是公知的(一般參見R. H. Kenneth, in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, N.Y. (1980); E. A. Lerner Yale / 脂.臉rf.， 54:387-402， 1981; M. L. Gefter et al. Somatic Cell Genet. 3:231-36， 1977),簡(jiǎn)要地，將永生細(xì)胞系( 一般是骨髄瘤)與來自用 如上所述mNav1.3 a亞基免疫原免疫的哺乳動(dòng)物的淋巴細(xì)胞( 一般是脾 細(xì)胞)融合，篩選產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液來鑒定產(chǎn)生結(jié)合 mNav:L3a亞基的單克隆抗體的雜交瘤.
可以將許多用于融合淋巴細(xì)胞和永生細(xì)胞系的已知方案的任何一 種，應(yīng)用于產(chǎn)生抗mNa4.3a亞基單克隆抗體的目的(參見，例如，G. Galfre et al.266:55052, 1977j Gefter et al. S頻Wc CW/ ( 麼t， cited supra; Lemer， Yale / J :'o/. AfedL， cited supra; Kenneth, Monoclonal Antibodies, cited supra).此夕卜，技術(shù)人員將能理解，存在 著也會(huì)有用的這些方法的許多變體.
作為對(duì)制備單克隆抗體分泌雜交瘤的選擇，可以通過用mNav1.3 a 亞基篩選重組組合免疫球蛋白庫(例如，抗體噬菌體展示庫)從而分 離結(jié)合mNav1.3 a亞基的免疫球蛋白庫成員，來鑒定和分離單克隆抗 mNav1.3 a亞基抗體.用于產(chǎn)生和篩選噬菌體展示庫的試劑盒是商業(yè)上 可獲得的(例如，Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, CatalogNo.27-9400-01 ).另外，對(duì)于產(chǎn)生和篩選抗體展示庫特別有用 的方法和試劑的實(shí)例可以在例如Ladner et al.美國(guó)專利No.5，223，409; Kang et al. PCT國(guó)際公開No.WO 92/18619;和McCafferty et al. iVa似^ 348:552-554， 1990中找到.
另外，可以使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的重組抗mNavl.3 a亞基抗體，例如包含人類和非人類部分的嵌合和人源化單克隆抗體，在本 發(fā)明的范閨之內(nèi).這種嵌合和人源化單克隆抗體可以通過本領(lǐng)域已知
的重組DNA技術(shù)產(chǎn)生，例如，使用以下描述的方法，Robinsonetal.國(guó) 際申請(qǐng)No.PCT/US86/02269; Akira， et al.歐洲專利申請(qǐng)184,187; Taniguchi， M.，歐洲專利申請(qǐng)171,496; Morrison et al.歐洲專利申請(qǐng) 173,494; Neuberger et al. PCT國(guó)際公開No.WO 86/01533; Cabilly et al. 美國(guó)專利No.4，816，567; Cabilly et al.歐洲專利申請(qǐng)125,023; Better et al. 5We"ce 240:1041-1043， 1988; Liu et al. iVoc. iVfl比爿ow/. t/5L4 84:3439-3443， 1987; Liu et al. / /附w"wo/. 139:3521-3526， 1987; Sim et al. iVoc.胸/. ]carf. 84:214-218， 1987; Nishimura et al. Omc.
47:999-1005， 1987; Wood et al. iVa似re 314:446-449， 1985;和Shaw et al. / Omcer Jto. 80:1553-1559， 1988) ; Moirison， S. L. 5V:iV臟 229:1202-1207， 1985; Oi et al. 5/orecA附《"es 4:214， 1986; Winter美國(guó) 專利No.5，225，539; Jones et al. Atore 321:552-525， 1986; Verhoeyan et al. 5We/ice 239:1534， 1988;和Beidler et al. / /m/mmo/. 141:4053-4060， 1988。
抗mNa4.3 a亞基抗體(例如，單克隆抗體)可用于通過標(biāo)準(zhǔn)技 術(shù)，例如親和層析或免測(cè)沉淀來分離11^34.3 0[亞基。抗mNavl,3a亞 基抗體可以便于來自細(xì)胞的天然mNav1.3 a亞基、和在宿主細(xì)胞中表達(dá) 的重組產(chǎn)生的mNavl.3a亞基的純化，此外，抗mNav1.3 a亞基抗體可 用于檢測(cè)mNavl,3a亞基蛋白(例如，在細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物或細(xì)胞上清液 中)來評(píng)估m(xù)Nav1.3 a亞基蛋白表達(dá)的豐度和模式.可以診斷性使用抗 mNav1.3 a亞基抗體來監(jiān)視組織中的蛋白水平，作為臨床試驗(yàn)過程的一 部分，例如，來確定給定治療方法的效力?？梢酝ㄟ^將抗體聯(lián)結(jié)(即， 物理連接)到可檢測(cè)物質(zhì)來便于檢測(cè)?？蓹z測(cè)物質(zhì)的實(shí)例包括各種酶、 輔基、熒光材料、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料和放射性物質(zhì)。適合的酶 的實(shí)例包括辣根過氧化酶、堿性磷酸酶、半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶； 適合的輔基復(fù)合物的實(shí)例包括鏈霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋 白/生物素；適合的熒光材料的實(shí)例包括傘形稱、熒光素、異硫氰酸熒 光素、羅丹明、二氯三喙基胺熒光素、丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光材 料的實(shí)例包括魯米諾；生物發(fā)光材料的實(shí)例包括熒光素酶、螢光素和 水母發(fā)光蛋白，適合的放射性物質(zhì)的實(shí)例包括1251、 35S、或311.本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及栽體，優(yōu)選的表達(dá)栽體，含有編碼
mNavl,3a亞基蛋白的核酸(或其部分).如在此使用的，術(shù)語"栽體" 是指能夠轉(zhuǎn)運(yùn)與之連接的另一個(gè)核酸的核酸分子. 一種類型的栽體是 "質(zhì)粒"，是指在其中可以連接其他DNA片段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán). 另一種類型的栽體是病毒栽體，其中其他的DNA片段可以連接到病毒 基因組中.某些栽體能夠在導(dǎo)入它們的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如， 具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌栽體和游離哺乳動(dòng)物栽體).其他類型的栽 體(例如，非游離哺乳動(dòng)物栽體)在導(dǎo)入宿主細(xì)胞中時(shí)被整合到宿主 細(xì)胞的基因組中，從而隨宿主基因組一起復(fù)制。此外，某些栽體能夠 指導(dǎo)與它們可操作連接的基因的表達(dá).這種栽體在此稱為"表達(dá)栽 體". 一般地，在重組DNA技術(shù)中有實(shí)用性的表達(dá)栽體常常是質(zhì)粒的 形式.在此，"質(zhì)粒"和"栽體"可互換地使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是最常用 的載體形式。然而，本發(fā)明意圖包括其他形式的表達(dá)栽體，例如病毒 栽體(例如，復(fù)制缺陷性逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺病毒相關(guān)病毒)， 其提供了等同的功能.
本發(fā)明的重組表達(dá)包含以適合于宿主細(xì)胞中核酸表達(dá)形式存在的 本發(fā)明的核酸，這意味著所述重組表達(dá)栽體包括一個(gè)或多個(gè)根據(jù)用于 表達(dá)的宿主細(xì)胞選擇的調(diào)節(jié)序列，所述調(diào)節(jié)序列要表達(dá)的核酸序列可 操作連接.在重組表達(dá)載體內(nèi)，"可採作連接的"意指感興趣的核苷 酸序列以允許所述核苷酸序列表達(dá)的方式與調(diào)節(jié)序列連接(例如，在 體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中，或當(dāng)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中時(shí)在宿主細(xì)胞中). 術(shù)語"調(diào)節(jié)序列"意圖包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和其他表達(dá)控制元件(例 如，多聚腺苦酸信號(hào))，例如，在Goeddel; Gene Expression Technology-Methods in Enzymology 185， Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 中描述了這種調(diào)節(jié)序列.調(diào)節(jié)序列包括在許多種類的宿主細(xì)胞中指導(dǎo) 核苷酸序列的組成型表達(dá)的那些，和僅在某些宿主細(xì)胞中指導(dǎo)核苷酸 序列表達(dá)的那些(例如，組織特異性調(diào)節(jié)序列).本領(lǐng)域技術(shù)人員要 理解的是，表達(dá)栽體的設(shè)計(jì)可以取決于一些因素，例如，要轉(zhuǎn)化的宿 主細(xì)胞的選擇、希望的蛋白表達(dá)水平，等等，本發(fā)明的表達(dá)栽體可以 被導(dǎo)入宿主細(xì)胞，從而生產(chǎn)由在此描述的核酸編碼的蛋白或肽，包括融合蛋白或肽(例如，mNavl,3 a亞基蛋白、mNav1.3 a亞基蛋白的突 變形式、融合蛋白，等等).
本發(fā)明的重組表達(dá)栽體可以被設(shè)計(jì)為在原核或真核細(xì)胞中表達(dá) mNav1.3 a亞基蛋白.例如，mNav1.3 a亞基蛋白可以在細(xì)菌細(xì)胞例如 E,coli、昆蟲細(xì)胞(使用桿狀病毒表達(dá)栽體)、酵母細(xì)胞、兩棲動(dòng)物細(xì) 胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，在Goeddel， Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185， Academic Press, San Diego， Calif. (1990) 中進(jìn)一步討論了適合的宿主細(xì)胞.做為選擇，重組表達(dá)栽體可以體外 轉(zhuǎn)錄和翻譯，例如，使用T7啟動(dòng)子調(diào)節(jié)序列和T7聚合酶。
原核生物中的蛋白表達(dá)最常見地在帶有栽體的E.coli中進(jìn)行，所 述栽體含有指導(dǎo)融合或非融合蛋白表達(dá)的組成型或可誘導(dǎo)啟動(dòng)子.
例如，純化的融合蛋白可以用于mNav1.3 a亞基活性分析，(例 如，以下詳細(xì)描述的直接分析或竟?fàn)幮苑治?，或用以產(chǎn)生特異于 mNav1.3 a亞基的抗體.
在另 一個(gè)實(shí)施方式中，mNav1.3 oi亞基表達(dá)栽體是酵母表達(dá)栽體. 用于在酵母S. cerivisae中表達(dá)的栽體的實(shí)例包括pY印Secl( Baldari， et al.， 1987， EMBO J. 6:229-234. )、pMFa( Kurjan and Herskowitz， Cell 30 : 933-943， 1982 ) 、 pJRY88 ( Schultz et al" Gene 54 : 113-123， 1987)、 pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego， Calif.)和picZ (InVitrogen Corp， San Diego， Calif.)。
做為選擇，mNav1.3 a亞基蛋白可以使用桿狀病毒表達(dá)栽體在昆 蟲細(xì)胞中表達(dá).可用于在培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞(例如，Sf9細(xì)胞)中表達(dá)蛋 白的桿狀病毒栽體包括pAc系列(Smith et al.似o/. CW/說W. 3:2156-2165， 1983)和pVL系列(Lucklow and Summers 170:31-39， 1989),
在又一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的核酸使用哺乳動(dòng)物表達(dá)栽體在哺 乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，哺乳動(dòng)物表達(dá)栽體的實(shí)例包括pCDM8 (Seed, B. iVa似re 329:840， 1987 )和pMT2PC (Kaufman et al. 義6:187-195，
1987)。當(dāng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中使用時(shí)，通常通過病毒調(diào)節(jié)元件來提供 表達(dá)栽體的控制功能.例如，常用的啟動(dòng)子來源于多形瘤、腺病毒2、 巨細(xì)胞病毒和猿猴病毒40.關(guān)于原核和真核細(xì)胞的其他適合的表達(dá)系 統(tǒng),參見Sambrook, J.， Fritsh， E. F.， and Maniatis, T. Molecular Cloning:A Laboratory Manual. 2nd， ed， Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.， 1989的第 16和17章.
在另一個(gè)實(shí)施方式中，重組哺乳動(dòng)物表達(dá)栽體能夠指導(dǎo)核酸優(yōu)先 地在特定細(xì)胞類型中表達(dá)(例如，使用組織特異性調(diào)節(jié)元件來表達(dá)核 酸).組織特異性調(diào)節(jié)元件是本領(lǐng)域已知的.適合的組織特異性啟動(dòng) 子的非限制性實(shí)例包括白蛋白啟動(dòng)子(肝臟特異性；Pinkert et al, GWi" Z)ev. 1:268-277， 1987)、淋巴特異性啟動(dòng)子(Calame and Eaton jrfv. /附附imo/. 43:235-275， 1988 )、特別是T細(xì)胞受體(Winoto and Baltimore / 8:729-733， 1989 )和免疫球蛋白(Banerji et al. CW/ 33:729-740， 1983; Queen and Baltimore CW/ 33:741-748， 1983 )的啟動(dòng)子、神經(jīng)元 特異性啟動(dòng)子(例如，神經(jīng)絲啟動(dòng)子；Byrne and Ruddle
86:5473-5477， 1989)、鼓腺特異性啟動(dòng)子(Edlund et al. 5Wewce 230:912-916， 1985)，和乳腺特異性啟動(dòng)子(例如，乳清啟動(dòng) 子；美國(guó)專利No.4，873，316和歐洲專利公開No.264，166).還包括發(fā)育 調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子，例如鼠hox啟動(dòng)子(Kessel and Gruss iSWe"ce 249:374-379， 1990)和a-甲胎蛋白啟動(dòng)子(Campes and Tilghman GWt^y Dev. 3:537-546， 1989 )
本發(fā)明進(jìn)一步提供重組表達(dá)栽體，其包含以反義方向克隆到表達(dá) 栽體中的本發(fā)明的DNA分子.也就是說，DNA分子以一定方式與調(diào) 節(jié)序列可操作地連接，這種方式允許表達(dá)(通過DNA分子的轉(zhuǎn)錄)與 mNavl.3a亞基mRNA反義的RNA分子.可以選擇與按反義方向克隆 的核酸可操作連接的調(diào)節(jié)序列，其指導(dǎo)反義RNA分子在各種細(xì)胞類型 中的連續(xù)表達(dá)，例如，病毒啟動(dòng)子或增強(qiáng)子，或可以選擇調(diào)節(jié)序列， 其指導(dǎo)反義RNA的組成型、組織特異性或細(xì)胞類型特異性表達(dá).反義 表達(dá)栽體可以是重組質(zhì)粒、噬菌?；驕p毒病毒的形式，其中在高效率 調(diào)節(jié)區(qū)域的控制下產(chǎn)生反義核酸，其活性可通過其中導(dǎo)入了該栽體的 細(xì)胞類型來測(cè)定。對(duì)于使用反義基因調(diào)節(jié)基因表達(dá)的論述參見 Weintraub， H. et al" Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, 2>e/ /s i>t Gewd， Vol. 1 (1) 1986,
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及宿主細(xì)胞，在所述宿主細(xì)胞中導(dǎo)入了本 發(fā)明的核酸，例如，mNavl.3tt亞基mRNA或重組表達(dá)栽體，術(shù)語"宿主細(xì)胞"和"重組宿主細(xì)胞"在此可互換地使用.要理解的是，這種 術(shù)語不僅僅指特定的受試者細(xì)胞，還指這種細(xì)胞的子代或可能的子 代。由于突變或環(huán)境影響在繼承的一代中可能出現(xiàn)某些改變，實(shí)際上， 這種子代可能不與母細(xì)胞完全相同，但仍然包括在此處使用的該術(shù)語 的范閨內(nèi).
宿主細(xì)胞可以是任何原核或真核細(xì)胞，例如，mNav1.3 a亞基蛋 白可以在細(xì)菌細(xì)胞例如E. coli、昆蟲細(xì)胞、酵母細(xì)胞、非洲爪塘細(xì)胞 例如非洲爪蟾卵母細(xì)胞、或哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如中國(guó)倉鼠卵巢細(xì)胞 (CHO )或COS細(xì)胞)中表達(dá).其他適合的宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域技術(shù)人 員已知的.
可以通過常規(guī)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)將栽體DNA導(dǎo)入到原核或真核細(xì) 胞中.如在此使用的，術(shù)語"轉(zhuǎn)化"和"轉(zhuǎn)染"意指用于將外源核酸 (例如DNA)導(dǎo)入宿主細(xì)胞的各種本領(lǐng)域已知的技術(shù)，包括礴酸鈣或 氯化鉤共沉淀、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂轉(zhuǎn)染或電穿孔.可以在 Sambrook， et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd， ed， Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.， 1989)和其他實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)中找到轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染 宿主細(xì)胞的適合的方法。也可以通過顯微注射導(dǎo)入核酸，
對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，已知的是，取決于使用的表達(dá)栽 體和轉(zhuǎn)染技術(shù)，僅小部分細(xì)胞可能將外源DNA整合到它們的基因組 中.為了鑒定和選擇這些整合體， 一般與感興趣的基因一起將編碼選 擇性標(biāo)記(例如，抗生素抗性)的基因?qū)胨拗骷?xì)胞.選擇性標(biāo)記包 括賦予對(duì)藥物，例如G418、勻霉素和氨甲蝶呤的抗性的那些.編碼選 擇性標(biāo)記的核酸可以在編碼mNav1.3 a亞基蛋白的相同栽體上導(dǎo)入宿 主細(xì)胞，或可以在獨(dú)立的栽體上導(dǎo)入.用導(dǎo)入的核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞 可以通過藥物選擇來鑒定(例如，摻入了選擇性標(biāo)記基因的細(xì)胞將生 存，而其他細(xì)胞將死亡).
本發(fā)明的宿主細(xì)胞，例如培養(yǎng)物中的原核或真核宿主細(xì)胞，可被 用于產(chǎn)生(即，表達(dá))mNavl,3a亞基蛋白，因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供 了使用本發(fā)明的宿主細(xì)胞生產(chǎn)mNavl.3 a亞基蛋白的方法.
本發(fā)明的核酸分子可以插入到栽體中，用作基因治療栽體.可以 通過，例如，靜脈內(nèi)注射、局部施用(參見美國(guó)專利No.5，328，470)或通過立體策略(stereotactic)注射(參見，例如Chen et al. /Voc. iVii". y4cW5W. tASL4 91:3054-3057， 1994)，將基因治療栽體遞送給受試者。 基因治療栽體的藥物制劑可以包括處在可接受的稀釋劑中的基因治療 栽體，或可以包含基因遞送賦形劑包埋于其中的緩釋基質(zhì).做為選擇， 當(dāng)可以從重組細(xì)胞完整地產(chǎn)生完整基因遞送栽體時(shí)，例如，逆病毒栽 體，藥物制刑可以包括產(chǎn)生該基因遞送系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞，
本*銀邦>^^弄才法
在此描述的核酸分子、蛋白、蛋白同源物和抗體可被用于一種或 多種以下方法a)篩選分析；b)預(yù)測(cè)性藥物(例如，診斷分析、預(yù) 后分析、監(jiān)視臨床試驗(yàn)和藥物遣傳學(xué))；和c)治療方法(例如，治療 和預(yù)防).
本發(fā)明的分離的核酸分子能被用于，例如，表達(dá)mNa4.3ot亞基 蛋白(例如，在基因治療應(yīng)用中通過在宿主細(xì)胞中的重組表達(dá)栽體)， 檢測(cè)mNav1.3 a亞基mRNA (例如，在生物樣品中)或編碼mNav1.3 a 亞基蛋白的基因中的遣傳改變，和調(diào)節(jié)mNavl,3a亞基活性，如以下進(jìn) 一步描述的.mNavl,3a亞基蛋白可用于治療失調(diào)，所述失調(diào)以不足的 或過度的mNav1.3 a亞基底物產(chǎn)生或mNav1.3 a亞基抑制物產(chǎn)生為特 征.此外，mNavL3a亞基蛋白可用于篩選天然發(fā)生的mNavl,3a亞基 底物，用于篩選調(diào)節(jié)mNa4.3a亞基活性的藥物或化合物，以及用于治 療失調(diào)，所述失調(diào)以不足的或過度的mNav1.3 a亞基蛋白產(chǎn)生或與 mNav1.3 a亞基野生型蛋白相比具有降低的或異?；钚缘膍Nav1.3 a亞 基蛋白的產(chǎn)生為特征.此外，本發(fā)明的抗mNavl.3a亞基抗體可用于檢 測(cè)和分離mNav1.3 ot亞基蛋白以及調(diào)節(jié)mNav1.3 a亞基活性. ,這》、浙
本發(fā)明提供了鑒定與包含在此描述的mNav1.3 a亞基的Na+通道 結(jié)合的調(diào)節(jié)物，即候選或測(cè)試化合物或試劑(例如，蛋白、肽、擬肽、 類肽、小分子或其他藥物)的方法.這樣鑒定的化合物可以用于調(diào)節(jié) 這些Na+通道的活性，例如，在治療方案中.
在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于篩選作為Na+通道的底物 的測(cè)試化合物的分析，所述Na+通道包括在此描述的mNavL3a亞基或 所述亞基的生物學(xué)活性部分。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于篩選候選或測(cè)試化合物的分析，所述候選或測(cè)試化合物與這些Na+ 通道結(jié)合或調(diào)節(jié)它們的活性，
可以通過體內(nèi)(例如，基于細(xì)胞和非細(xì)胞的)或體外方法鑒定離 子通道調(diào)節(jié)化合物，在一個(gè)實(shí)施方式中，離子流入分析被用于測(cè)量 8+ 通道活性.
測(cè)量離子通道活性的分析包括流量分析、膜片鉗電生理學(xué)和二電 極電壓鉗電生理學(xué)(參見，例如Lin etal"iVeM/wi 18:153-166， 1997). 膜片鉗生理學(xué)可以如下進(jìn)行，簡(jiǎn)要地，將含有小電極的吸管尖端壓到 細(xì)胞膜上以產(chǎn)生吸管和膜之間的緊密封閉(tightseal).電極俘獲流經(jīng) 吸管尖端的邊緣劃定的膜的離子.可以采用各種結(jié)構(gòu)來測(cè)量細(xì)胞內(nèi)或 膜片內(nèi)或整個(gè)細(xì)胞上的電流.
二電極電壓鉗(TEVC)生理學(xué)如下進(jìn)行.簡(jiǎn)要地，將兩個(gè)尖銳 的微電極壓穿細(xì)胞膜. 一個(gè)電極監(jiān)視膜電位，另一個(gè)電極注入電流來 將膜電位保持在期望的水平.膜片鉗和TEVC技術(shù)都提供了關(guān)于離子 通道電流的動(dòng)力學(xué)和強(qiáng)度的信息.
可以進(jìn)行高通量電生理學(xué)，例如，如U.S. 6，268，168和U.S. 6，048，722中描述的，通過引用將它們的內(nèi)容合并在此.
可以使用測(cè)量離子濃度變化的分析，例如，可以用可檢測(cè)的Na+ (例如，放射性標(biāo)記的Na+)加栽測(cè)試系統(tǒng)。對(duì)Na+的檢測(cè)可以給出 Na+濃度變化的指標(biāo).在一個(gè)實(shí)施方式中，所述分析包括在對(duì)測(cè)試系統(tǒng) (例如，細(xì)胞或封閉的膜制備物)施加電壓進(jìn)行刺激之后檢測(cè)Na+.鈉 敏感性染料，例如鈉綠或冠紅，也可用于測(cè)量離子濃度的變化.
在一個(gè)實(shí)施方式中，使用非洲爪蟾卵母細(xì)胞系統(tǒng)分析Na+通道調(diào) 節(jié).對(duì)于離子通道的短暫表達(dá)和來自非洲爪蟾卵母細(xì)胞的數(shù)據(jù) (recording)的詳細(xì)說明,參見,例如Xu and Lipscombe， / iVeMmyc/, 21 (16) :5944-5951， 2001; Lin et al.，同上),在另一個(gè)實(shí)施方式中， 所述分析是基于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的分析，例如，使用人類或小鼠細(xì)胞。 通過轉(zhuǎn)染到不表達(dá)其他Na+通道的細(xì)胞類型中，可以獨(dú)立地研究特定的 Na+通道,例如mNav1.3 a亞基通道，
化合物
本發(fā)明的測(cè)試化合物可以單獨(dú)的獲得，或使用本領(lǐng)域已知的組合 庫方法中的許多手段的任何一種來獲得，包括生物學(xué)庫；類肽庫(具有肽的功能，但帶有新的對(duì)酶促降解有抗性但仍保持了生物活性的非
肽主干的分子的庫；參見，例如，Zuckermann， R.N* WaA， / il/erf. C/ie附. 37:2678-85， 1994);空間可尋址的平行固相或液相庫；需要去褶合的 合成庫方法；"一個(gè)珠一個(gè)化合物"庫的方法；和利用親和層析選擇 的合成庫方法.生物學(xué)庫和類肽庫的方法限于肽庫，而其他四種方法 對(duì)肽、非肽寡聚物或化合物的小分子庫都是適合的(Lam，爿"Z/c朋cer /),"g/)d 12:145,1997).
用于分子庫合成的方法的實(shí)例可在本領(lǐng)域中找到，例如 DeWitt W u/" iVoc. iVa".爿carf. Sa: 90:6909， 1993; Erb W a/"
iVfl汰4cflw/. t/5^ 91:11422， 1994; Zuckermann Cflt/" / CAe抓 37:2678， 1994; Cho W a/" 5W潔e 261:1303， 1993., Carrell" fl/" CA隱/"A嵐五wg/, 33:2059， 1994j Carell" fl乙，Ot隱嵐嵐 33:2061， 1994;和Gallop W fl/" / 37:1233， 1994。
化合物的庫可以存在于溶液中(例如，Houghten，丑/o&cA/fi々"es 11:412-421， 1992 )、 或珠子上(Lam， A^"re 354:82-84， 1991)、芯片 上(Fodor， iVa似;^ 364:555-556， 1993 ) ， bacteria (Ladner， U.S. Patent No.5，223，409)、 孢子上(Ladner U.S. Patent No.S，223，409)，質(zhì)粒上 (Cull W fl/"Wa"爿carf 5W (AS^ 89:1865-1869， 1992 )或嗛菌體上 (Scott and Smith, 249:386-390， 1990; Devlin， 5We臟
249:404-406， 1990; Cwirla W a/. Pwc. iVa".87:6378-6382， 1990; Felici，丄脅/.脅/. 222:301-310， 1991; Ladner訓(xùn)戸.)。
用作測(cè)試化合物(即，可能的抑制物、拮抗刑、激動(dòng)劑)的化學(xué) 化合物可以從商業(yè)來源獲得，或可以從易于獲得的起始材料使用本領(lǐng) 域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)合成技術(shù)和方法來合成.通過在此描述的方法 鑒定的化合物的合成中有用的合成化學(xué)轉(zhuǎn)化和保護(hù)基團(tuán)方法(保護(hù)和 解保護(hù))是本領(lǐng)域已知的，包括，例如在R. Larock， Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989) ; T. W. Greene and P. G. M. Wuts， Protective Groups in Organic Synthesis, 2nd .ed.， John Wiley and Sons (1991) ; L. Fieser and M. Fieser， Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons ( 1994);和L Paquette， ed.， Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John. Wiley and Sons (1995)以及它們的后續(xù)版本中描述的那些.在一個(gè)方面，所述化合物是有機(jī)小分子，即，化合物具有小于1,000 amu的分子量，優(yōu)選的在350-750 arau之間.在其他方面，所述化合物 是(i)非肽類的那些；(ii)具有1到5個(gè)之間，包括雜環(huán)基或雜芳 基環(huán)基團(tuán)的那些，其可以進(jìn)一步帶有取代基；(iii)處于各自的藥學(xué)上 可接受鹽的形式的那些；或(iv)肽類的那些.
術(shù)語"雜環(huán)基"是指非芳香族的3-8元的單環(huán)的、8-12元的二 環(huán)的、或11-14元的三環(huán)的環(huán)系統(tǒng)，如果為單環(huán)具有l(wèi)-3個(gè)雜原子， 如果為二環(huán)具有1-6個(gè)雜原子，或如果為三環(huán)具有1-9個(gè)雜原子， 所述雜原子選自O(shè)、 N或S(例如，如果為單環(huán)、二環(huán)或三環(huán)，分別為 碳原子和N、 O或S的1-3、 1-6、或l-9個(gè)雜原子)，其中每個(gè)環(huán) 的0、 1、 2或3個(gè)原子可以被取代基取代.
術(shù)語"雜芳基"是指芳香族的5-8元的單環(huán)的、8-12元的二環(huán) 的、或11-14元的三環(huán)的環(huán)系統(tǒng)，如果為單環(huán)具有1-4個(gè)雜原子， 如果為二環(huán)具有1 _6個(gè)雜原子，或如果為三環(huán)具有1 — 9個(gè)雜原子， 所述雜原子選自O(shè)、 N或S(例如，如果為單環(huán)、二環(huán)或三環(huán)，分別為 碳原子和N、 O或S的1-4、 1-6、或l-9個(gè)雜原子)，其中每個(gè)環(huán) 的0、 1、 2、 3或4個(gè)原子可以被取代基取代.
術(shù)語"取代基"是指在烷基、環(huán)烷基、芳基、雜環(huán)基或雜芳基基 團(tuán)上在基團(tuán)的任何原子處被"取代"的基團(tuán).適合的取代基包括，無 限制地，烷基、烯基、炔基、烷氧基、面素、羥基、氰基、硝基、氨 基、S03H、全氟烷基、全氟烷氧基、亞甲二氧基、亞乙二氧基、羧基、 氧基、硫代、亞氨基(烷基、芳基、芳烷基)、S (O) n烷基(其中n 是0-2) 、 S (O) n芳基(其中n是0-2) 、 S (O) 雜芳基(其中n是 0-2) 、 S (O) 雜環(huán)基(其中n是0-2)、胺(單、二、烷基、環(huán)烷基、 芳烷基、雜芳烷基，和其組合)、酯(烷基、芳烷基、雜芳烷基)、 跣胺(單、二、烷基、芳烷基、雜芳烷基，和其組合)、磺胺(單、
二、烷基、芳烷基、雜芳烷基，和其組合)、未被取代的芳基、未被 取代的雜芳基、未被取代的雜環(huán)基、和未被取代的環(huán)烷基.在一個(gè)方 面，基團(tuán)上的取代基獨(dú)立地是上述取代基的任一單個(gè)，或上述取代基 的任何子集，
在本發(fā)明預(yù)想的化合物中取代基和可變項(xiàng)的組合，僅是引起穩(wěn)定 化合物形成的那些。如在此使用的，術(shù)語"穩(wěn)定"是指化合物，其具有的穩(wěn)定性足以允許制造，并且其維持化合物的完整性達(dá)到足夠時(shí) 間，對(duì)在此詳述的目的是有用的(例如，轉(zhuǎn)運(yùn)、保存、分析、向受試 者治療性施用).
此處的化合物的藥學(xué)上可接受的鹽包括來源于藥學(xué)上可接受的無 機(jī)的和有機(jī)的酸和堿的那些.適合的酸性鹽的實(shí)例包括醋酸鹽、己二 酸鹽、藻酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、丁酸
鹽、檸檬酸鹽、digluconate、乙烷磺酸鹽、甲酸鹽、延胡索酸鹽、羥乙 酸鹽、半硫酸鹽、heptanoate、已酸鹽、氫氯酸鹽、氬溴酸鹽、氫硤酸 鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、煙酸鹽、 硝酸鹽、palmoate、 pectinate、過硫酸鹽、辨酸鹽、苦酸鹽、特戊酸鹽、 丙酸鹽、水楊酸鹽、琥珀酸鹽、碗酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯 磺酸鹽和十一酸鹽。
在此描述化合物可以含有一個(gè)或多個(gè)不對(duì)稱中心，因而作為外消 旋物和外消旋混合物、單個(gè)對(duì)映異構(gòu)體、單獨(dú)的非對(duì)應(yīng)異構(gòu)體和非對(duì) 映混合物存在.這些化合物的所有這樣的同分異構(gòu)形式特意地包括在 本發(fā)明中.在此描述化合物也可以以互變異構(gòu)形式存在，所有這些都 包括在此.化合物也可以以順式-或反式-或E-或Z-雙鍵同分異構(gòu)形 式存在.這種化合物的所有這樣的同分異構(gòu)形式特意地包括在本發(fā)明 中.
結(jié)合分析
還可以評(píng)估測(cè)試化合物與包含mNav1.3 ot亞基的Na+通道結(jié)合的 能力.雖然Na+通道結(jié)合不是通道調(diào)節(jié)活性的先決條件，結(jié)合Na+通道 的化合物在調(diào)節(jié)通道的活性方面可能是有用的。例如，通過將化合物 例如底物與放射性同位素或酶標(biāo)記聯(lián)結(jié)，從而化合物例如底物與Na+ 通道的結(jié)合可以通過檢測(cè)復(fù)合物中的標(biāo)記化合物例如底物來確定，可 以實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn).做為選擇，包含在此描述的mNav1.3 a亞基的Na+通道 可以與放射性同位素或酶標(biāo)記聯(lián)結(jié)來監(jiān)視測(cè)試化合物調(diào)節(jié)復(fù)合物的能 力。例如，可以用12SI、 3SS、 "C、或SH直接或間接地標(biāo)記化合物，放 射性同位素可由放射的直接計(jì)數(shù)或閃爍計(jì)數(shù)來檢測(cè).做為選擇，可以 用例如辣根過氧化酶、堿性磷酸酶或熒光素酶來酶標(biāo)記化合物，酶標(biāo) 記可以通過檢測(cè)合適底物到產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化來測(cè)定。
可以評(píng)估測(cè)試化合物與包含mNav1.3 a亞基的Na+通道相互作用的能力，或在沒有標(biāo)記任何反應(yīng)物的情況下評(píng)估.例如，在不標(biāo)記化
合物或Na+通道的情況下可以使用微物理計(jì)(microphysiometer)來檢 測(cè)化合物與Na+通道的相互作用(McConneH， H. M. e, fl/" 5We"ce 257:1906-1912， 1992 ).如在此使用的，"微物理計(jì)"(例如，細(xì)胞傳 感器)是一種分析儀器，使用光可尋址的電勢(shì)傳感器(light-addressable potentiometricsensor, LAPS)測(cè)量細(xì)胞酸化其環(huán)境的速率，酸化速率 的變化可用作化合物和Na+通道之間的相互作用的指標(biāo).
在又一個(gè)實(shí)施方式中，提供了無細(xì)胞的分析，其中用測(cè)試化合物 接觸在此描述的Na+通道或其生物學(xué)活性部分，并評(píng)估測(cè)試化合物結(jié)合 所述通道或其生物學(xué)活性部分的能力.優(yōu)選的，所述無細(xì)胞分析包含 膜，無細(xì)胞分析涉及制備目標(biāo)基因蛋白和測(cè)試化合物的反應(yīng)混合物， 在一定條件下并持續(xù)足夠的時(shí)間，以容許兩種成分相互作用和結(jié)合， 從而形成可以除去和/或檢測(cè)的復(fù)合物.
例如，也可以使用熒光能量轉(zhuǎn)移(FET)(參見，例如Lakowicz et al.，美國(guó)專利No.5，631，169; Stavrianopoulos et al.，美國(guó)專利 No.4，868，103)來檢測(cè)兩種分子之間的相互作用，選擇在第一個(gè)"供體" 分子上的熒光團(tuán)標(biāo)記，從而它發(fā)射的熒光能量被第二個(gè)"接受體"分 子上的熒光標(biāo)記吸收，由于吸收的能量，其隨后能夠發(fā)出熒光，另一 方面，"供體"蛋白分子可能僅利用色氨酸殘基的天然熒光能量.選 擇發(fā)射不同的光波長(zhǎng)的標(biāo)記，從而"接受體"分子的標(biāo)記可以與"供 體"的區(qū)別開來.由于在標(biāo)記之間能量轉(zhuǎn)移的效率與分隔分子的距離 有關(guān)，可以評(píng)定分子之間的空間關(guān)系.當(dāng)結(jié)合在分子之間發(fā)生的情況 下，在分析中"接受體"分子標(biāo)記的熒光發(fā)射應(yīng)是最大的。通過本領(lǐng) 域公知的標(biāo)準(zhǔn)熒光檢測(cè)手段(例如，使用熒光計(jì))可以方便地測(cè)量FET 結(jié)合事件.
在另一個(gè)實(shí)施方式中，測(cè)定測(cè)試化合物結(jié)合在此描述的Na+通道 的能力可以使用實(shí)時(shí)生物分子互相作用分析(Biomoecular Interaction Analysis, BIA)來測(cè)定(參見，例如，Sjolander， S. and Urbaniczky， C.， J朋/. Of諷63:2338-2345， 1991; and Szabo e"/.， Cm/t. O/w". Ar"".
5:699-705， 1995 ),"表面胞質(zhì)團(tuán)共振(surface plasmon resonance)"或"BIA"實(shí)時(shí)地檢測(cè)生物特異性相互作用，而不用標(biāo) 記任何反應(yīng)物(例如，BIAcore).在結(jié)合表面處質(zhì)量的改變(指示結(jié)合事件)引起接近該表面的光線的折射率改變(表面胞質(zhì)團(tuán)共振(SPR) 的光學(xué)現(xiàn)象)，產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)，該信號(hào)可用作生物分子之間實(shí)時(shí)反 應(yīng)的指示.
在一個(gè)實(shí)施方式中，包含Na+通道或測(cè)試化合物的樣品被錨定在 固相上.錨定在固相上的通道/測(cè)試化合物可以在反應(yīng)結(jié)束進(jìn)行檢測(cè)。
期望的是，固定Na+通道、抗Na+通道抗體或其靶分子，以便于從 一種或兩種蛋白的未復(fù)合形式中分離復(fù)合了的形式，以及便于適應(yīng)分 析的自動(dòng)化.在存在或不存在候選化合物的情況下，化合物與Na+通道 的結(jié)合，或Na+通道與靶分子的相互作用，可以在任何適于容納反應(yīng)物 的容器中完成.這種容器的實(shí)例包括微量滴定板、試管和微量離心管。 在一個(gè)實(shí)施方式中，可以提供融合蛋白，其添加了容許一種或兩種蛋 白與基質(zhì)結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，例如，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶/mNa4.3 a亞基融 合蛋白或谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移蘇/靶融合蛋白可以被吸附在谷胱甘肽瓊脂 糖珠(Sigma Chemical, St. Louis, MO)或谷胱甘肽衍化的微量滴定板 上，其然后與測(cè)試化合物或包含Na+通道的測(cè)試化合物和樣品化合，所 述Na+通道包含GST標(biāo)記的亞基，并在有助于復(fù)合物形成的條件(例 如，鹽和pH值的生理?xiàng)l件)下孵化混合物.在觶化之后，洗滌珠子或 微量滴定板加樣孔以除去任何未結(jié)合的成分，對(duì)珠子的情況來說，例 如，如上所述直接或者間接地測(cè)定基質(zhì)固定化的復(fù)合物，
將Na+通道亞基的復(fù)合物固定在基質(zhì)上的其他技術(shù)包括使用生物 素和鏈霉抗生物素蛋白的接合.例如，生物素化的mNav1.3 a亞基蛋白 可以使用本領(lǐng)域已知4支術(shù)(例如，biotinylation kit, Pierce Chemicals, Rockford， IL)從生物素-NHS (N-羥基-琥珀酰亞胺)制得，并固定在 鏈審抗生物素蛋白包被的96孔板(Pierce Chemical)的加樣孔中。
為了進(jìn)行分析，將非固定化的成分添加到含有錨定成分的包被的 表面，在反應(yīng)完全后，在一定條件下除去未反應(yīng)的成分(例如，通過 洗滌)，從而任何形成的復(fù)合物仍保持固定在固體表面上，可以用許 多途徑實(shí)現(xiàn)錨定在固體表面的復(fù)合物的檢測(cè).當(dāng)早先的非固定化成分 被預(yù)先標(biāo)記時(shí)，檢測(cè)到表面上固定的標(biāo)記指示了復(fù)合物形成。當(dāng)早先 的非固定化成分沒有預(yù)先標(biāo)記時(shí)，可使用間接標(biāo)記來檢測(cè)錨定在表面 上的復(fù)合物；例如，使用特異于固定化成分的標(biāo)記的抗體(該抗體隨 后可以用例如標(biāo)記的抗Ig抗體直接標(biāo)記或間接標(biāo)記).在一個(gè)實(shí)施方式中，利用抗體進(jìn)行這種分析，所述抗體與Na+通 道上的表位反應(yīng)但是不干擾所述通道與目標(biāo)分子的結(jié)合.這種抗體可 以衍生化到平板的加樣孔，和未結(jié)合的靶點(diǎn)或通過抗體接合捕獲在加 樣孔中的Na+通道上.檢測(cè)這種復(fù)合物的方法，除了以上對(duì)于GST-固定化的復(fù)合物描述的之外，包括使用與Na+通道的成分有反應(yīng)性的抗 體進(jìn)行復(fù)合物的免疫檢測(cè)，以及依靠檢測(cè)與通道相關(guān)的酵活性的酶聯(lián) 分析.
做為選擇，可以在液相中進(jìn)行無細(xì)胞的分析.在這種分析中，通 過許多標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)的任何一種，包括但不限于差速離心(參見，例如 Rivas， G.， and Minton， A.P.， 7Vew必丑fOcAe附Sci' 18:284-7， 1993 );層對(duì)斤 (凝膠過濾層析、離子交換層析)；電泳和免測(cè)沉淀(參見，例如， Ausubel， F. ef flZ" eds, (1999) Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley: New York)，將反應(yīng)產(chǎn)物從未反應(yīng)的成分分離.這種樹脂和層 析技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(參見，例如，Heegaard，N.H.，/Mo/ 及ecogm7 11:141-8， 1998; Hage， D.S.， and Tweed, S.A.， / CT^o/mitogr丑 5W j外，/. 699:499-525， 1997).進(jìn)一步的，也可以方便地使用 如在此描述的熒光能量轉(zhuǎn)移來檢測(cè)結(jié)合而不需要進(jìn)一步從溶液中純化 復(fù)合物，優(yōu)選的，例如，通過包括膜成分或人工膜成分，無細(xì)胞分析 保持了 Na+通道復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，
在特定的實(shí)施方式中，所述分析包括使Na+通道或包含mNaY1.3 a 亞基的生物學(xué)活性部分的通道與結(jié)合所述通道的已知化合物接觸以形 成分析混合物，用測(cè)試化合物接觸分析混合物，并測(cè)定所述測(cè)試化合 物與Na+通道相互作用的能力，其中測(cè)定所述測(cè)試化合物與Na+通道相 互作用的能力包括，與已知化合物相比，測(cè)定所述測(cè)試化合物與Na+ 通道優(yōu)先結(jié)合的能力，或調(diào)整通道活性的能力.
在此描述的Na+通道可以在體內(nèi)與一種或多種細(xì)胞或細(xì)胞外大分 子，例如蛋白相互作用。為了這項(xiàng)論述，這種細(xì)胞和細(xì)胞外大分子在 此稱為"結(jié)合配偶體".破壞這種相互作用的化合物在調(diào)節(jié)目標(biāo)基因 產(chǎn)物的活性方面可能是有用的.這種化合物可以包括，但不限于例如 抗體、肽和小分子的分子.
為了鑒定干擾Na+通道與細(xì)胞外結(jié)合配偶體之間的相互作用的化 合物，制備含有目標(biāo)基因產(chǎn)物和結(jié)合配偶體的反應(yīng)混合物，在一定條件下并維持足夠的時(shí)間，以容許兩種產(chǎn)物形成復(fù)合物.為了測(cè)試抑制 試劑，在存在或不存在測(cè)試化合物的情況下提供反應(yīng)混合物.測(cè)試化
合物可以最初就包括在反應(yīng)混合物中，或可以在添加Na+通道和它的細(xì) 胞或細(xì)胞外結(jié)合配偶體之后一次添加.在沒有測(cè)試化合物或有安慰劑 的情況下辨化對(duì)照反應(yīng)混合物.然后檢測(cè)在Na+通道和細(xì)胞或細(xì)胞外結(jié) 合配偶體之間任何復(fù)合物的形成.在對(duì)照反應(yīng)中而不在含有測(cè)試化合 物的反應(yīng)混合物中復(fù)合物的形成表示，該化合物干擾了目標(biāo)基因產(chǎn)物 和互相作用的結(jié)合配偶體之間的相互作用.另外，在含有測(cè)試化合物 和正常目標(biāo)基因產(chǎn)物的反應(yīng)混合物內(nèi)的復(fù)合物形成，也可以與含有測(cè) 試化合物和包含一個(gè)或多個(gè)突變亞基的Na+通道的反應(yīng)混合物內(nèi)的復(fù) 合物形成進(jìn)行比較.在希望鑒定破壞突變體而不是正常目標(biāo)基罔產(chǎn)物 的相互作用的化合物的情況下，這種比較是很重要的.
這些分析可以以多相的或同相的形式進(jìn)行.多相的分析包括將 Na+通道或結(jié)合配偶體錨定在固相上，并在反應(yīng)結(jié)束時(shí)檢測(cè)錨定在固相 上的復(fù)合物.在同相的分析中，完整的反應(yīng)在液相中進(jìn)行，在任何一 種方法中，添加反應(yīng)物的順序可以不同，以獲得關(guān)于被測(cè)化合物的不 同信息.例如，通過例如竟?fàn)巵砀蓴_目標(biāo)基因產(chǎn)物和結(jié)合配偶體之間 的相互作用的測(cè)試化合物，可以通過在存在測(cè)試物質(zhì)的情況下進(jìn)行反 應(yīng)來鑒定.做為選擇，破壞已形成的復(fù)合物的測(cè)試化合物，即，從復(fù) 合物中替換出成分之一、具有更高結(jié)合常數(shù)的化合物，可以通過在已 經(jīng)形成復(fù)合物之后將測(cè)試化合物添加到反應(yīng)混合物中來檢測(cè)。以下簡(jiǎn) 述各種形式，
在多相分析系統(tǒng)中，目標(biāo)基因產(chǎn)物或互相作用的細(xì)胞或細(xì)胞外結(jié) 合配偶體被錨定在固體表面(例如，微量滴定板)上，而非錨定種類 被直接或間接地標(biāo)記.可以通過非共價(jià)的或共價(jià)的連接來固定化錨定 的種類.做為選擇，特異于被錨定種類的固定化抗體可用于將該種類 錨定到固體表面.
為了進(jìn)行分析，固定化種類的配偶體被暴露于有或者沒有測(cè)試化 合物的包被的表面.在反應(yīng)完全后，在一定條件下除去未反應(yīng)的成分 (例如，通過洗滌)，任何形成的復(fù)合物仍保持固定在固體表面上. 當(dāng)早先的非固定化種類被預(yù)先標(biāo)記時(shí)，檢測(cè)到表面上固定的標(biāo)記指示 了復(fù)合物形成.當(dāng)早先的非固定化種類沒有預(yù)先標(biāo)記時(shí)，可使用間接標(biāo)記來檢測(cè)錨定在表面上的復(fù)合物；例如，使用特異于最初的非固定 化種類的標(biāo)記的抗體(該抗體隨后可以用例如標(biāo)記的抗Ig抗體直接標(biāo) 記或間接標(biāo)記).取決于添加反應(yīng)成分的順序，可以檢測(cè)抑制復(fù)合物 形成的測(cè)試化合物或破壞已形成的復(fù)合物的化合物。
做為選擇，可以在存在或不存在測(cè)試化合物的情況下在液相中進(jìn) 行反應(yīng)，從未反應(yīng)的成分分離反應(yīng)產(chǎn)物，并檢測(cè)復(fù)合物；例如，使用 特異于結(jié)合成分之一的固定化抗體來锘定溶液中形成的任何復(fù)合物， 和使用特異于另一個(gè)配偶體的標(biāo)記的抗體來檢測(cè)錨定的復(fù)合物.再一 次，取決于向液相中添加反應(yīng)物的順序，可以鑒定抑制復(fù)合物形成的 測(cè)試化合物或破壞已形成的復(fù)合物的化合物.
在本發(fā)明的可選實(shí)施方式中，可以使用同相的分析.例如，制備 目標(biāo)基因產(chǎn)物和互相作用的細(xì)胞或細(xì)胞外結(jié)合配偶體產(chǎn)物的預(yù)先形成 的復(fù)合物，其中Na+通道亞基或它們的結(jié)合配偶體被標(biāo)記，但是由標(biāo)記 產(chǎn)生的信號(hào)由于復(fù)合物形成而淬滅(參見，例如，美國(guó)專利 No.4，109，496，其利用了這種方法進(jìn)行免疫測(cè)定)，添加與之竟?fàn)幉?預(yù)先形成的復(fù)合物替換出種類之一的測(cè)試物質(zhì)，將引起高于背景的信 號(hào)的產(chǎn)生.這樣，可以鑒定破壞目標(biāo)基因產(chǎn)物-結(jié)合配偶體相互作用 的測(cè)試物質(zhì)，
在又一個(gè)方面，Na+通道蛋白或其片段可被用作雙雜交分析或三 雜交分析中的"誘餌蛋白"(參見，例如，美國(guó)專利No.5，283，317; Zervos W fl/" CW/ 72:223-232， 1993; Madura " a/" 脅/. C7^饑268:12046-12054， 1993; Bartel" a/"脅《ec/^一es 14:920-924， 1993j Iwabuchi" a/.， Owo^e"e 8:1693-1696， 1993;和Brent WO94/10300)來鑒定其他蛋 白，所述蛋白結(jié)合或與Na+通道蛋白相互作用("Na+通道結(jié)合蛋白" 或"Na+通道-bp")并涉及Na+通道活性.這種Na+通道-bp可能是Na+ 通道或Na+敏感性目標(biāo)發(fā)送信號(hào)的活化物或抑制物。
雙雜交系統(tǒng)基于大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子的模塊特性，其由可分的DNA 結(jié)合和活化結(jié)構(gòu)域組成。簡(jiǎn)要地，該分析利用了兩種不同的DNA構(gòu)建 體.在一個(gè)構(gòu)建體中，編碼Na+通道a亞基蛋白或其片段(即，相應(yīng)于 亞基的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的可溶部分)的基因被融合到編碼已知轉(zhuǎn)錄因子 (例如，GAL-4)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的基因.在另一個(gè)構(gòu)建體中，來 自DNA序列庫、編碼未鑒別的蛋白("被捕物(prey)"或"樣品")的DNA序列被融合到編碼已知轉(zhuǎn)錄因子的活化結(jié)構(gòu)域的基因。(做為 選擇，Na+通道亞基可以與活化結(jié)構(gòu)域融合.)如果"誘斜"和"被捕 物"蛋白能夠在體內(nèi)相互作用，形成Na+通道亞基依賴性復(fù)合物，轉(zhuǎn)錄 因子的DNA結(jié)合和活化結(jié)構(gòu)域被帶至緊密鄰近.這種鄰近容許報(bào)告基 因(例如，lacZ)的轉(zhuǎn)錄，所述報(bào)告基因與對(duì)所述轉(zhuǎn)錄因子起反應(yīng)的轉(zhuǎn) 錄調(diào)節(jié)位點(diǎn)可操作連接.可以檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)，可以分離含有功 能性轉(zhuǎn)錄因子的細(xì)胞克隆，并用于獲得編碼與Na+通道亞基相互作用的 蛋白的基因.
在另一個(gè)實(shí)施方式中，鑒定Na+通道亞基表達(dá)的調(diào)節(jié)物.例如， 用候選化合物接觸細(xì)胞或無細(xì)胞混合物，相對(duì)于不存在該候選化合物 的情況下mNav1.3 a亞基mRNA或蛋白的表達(dá)水平，評(píng)估m(xù)Nav1.3 a 亞基mRNA或蛋白的表達(dá)，當(dāng)存在候選化合物的情況下mNav1.3 a亞 基mRNA或蛋白的表達(dá)大于不存在的情況時(shí)，該候選化合物被鑒定為 mNav1.3 a亞基mRNA或蛋白表達(dá)的刺激物.另外地，當(dāng)存在候選化 合物的情況下mNav1.3 a亞基mRNA或蛋白的表達(dá)小于(統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯 著的小于)不存在的情況時(shí)，該候選化合物被鑒定為mNav1.3 a亞基 mRNA或蛋白表達(dá)的抑制物.可以通過在此描述的用于檢測(cè)mNav1.3a 亞基mRNA或蛋白的方法來測(cè)定mNav1.3 a亞基mRNA或蛋白表達(dá)的 水平.
在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及在此描述的兩種或多種分析的組合， 例如，可以使用基于細(xì)胞的或無細(xì)胞的分析來鑒定調(diào)節(jié)試劑，試劑調(diào) 節(jié)Na+通道的能力可以在體內(nèi)，例如，在動(dòng)物體內(nèi)證實(shí)，所述動(dòng)物例如 疼痛失調(diào)的或與中風(fēng)或外傷性腦損傷有關(guān)的失調(diào)的動(dòng)物模型.
本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過上述篩選分析鑒定的新的試劑.因此，在 本發(fā)明的范圍內(nèi)的是，進(jìn)一步在合適的動(dòng)物模型中使用如在此描述鑒 定的試劑(例如，mNavl.3a亞基通道調(diào)節(jié)試劑、相應(yīng)于在此描述的一 種或多種Na+通道亞基的反義核酸分子、通道特異性抗體、或mNayl.3 a亞基通道結(jié)合配偶體)來確定用這種試劑治療的效力、毒性、副作用 或作用機(jī)制.此外，通過上述篩選分析鑒定的新的試劑可用于在此描 述的治療.
本發(fā)明的診斷和預(yù)后分析包括評(píng)定mNav1.3 a亞基的表達(dá)水平和 鑒定mNav1.3 a亞基分子的核苷酸或氨基酸序列中的變異和突變的方法.
表達(dá)監(jiān)視和分布型.通過從測(cè)試受試者獲得生物樣品，用能夠檢
測(cè)inNav1.3 a亞基蛋白或編碼mNav1.3 a亞基蛋白的核酸(例如， mRNA、基因組DNA)的化合物或試劑接觸該生物樣品，從而在該生 物樣品中檢測(cè)所述蛋白或核酸的存在，可以評(píng)估在生物樣品中mNav1.3 a亞基蛋白或核酸的存在、水平或缺乏.術(shù)語"生物樣品"包括從受試 者分離的組織、細(xì)胞和生物學(xué)液體，以及存在于受試者體內(nèi)的組織、 細(xì)胞和液體.優(yōu)逸的生物樣品是腦組織.可以用許多方法測(cè)量mNav1.3 ot亞基基因的表達(dá)水平，包括但不限于測(cè)量mNa4,3a亞基基因編碼 的mRNA;測(cè)量mNavl.3 a亞基基因編碼的蛋白的數(shù)量；或測(cè)量mNavl.3 a亞基編碼的蛋白的活性.
在細(xì)胞中與mNav1.3 a亞基基因相應(yīng)的mRNA的水平可以通過原 位的和通過體外的形式來測(cè)定.
分離的mRNA可被用于雜交或擴(kuò)增分析，包括但不限于，Southern 或Northern分析、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析和探針陣列.檢測(cè)mRNA水平 的一種診斷方法包括用能夠與要檢測(cè)的基因編碼的mRNA雜交的核酸 分子(探針)與分離的mRNA接觸.核酸探針可以是，例如，全長(zhǎng)Na+ 通道a亞基核酸，例如在此描述的核酸或其部分，例如長(zhǎng)度至少7、 15、 30、 50、 100、 250或500個(gè)核苷酸，并足以在嚴(yán)格條件下與Na+通道a 亞基mRNA或基因組DNA特異性雜交的寡核苷酸，所述探針可以布 置在陣列，例如以下所述陣列的地址上.在此描述了用于診斷分析的 其他適合的探針.
在一種形式中，mRNA (或cDNA)被固定在表面上并與探針接 觸，例如通過通過使分離的mRNA在瓊脂糖凝膠上跑動(dòng)并將mRNA從 凝膠轉(zhuǎn)移到膜，例如硝化纖維上.在一種選擇性的形式中，探針被固 定在表面上，用探針接觸mRNA (或cDNA)，例如，在以下所述的 二維基因碎片陣列中，技術(shù)人員可以修改已知的mRNA檢測(cè)方法，用 于檢測(cè)mNav1.3 a亞基基因編碼的mRNA的水平.
樣品中由mNa4,3a亞基基因編碼的mRNA的水平可以用核酸擴(kuò) 增，例如，通過rtPCR ( MuUis (1987)美國(guó)專利No.4，683，202)、連 接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Barany， /Voc. Wfl".爿carf. 5W. CASJ 88:189-193， 1991)、 自持的序列復(fù)制(Guatelli" a/.， /Voc. iVa". Jcarf. fAS/i 87:1874-1878，1990)、轉(zhuǎn)錄放大系統(tǒng)(Kwoh rt a/" iVoc. iVa". ^cflw/. Sd. tASJ 86:1173-1177， 1989) 、 Q-Beta復(fù)制酶(Lizardi W fl/"所0/recA朋/05y 6:1197,1988)、滾環(huán)復(fù)制(Uzardi e/fl/.， U.S. Patent No.5，854，033)或 任何其他核酸擴(kuò)增方法，隨后使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)檢測(cè)擴(kuò)增的分子 來進(jìn)行評(píng)估，如在此使用的，擴(kuò)增引物被定義為核酸分子對(duì)，其可以 與基因的5，或3，區(qū)域退火(分別為正鏈和負(fù)鏈，或反之)并在中間含 有短的區(qū)域. 一般地，擴(kuò)增引物的長(zhǎng)度約10到30個(gè)核苷酸，側(cè)翼是 長(zhǎng)度約50到200個(gè)核苷酸的區(qū)域.在適合的條件下使用適合的試劑， 這種引物允許擴(kuò)增包含該引物的側(cè)翼核苷酸序列的核酸分子.
對(duì)于原位方法，可以制備/加工細(xì)胞或組織樣品并固定在支持物、 一般是玻璃栽片上，然后與能和要分析的mNav1.3 a亞基基因編碼的 mRNA雜交的探針接觸.
在另一個(gè)實(shí)施方式中，此處的方法進(jìn)一步包括用能夠檢測(cè) mNav1.3 a亞基mRNA或基因組DNA的化合物或試劑接觸對(duì)照樣品， 然后比較對(duì)照樣品中mNavl,3 a亞基mRNA或基因組DNA的存在和測(cè) 試樣品中mNav1.3 a亞基mRNA或基因組DNA的存在.在再另一個(gè)實(shí) 施方式中，如美國(guó)專利No.5，695，937中描述的基因表達(dá)的系列分析被用 于檢測(cè)mNav1.3 a亞基轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物水平.
可以使用各種方法來確定mNav1.3 a亞基基因編碼的蛋白的水 平. 一般地，這些方法包括用選擇性結(jié)合該蛋白的試劑，例如抗體與 樣品接觸，來評(píng)估樣品中的蛋白水平.在特定的實(shí)施方式中，所述抗 體帶有可檢測(cè)的標(biāo)記.抗體可以是多克隆的，或更優(yōu)選的，是單克隆 的.可以使用完整抗體或其片段(例如，F(xiàn)ab或F(ab')2).術(shù)語"標(biāo) 記的"關(guān)于探針或抗體時(shí)，意圖包括通過將可檢測(cè)物質(zhì)聯(lián)結(jié)(即，物 理地連接)到探針或抗體上直接標(biāo)記探針或抗體，以及通過與可檢測(cè) 物質(zhì)的反應(yīng)性間接標(biāo)記探針或抗體，在此提供了可檢測(cè)物質(zhì)的實(shí)例。
所述檢測(cè)方法可以用于體外和體內(nèi)檢測(cè)生物樣品中的mNav1.3 a 亞基蛋白。檢測(cè)蛋白的體外技術(shù)包括酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)、 免測(cè)沉淀、免疫熒光、酶免疫測(cè)定(EIA)、放射性免疫測(cè)定(RIA)、 和Western blot分析.檢測(cè)蛋白的體內(nèi)技術(shù)包括向受試者中導(dǎo)入標(biāo)記 的抗mNav:L3a亞基抗體.例如，可以用放射性標(biāo)記物標(biāo)記抗體，在受 試者中放射性標(biāo)記物的存在和位置可以通過標(biāo)準(zhǔn)成像技術(shù)來檢測(cè).在另一個(gè)實(shí)施方式中，樣品被標(biāo)記，例如，被生物素化，然后與抗體接
觸，例如，位于抗體陣列(如下所述)中的抗mNav:L3a亞基抗體?？?以用例如與熒光標(biāo)記聯(lián)結(jié)的抗生物素蛋白檢測(cè)樣品.
在另 一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括用能夠檢測(cè)mNav1.3 a 亞基蛋白的化合物或試劑與對(duì)照樣品接觸，并比較對(duì)照樣品中蛋白的 存在和測(cè)試樣品中蛋白的存在.
本發(fā)明還包括用于檢測(cè)生物樣品中mNav1.3 a亞基蛋白的存在的 試劑盒.例如，所述試劑盒可以包括能夠檢測(cè)生物樣品中mNav1.3 a 亞基蛋白或mRNA的化合物或試劑；和標(biāo)準(zhǔn).所述化合物或試劑可以 包裝在適合的容器中。所述試劑盒可以進(jìn)一步包括使用該試劑盒檢測(cè) mNavl,3a亞基蛋白或核酸的說明，
對(duì)于基于抗體的試劑盒，該試劑盒可以包括(l)與相應(yīng)于本發(fā) 明的標(biāo)記物的多肽結(jié)合的第一抗體(例如，附著于固相支持物)；和， 任選的，(2)結(jié)合所述多肽或所迷第一抗體、并與可檢測(cè)試劑連接的 第二種不同的抗體.
對(duì)于基于寡核苷酸的試劑盒，所述試劑盒可以包括U)寡核苷 酸，例如，可檢測(cè)地標(biāo)記的寡核苷酸，其與編碼相應(yīng)于本發(fā)明的標(biāo)記 物的多肽的核苷酸序列雜交，或(2)對(duì)于擴(kuò)增相應(yīng)于本發(fā)明的標(biāo)記物 的核酸分子有用的引物對(duì)。所述試劑盒還可以包括緩沖劑、防腐劑或 蛋白穩(wěn)定劑.所述試劑盒還可以包括檢測(cè)所述可檢測(cè)試劑(例如，酶 或底物)所需的成分.所述試劑盒還可以含有對(duì)照樣品或一系列對(duì)照 樣品，其可以被分析并與所含的測(cè)試樣品比較.試劑盒的每種成分可 以封閉在單獨(dú)的容器內(nèi)，所有各種容器可以在單個(gè)包裝內(nèi)，伴有用于 解釋使用該試劑盒進(jìn)行分析的結(jié)果的說明.
在此描述的診斷方法可以鑒定患有與Na+通道表達(dá)或活性有關(guān)的 疾病或失調(diào)、或有發(fā)展出所述疾病或失調(diào)的風(fēng)險(xiǎn)的受試者.如在此使 用的，術(shù)語"不需要的"包括在生物反應(yīng)例如神經(jīng)性疼痛中涉及的不 需要的現(xiàn)象。
在一個(gè)實(shí)施方式中，鑒定與Na+通道表達(dá)或活性有關(guān)的疾病或失 調(diào).從受試者獲得測(cè)試樣品，評(píng)估一種或多種Na+通道蛋白或核酸(例 如，mRNA或基因組DNA)，其中Na+通道蛋白或核酸的水平，例如， 存在或不存在，是受試者患有與Na+通道表達(dá)或活性有關(guān)的疾病或失調(diào)、或有發(fā)展出所述疾病或失調(diào)的風(fēng)險(xiǎn)的診斷依據(jù)。如在此使用的， "測(cè)試樣品"是指從感興趣的受試者獲得的生物樣品，包括生物液體 (例如，血清)、細(xì)胞樣品、或組織，例如腦組織.
在此描述預(yù)后分析可用于確定受試者是否可以施用試劑(例如，
激動(dòng)劑、拮抗劑、肽模擬物、蛋白、肽、核酸、小分子或其他藥物候
選者)來治療與mNav1.3 a亞基表達(dá)或活性有關(guān)的疾病或失調(diào).例如， 這種方法可用于確定受試者是否可以用試劑有效地治療疼痛失調(diào)或外 傷性腦損傷.
在另一個(gè)方面，本發(fā)明表征了具有大量數(shù)字編碼的數(shù)據(jù)記錄的計(jì) 算機(jī)媒介.每個(gè)數(shù)據(jù)記錄包括代表樣品中mNav1.3 a亞基通道的表達(dá)水 平或活性的值和對(duì)樣品的描述.對(duì)樣品的描述可以是樣品的標(biāo)識(shí)符、 處理該樣品的化合物、得出該樣品的受試者(例如，患者)、診斷、 或治療(例如，優(yōu)選的治療).在特定的實(shí)施方式中，所述數(shù)據(jù)記錄 進(jìn)一步包括代表除mNavl,3a亞基通道以外的基因(例如，與失調(diào)相關(guān) 的其他基因，所述失調(diào)與mNa4,3a亞基通道的活性有關(guān)，或陣列上的 其他基因)的表達(dá)水平的值.所述數(shù)據(jù)記錄可以構(gòu)造為表格，例如， 作為數(shù)據(jù)庫的部分的表格，所述數(shù)據(jù)庫例如關(guān)系數(shù)據(jù)庫(例如，Oracle 或Sybase數(shù)據(jù)庫環(huán)境中的SQL數(shù)據(jù)庫).
還表征的是評(píng)估樣品的方法.所述方法包括提供樣品，例如來自 受試者的樣品，并測(cè)定該樣品的基因表達(dá)分布型，其中所述分布型包 括代表mNav1.3 a亞基通道表達(dá)或活性的水平的值，所述方法可進(jìn)一步 包括與參考值或參考分布型比較所述值或所述分布型(即，多個(gè)值).
可以通過在此描述的任何方法獲得樣品的基因表達(dá)分布型(例如，通 過提供來自樣品的核酸并使核酸與陣列接觸，或通過分析樣品中 mNav1.3 a亞基通道的活性).所述方法可以用于診斷受試者中的失 調(diào)，其中mNav1.3 a亞基表達(dá)的變化是所述受試者患有或傾向于患有失 調(diào)的指示。所述方法可用于監(jiān)視受試者中的治療，例如，疼痛的治療. 例如，可以確定來自經(jīng)歷了治療的受試者的樣品的基因表達(dá)分布型. 所述分布型可以與參考分布型、或與從治療前或疾病發(fā)作前的受試者 獲得的分布型進(jìn)行比較(參見，例如，Golub W "/ ， 5Wewce 286:531， 1999)
在又一個(gè)方面，本發(fā)明表征了評(píng)估測(cè)試化合物的方法(也參見，上文的"篩選分析").所述方法包括提供細(xì)胞和測(cè)試化合物；用測(cè) 試化合物接觸細(xì)胞；獲得對(duì)于接觸的細(xì)胞的受試者表達(dá)分布型；和將 所述受試者表達(dá)分布型與 一個(gè)或多個(gè)參考分布型進(jìn)行比較.所迷分布 型包括代表mNav1.3 a亞基活性或表達(dá)的水平的值.在特定的實(shí)施方式 中，將受試者活性或表達(dá)分布型與目標(biāo)分布型比較，例如，標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞 的分布型或細(xì)胞的期望條件的分布型.扭比從未接觸的細(xì)胞獲得的表 達(dá)分布型，如果所述受試者表達(dá)分布型更類似于目標(biāo)分布型，測(cè)試化 合物被好意地(favorably)評(píng)估.
在另一個(gè)方面，本發(fā)明表征了評(píng)估受試者的方法.所述方法包括 a)從受試者獲得樣品，例如，從護(hù)理者獲得，例如，從受試者獲取樣 品的護(hù)理者；b)測(cè)定該樣品的受試者表達(dá)分布型.任選的，所述方法 進(jìn)一步包括以下步驟之一或兩個(gè)c)將所述受試者表達(dá)分布型與一個(gè) 或多個(gè)參考表達(dá)分布型比較；和d)選擇與受試者參考分布型最相似的 參考分布型.受試者表達(dá)分布型和參考分布型包括代表mNav1.3 a亞基 活性或表達(dá)的水平的值.可以使用各種常規(guī)的統(tǒng)計(jì)度量來比較兩種參 考分布型. 一個(gè)可能的度規(guī)是作為兩種分布型之間的差異的距離向量 的長(zhǎng)度.每個(gè)受試者和參考分布型被表示為多維的向量，其中每個(gè)維 度是分布型中的值。
所述方法可以進(jìn)一步包括將結(jié)果傳送給護(hù)理者.所述結(jié)果可以是 受試者表達(dá)分布型、或受試者表達(dá)分布型與另一個(gè)分布型比較的結(jié) 果、或任何上述的描述.所述結(jié)果可以在計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)上傳送，例如， 所述結(jié)果可以處于計(jì)算機(jī)傳輸?shù)男问?，例如，嵌入在栽波中的?jì)算機(jī) 數(shù)據(jù)信號(hào).
還表征的是具有可執(zhí)行代碼的計(jì)算機(jī)媒介，所述可執(zhí)行代碼實(shí)現(xiàn) 以下步驟接收受試者表達(dá)分布型(例如，在此描述的任何受試者表 達(dá)分布型)；訪問參考表達(dá)分布型的數(shù)據(jù)庫；和i)選擇最相似于所述 受試者表達(dá)分布型的匹配參考分布型，或ii)為所述受試者表達(dá)分布型 與至少一個(gè)參考分布型的相似性確定至少一個(gè)比較分值。受試者表達(dá) 分布型和參考表達(dá)分布型各自包括包括代表mNav1.3 a亞基活性或表 達(dá)的水平的值。
陣列和其用途
在另一個(gè)方面，本發(fā)明表征了包括具有多個(gè)地址的底物的陣列。所述多個(gè)地址(plurality)的至少一個(gè)地址包括俘獲探針，所述俘獲探 針特異性地結(jié)合相應(yīng)于Na+通道a亞基的分子，例如mNavl,3 ot亞基 核酸或多肽，所述陣列可以具有至少10、 100、 l，OOO或10,000或更多 個(gè)地址/ 112的密度，并在這之間變動(dòng).所述底物可以是二維的底物， 例如玻璃栽片、薄片(例如，硅質(zhì)或塑料的)、質(zhì)譜平板，或是三維 底物例如凝膠墊.除了多個(gè)地址以外的地址可以布置在陣列上.
在特定的實(shí)施方式中，多個(gè)地址的至少一個(gè)地址包括核酸俘獲探 針，所述核酸俘獲探針與mNav1.3 oc亞基核酸，例如正義或反義鏈特 異性雜交.多個(gè)地址的地址子集可以是編碼mNav1.3 a亞基的Na+通 道基因的核酸俘獲探針.子集的每個(gè)地址包括與mNav1.3 oc亞基核酸 的不同區(qū)域雜交的俘獲探針。所述陣列可用于通過雜交來給基因測(cè)序 (參見，例如，美國(guó)專利No.5，695，940),
可以通過各種方法產(chǎn)生陣列，例如，通過光刻法(參見，例如， 美國(guó)專利Nos. 5,143,854; 5,510,270;和5，527，681)、機(jī)械方法(例如， 如美國(guó)專利No.5，384，261中描述的導(dǎo)向流動(dòng)方法)、基于針的方法(例 如，如美國(guó)專利No.5，288，514描述的)，和基于珠子的技術(shù)(例如，在 PCT US/93/04145中描述的).
在另一個(gè)實(shí)施方式中，多個(gè)地址的至少一個(gè)地址包括多肽俘獲探 針，所述多肽俘獲探針與mNa4.3 a亞基多肽或其片段特異性結(jié)合。 所述多肽可以是mNav1.3 ot亞基多肽的天然發(fā)生的相互作用配偶體. 優(yōu)選的，所述多肽是抗體，例如在此描述的抗體(參見"抗niNav1.3 cx 亞基抗體")，例如單克隆抗體或單鏈抗體.
在另一個(gè)方面，本發(fā)明表征了分析mNa4.3 a亞基表達(dá)的方法. 所述方法包括提供如上所述的陣列；用樣品接觸所述陣列，并檢測(cè) mNav1.3 a亞基分子(例如，核酸或多肽)與所述陣列的結(jié)合.任選 的所述方法進(jìn)一步包括在與所述陣列接觸之前或期間從樣品擴(kuò)增核 酸.
在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述陣列可用于分析組織中的基因表達(dá)以 確定在所述陣列中基因的組織專一性，特別是mNav1.3 a亞基的表 達(dá).如果分析了足夠數(shù)量的各種樣品，群集(clustering)(例如，分 級(jí)群集、k-means群集、Bayesian群集等等)可被用于鑒定與mNavl.3 a亞基共調(diào)節(jié)的基因.例如，所述可用于多個(gè)基因的表達(dá)的定量。因而，不僅是組織專一性，而且組織中基因套組(battery of genes)的表 達(dá)水平也被確定.定量數(shù)據(jù)可根據(jù)它們本身的組織表達(dá)和在該組織中 的表達(dá)水平用于給基因分組(例如，分群).
例如，基因表達(dá)的陣列分析可以用于評(píng)定細(xì)胞-細(xì)胞相互作用對(duì) mNav1.3 ot亞基表達(dá)的影響.可以擾動(dòng)笫一組織，可以分析來自笫二 組織、與笫一組織相互作用的核酸.關(guān)于這一點(diǎn)，可以測(cè)定響應(yīng)于生
物學(xué)刺激一種細(xì)胞類型對(duì)另一種細(xì)胞類型的影響，例如，來監(jiān)視細(xì)胞-細(xì)胞相互作用在基因表達(dá)水平的影響.
在另一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞與治療劑接觸，使用陣列測(cè)定細(xì)胞的 表達(dá)分布型，將該表達(dá)分布型與未與所述試刑接觸的類似細(xì)胞的分布 型進(jìn)行比較.例如，所述分析可用于確定或分析治療試劑的不需要的 影響的分子基礎(chǔ).如果治療性施用試劑來治療一種細(xì)胞類型，但對(duì)另 一種細(xì)胞類型具有不需要的影響，本發(fā)明提供了一種分析來確定這種 不需要的影響的分子基礎(chǔ)，因而提供了共施用抵抗試刑或治療不需要 的影響的機(jī)會(huì)。類似地，即使在單個(gè)細(xì)胞類型中，可以在分子水平測(cè) 定不需要的生物學(xué)影響.因而，可以確定和抵消試劑對(duì)目標(biāo)基因以外 的基因的表達(dá)的影響.
在另 一 個(gè)實(shí)施方式中，所述陣列可以用于監(jiān)視在陣列中與時(shí)間有 關(guān)的一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)。例如，從不同時(shí)點(diǎn)獲得的樣品可以用所 述陣列探察。這種分析可以鑒定和/或表征與Na+通道活性有關(guān)的疾病 或失調(diào)的發(fā)展.這種方法也可以評(píng)估Na+通道相關(guān)疾病或失調(diào)的治療和 /或發(fā)展，
這種陣列對(duì)于確定一個(gè)或多個(gè)基因在正常和異常的細(xì)胞中的差別
表達(dá)模式也是有用的.這提供了可以充當(dāng)診斷或治療介入的分子靶點(diǎn) 的基因的套組(例如，包括編碼mNav1.3 a亞基的基因).
在另一個(gè)方面，本發(fā)明表征了包括具有多個(gè)地址的陣列.多個(gè)地 址的每一個(gè)地址包括獨(dú)特的多肽.多個(gè)地址的至少一個(gè)地址之上已經(jīng) 布置了 mNav1.3 a亞基多肽或其片段。本領(lǐng)域描述了產(chǎn)生多肽陣列的 方法，例如在De Wildt" a/" 7Vfl似re丑/Wed 18: 989-994， 2000; Lueking W a/" ^iwfl/.丑,oc/^肌270:103-111， 1999; Ge， H.， A^iic/e/c 28:e3， I-VII， 2000; MacBeath， G.， and Schreiber， S丄.，5W潔e 289:1760-1763， 2000;和WO 99/51773A1中.在特定實(shí)施方式中，多個(gè)地址的每一個(gè)地址在其上已經(jīng)布置了至少60%-99%相同于mNav1.3 ot亞基多肽或其片段的多肽，例如，mNav1.3 a亞基多肽的多種變體 (例如，等位變體編碼的、針對(duì)位點(diǎn)的突變體、隨機(jī)的突變體或組合 突變體)可被置于多個(gè)地址的單個(gè)地址上.
多肽陣列可用于檢測(cè)Na+結(jié)合化合物，例如，在來自受試者的樣 品中與mNav1.3 a亞基多肽有特異性的抗體，或檢測(cè)Na+通道結(jié)合蛋白 或配體的存在.
在另一個(gè)方面，本發(fā)明表征了分析多種探針的方法.例如，對(duì)于 分析基因表達(dá)，所述方法是有用的.所述方法包括提供具有多個(gè)地 址的二維陣列，多個(gè)地址的每一個(gè)在位置上可以相互區(qū)分，多個(gè)地址 具有獨(dú)特的俘獲探針，例如，其中所述俘獲探針來自表達(dá)包含mNa4.3 a亞基的Na+通道的細(xì)胞或受試者，或來自在其中已經(jīng)引發(fā)了 Na+通道 介導(dǎo)的反應(yīng)的細(xì)胞或受試者，例如，通過用Na+通道m(xù)Nav1.3 a亞基核 酸或蛋白接觸所述細(xì)胞，或向所述細(xì)胞或受試者施用Na+通道m(xù)Na4.3 a亞基核酸或蛋白；提供具有多個(gè)地址的二維陣列，多個(gè)地址的每一個(gè) 在位置上可以相互區(qū)分，多個(gè)地址具有獨(dú)特的俘獲探針，例如，其中 所述俘獲探針來自不表達(dá)Na+通道m(xù)Navl.3 a亞基s (或不象俘獲探針 的Na+通道m(xù)Navl.3a亞基陽性多個(gè)地址的情況下表達(dá)那么高)的細(xì)胞 或受試者，或來自其中沒有引發(fā)了 Na+通道介導(dǎo)的反應(yīng)的細(xì)胞或受試者 (或比笫一樣品引發(fā)了較小的程度)；用一個(gè)或多個(gè)查詢探針與陣列 接觸，(其優(yōu)選的不同于Na+通道m(xù)Na4.3a亞基核酸、多肽或抗體)， 從而評(píng)估多個(gè)俘獲探針.結(jié)合，例如，對(duì)于核酸來說，在多個(gè)地址的 地址上與俘獲探針的雜交，通過例如附著于核酸、多肽或抗體的標(biāo)記
產(chǎn)生的信號(hào)來檢測(cè).
在另一個(gè)方面，本發(fā)明表征了分析mNavl,:Ja亞基的方法，例如， 分析結(jié)構(gòu)、功能、或與其他核酸或氨基酸序列的關(guān)系.所述方法包括 提供mNav1.3 a亞基核酸或氨基酸序列；將該序列與來自序列集合的一 個(gè)或多個(gè)，優(yōu)選的多個(gè)序列進(jìn)行比較，所述序列集合例如，核酸或蛋 白序列數(shù)據(jù)庫；從而來分析mNa4,3a亞基亞基.
麵俯
在此鑒定的cDNA序列的部分或片段(和相應(yīng)的完整基因序列)可以在多種方面用作多核苷酸試劑.
例如，多核苷酸試劑可用于診斷分析、預(yù)后分析，監(jiān)視臨床試驗(yàn) 被用于預(yù)后(預(yù)測(cè))目的從而來預(yù)防性地治療個(gè)體.因此，本發(fā)明的 一個(gè)方面涉及確定在生物樣品(例如，血液、血清、細(xì)胞、組織)的
環(huán)境中inNav1.3 a亞基蛋白和/或核酸表達(dá)以及mNav1.3 a亞基活性的 診斷分析，從而來確定個(gè)體是否患有疾病或失調(diào)，或存在發(fā)展出失調(diào) 的風(fēng)險(xiǎn)，所述疾病或失調(diào)與異常的或不需要的mNav1.3 a亞基表達(dá)或活 性有關(guān).本發(fā)明還提供了預(yù)后(或預(yù)測(cè))分析，用于確定個(gè)體是否存 在發(fā)展出與mNav1.3 a亞基蛋白、核酸表達(dá)或活性有關(guān)的失調(diào)的風(fēng)險(xiǎn). 例如，可以分析生物樣品中編碼mNav:L3a亞基的基因中的突變，并用 于預(yù)后或預(yù)測(cè)目的.
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及監(jiān)視試劑(例如，藥物、化合物)對(duì)體 內(nèi)mNavl.3a亞基的表達(dá)或活性的影響.
監(jiān)視試劑(例如，藥物)對(duì)mNavl.3 a亞基蛋白的表達(dá)或活性的 影響(例如，調(diào)節(jié)膜興奮性)不僅可應(yīng)用于基礎(chǔ)藥物篩選，還可應(yīng)用 于臨床試驗(yàn).例如，通過在此描述的篩選分析確定的試劑提高mNav1.3 a亞基基因表達(dá)、蛋白水平或上調(diào)mNavl.;3a亞基活性的有效性，可以 在對(duì)展現(xiàn)出降低或升高的mNav1.3 a亞基基因表達(dá)、蛋白水平，下調(diào) mNavl.3 a亞基的受試者的臨床試驗(yàn)中監(jiān)視.與例如Na+通道相關(guān)的失 調(diào)有關(guān)的其他基因可用作特定細(xì)胞的表型的標(biāo)記。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及為了治療目的調(diào)節(jié)mNav1.3 a亞基表達(dá) 或活性的方法.因此，在示范性的實(shí)施方式中，本發(fā)明的調(diào)節(jié)方法包 括用mNav1.3 a亞基或試劑接觸細(xì)胞，所述試劑調(diào)節(jié)與細(xì)胞相關(guān)的 mNavl.3a亞基蛋白活性的一種或多種活性。調(diào)節(jié)mNa4.3a亞基蛋白 活性的試劑可以是在此描述的試劑，例如核酸或蛋白、mNav:L3a亞基 蛋白的天然發(fā)生的靶分子(例如，mNav1.3 a亞基底物)、mNav1.3 a 亞基抗體、mNav1.3 a亞基激動(dòng)劑或拮抗劑、mNav1.3 a亞基激動(dòng)劑或 拮抗劑的肽模擬物、或其他小分子.在一個(gè)實(shí)施方式中，所述試劑刺 激一種或多種mNav1.3 a亞基活性.這種刺激試劑的實(shí)例包括活性 mNav1.3 a亞基蛋白和已經(jīng)被導(dǎo)入細(xì)胞、編碼mNav1.3 a亞基的核酸分子.在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述試劑抑制一種或多種mNavl.3ot亞基活 性.這種抑制試刑的實(shí)例包括反義mNav1.3 a亞基核酸分子、抗mNav1.3 a亞基抗體和mNav1.3 ot亞基抑制物.這些調(diào)節(jié)方法可以在體外進(jìn)賴?yán)?如，通過培養(yǎng)細(xì)胞和所述試劑)，或作為選擇，在體內(nèi)進(jìn)行(例如， 通過向受試者施用所述試劑)。因而，本發(fā)明提供治療患有疾病或失 調(diào)的個(gè)體的方法，所述疾病或失調(diào)以mNav1.3 a亞基蛋白或核酸分子的 異?；虿恍枰谋磉_(dá)或活性為特征.在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法包 括施用試刑(例如，通過在此描述的篩選分析鑒定的試劑)、或調(diào)節(jié) (例如，上調(diào)或下調(diào))mNa4.3a亞基表達(dá)或活性的試劑的組合，在另 一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法包括施用mNav1.3 a亞基蛋白或核酸分子作 為治療來補(bǔ)償降低的或異常的mNav1.3 a亞基表達(dá)或活性.
在mNav1.3 a亞基被異常地下調(diào)和/或在提高mNav1.3 a亞基活性 可能具有有益效果的情況下，剌激inNavlJa亞基活性是可取的?；钚?的拮抗也可能是可取的.例如，對(duì)于疼痛，例如神經(jīng)性疼痛、頭部外 傷和神經(jīng)變性疾病的治療，調(diào)節(jié)物是可取的.神經(jīng)變性疾病包括多發(fā) 性硬化、阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、或其他形式的癡呆、肌萎縮 性側(cè)索硬化、Down's綜合癥、Huntington舞蹈病和脊小腦變性'例如，
在治療伴隨著包括大腦出血的腦血管損傷或外傷的各種失調(diào)，所述大 腦出血例如高血壓腦內(nèi)出血和蛛網(wǎng)膜下出血，短暫的腦缺血反應(yīng)發(fā) 作，腦動(dòng)脈硬化和它們的后遣癥，以及心動(dòng)停止后恢復(fù)時(shí)的腦損傷、 腦手術(shù)之前或之后的腦功能障礙、由于氧不足、低血糖、腦或脊損傷、 藥物或氣體中毒、糖尿病、抗癌試劑的施用、酒精等等造成的神經(jīng)系 統(tǒng)的失調(diào)方面，調(diào)節(jié)NavL3通道可能是有用的.
秀炎逸合炎
如在此使用的，本發(fā)明的化合物，例如，通過在此描述的方法鑒 定的Na+通道調(diào)節(jié)物，被定義為包括其藥學(xué)上可接受的衍生物或前體藥 物。"藥學(xué)上可接受的衍生物或前體藥物"是指本發(fā)明的化合物的任何 藥學(xué)上可接受的鹽、酯、酯鹽或其他衍生物，在向受試者施用時(shí)能夠 提供(直接地或間接地)本發(fā)明的化合物.特別有利的衍生物和前體 藥物是，當(dāng)將這種化合物施用給哺乳動(dòng)物時(shí)提高本發(fā)明的化合物的生 物利用率的那些(例如，通過容許口服施用的化合物被更容易地吸收到血液中)，或相對(duì)于親本種類能增強(qiáng)親本化合物向生物代謝區(qū)(例 如，腦或淋巴系統(tǒng))的遞送的那些.前體藥物包括衍生物，其中增強(qiáng) 水溶性或穿腸膜主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的基團(tuán)被附加到在此描述的化學(xué)式的結(jié)構(gòu) 上.
本發(fā)明的化合物可以通過附加合適的功能進(jìn)行修改來增強(qiáng)選定的 生物學(xué)性質(zhì)。這種修改是本領(lǐng)域已知的，包括提高對(duì)給定生物代謝區(qū) (例如，血液、淋巴系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng))的生物學(xué)穿透性、提高口 服利用率、提高溶解性以容許通過注射施用、改變新陳代謝和改變排 出速率的那些修改.
本發(fā)明的化合物的藥學(xué)上可接受的鹽包括來源于藥學(xué)上可接受的 無機(jī)的和有機(jī)的酸和堿的那些.適合的酸性鹽的實(shí)例包括醋酸鹽、己 二酸鹽、藻酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、丁
酸鹽、檸檬酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、digluconate、十二烷基硫酸 鹽、乙烷碌酸鹽、甲酸鹽、延胡索酸鹽、glucoheptanoate、羥乙酸鹽、 半硫酸鹽、heptanoate、已酸鹽、氫氯酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基乙烷磺酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸 鹽、煙酸鹽、硝酸鹽、palmoate、 pectinate、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、 碑酸鹽、苦酸鹽、特戊酸鹽、丙酸鹽、水楊酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、 酒石酸鹽、硫氛酸鹽、甲苯磺酸鹽和imdecanoate.其他酸，例如草酸， 雖然本身不是藥學(xué)上可接受的，可以用于鹽的制備，所述鹽作為中間 物在獲得本發(fā)明的化合物和它們藥學(xué)上可接受的加酸鹽方面是有用 的.來源于合適的堿的鹽包括堿金屬鹽(例如，鈉)、堿土金屬(鹽 例如，鎂)、銨鹽和N-(烷基)4+鹽.本發(fā)明還預(yù)想了在此公開的化 合物的含堿性氮基團(tuán)的季銨反應(yīng).通過這種季銨反應(yīng)可以獲得水溶或 油溶或可分散的產(chǎn)物.此處任何化學(xué)式的化合物的鹽形式可以是羧基 的氨基酸鹽(例如，L-精氨酸鹽、L-賴氨酸鹽、L-組氨酸鹽).
在此描述的化學(xué)式的化合物可以，例如，通過靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、 真皮下、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)內(nèi)或皮下注射；或口頭地、口腔地、鼻地、穿 粘膜地、表面地、以眼用制品的形式，或通過吸入，劑量范圍約0.5到 約100 mg/kg體重，做為選擇的劑量在1 mg和1000 mg/劑之間，每4 到120小時(shí)，或根據(jù)特定藥物的要求來施用。此處的方法考慮施用有 效量的化合物或化合物組合物來實(shí)現(xiàn)期望的或聲明的效果. 一般地，本發(fā)明的藥物組合物每天約1次到約6次地施用，或作為選擇，作為 連續(xù)輸注來施用.這種施用可以用作慢性的或急性的治療。與栽體物 質(zhì)組合產(chǎn)生單個(gè)劑量形式的活性成分的數(shù)量可以取決于治療的宿主和 施用的特定模式而變化。典型的制品將含有約5%到約95%的活性化 合物(w/w).做為選擇，這種制備含有約20%到約80%的活性化合 物.
比以上敘述的更低或更高的劑量可能是所需的.對(duì)于任何特定患 者的特定劑量和治療服法取決于各種因素，包括采用的特定化合物的 活性、年齡、體重、 一般健康狀況、性別、飲食、施用時(shí)間、排出速 率、藥物組合、疾病、狀況或癥狀的嚴(yán)重程度和病程、疾病、狀況或 癥狀的患者分布、和治療醫(yī)師的判斷.
在改善患者狀況時(shí)，如果必要，可以施用維持劑量的本發(fā)明的化 合物、組合物、或組合.隨后，當(dāng)癥狀被減輕到期望的水平時(shí)，施用 的劑量或頻率、或這兩者，可以作為癥狀的函數(shù)被降低到維持改善的 狀況的水平.然而，根據(jù)疾病癥狀的任何復(fù)發(fā)，患者可能需要長(zhǎng)期的 間歇性治療.
在此描繪的組合物包括有效實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)疾病或疾病癥狀的數(shù)量的此 處描繪的化學(xué)式的化合物，以及如果存在的話其他的治療試劑，所述 疾病或疾病癥狀包括離子通道介導(dǎo)的失調(diào)或其癥狀，
術(shù)語"藥學(xué)上可接受的栽體或佐劑"是指可以與本發(fā)明的化合物 一同施用給患者的栽體或佐劑，當(dāng)以足夠遞送治療數(shù)量的所述化合物 的劑量施用時(shí)，不破壞其藥理學(xué)活性并且是無毒的，
可用于本發(fā)明的藥物組合物的藥學(xué)上可接受的栽體、佐劑和賦形 劑包括但不限于，離子交換刑、礬土、硬脂酸鋁、卵磷脂、自乳化藥 物遞送系統(tǒng)(SEDDS)例如d-a-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸鹽、用于 藥物劑型的表面活性劑例如Tweens或其他類似的聚合遞送基質(zhì)、血清 蛋白例如人血清白蛋白、緩沖劑例如磷酸鹽、甘氨酸、山梨酸、山梨 酸鐘、飽和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、鹽或電解質(zhì)，例如硫 酸魚精蛋白、褲酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、硅膠、三硅酸 鎂、聚乙烯基吡咯烷稱、基于纖維素的物質(zhì)、聚乙二醇、羧甲基纖維 素鈉、聚丙烯酸酯、蠟、聚乙烯-聚氧化丙烯-塊多聚體、聚乙二醇和羊 毛脂。環(huán)糊精例如a-、 P-和Y-環(huán)糊精，或化學(xué)上修飾的衍生物例如羥基烷基環(huán)糊精，包括2-和3-羥基丙基-P-環(huán)糊精，或其他增溶的衍生 物，也可以有利地用于增強(qiáng)在此描述的化學(xué)式的化合物的遞送.
本發(fā)明的藥物組合物可以口頭地、胃腸外地、通過吸入噴霧、表 面地、直腸地、鼻地、口腔地、陰道地、或通過植入的儲(chǔ)庫來施用， 優(yōu)選的通過口服施用或通過注射施用.本發(fā)明的藥物組合物要是可以 含有任何常規(guī)的無毒的藥學(xué)上可接受的栽體、佐劑或賦形劑.在某些 情況下，可以用藥學(xué)上可接受的酸、堿或緩沖液調(diào)節(jié)制劑的pH值，來 增加配制的化合物或它的遞送形式的穩(wěn)定性.如在此使用的術(shù)語胃腸 外的包括皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、滑膜內(nèi)、 胸骨內(nèi)、鞘內(nèi)、病灶內(nèi)和顱內(nèi)的注射或輸注技術(shù).
所述藥物組合物可以是無菌可注射制品的形式，例如，為無菌可 注射的水性或油性懸浮液.這些懸浮液可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的技術(shù)使 用適合的分散刑或潤(rùn)濕劑(例如，Tween糾)和懸浮刑來配制，無菌 可注射制劑也可以是處于無毒的胃腸外可接受的稀釋劑或溶劑，例 如，1,3-丁二醇溶液中的無菌可注射溶液或懸浮液。在可接受的賦形劑 和溶劑之中，可以使用的有甘露醇、水、Ringer，s溶液和等滲氯化鈉溶 液.此外，無菌的不揮發(fā)性油通常用作溶劑或懸浮介質(zhì).為此，可以 使用任何溫和的不揮發(fā)性油，包括合成的單甘油醋或二甘油酯。脂肪 酸，例如油酸和它的甘油酯衍生物在注射劑的制備中是有用的，天然 的藥學(xué)上可接受的油，例如橄欖油或蓖麻油，特別是它們的聚氧乙撐
化型式也是一樣.這些油溶液或懸浮液也可以含有長(zhǎng)鏈的醇稀釋劑或 分散劑，或羧甲基纖維素或類似的分散劑，它們通常用于藥學(xué)上可接 受的劑型例如乳劑和或懸浮液的配制，通常用于藥學(xué)上可接受的固 體、液體或其他劑型的制造的其他常用的表面活性劑，例如Tweens或 Spans其他類似的乳化劑或生物利用率增強(qiáng)劑，也可以用于制劑目的.
本發(fā)明的藥物組合物可以以任何口服可接受的劑型，包括但不限 于，膠囊劑、片劑、乳劑和水懸浮液、分散體和溶液來口頭地施用， 對(duì)于口服用途的片劑來說，常用的栽體包括乳糖和玉米淀粉。 一般也 添加潤(rùn)滑劑，例如硬脂酸鎂.對(duì)于以膠嚢劑形式口服施用，有用的稀 釋劑包括乳糖和干燥的玉米淀粉.當(dāng)口頭地施用水性懸浮液和/或乳劑 時(shí)，活性成分可以懸浮于或溶于油相，與乳化劑和/或懸浮劑組合，如 果需要，可以添加某些甜味劑和/或調(diào)味劑和/或著色劑.本發(fā)明的藥物組合物也可以以用于直腸施用的栓劑形式來施用. 可以通過將本發(fā)明的化合物與適合的無刺激性賦形劑混合來制備，所 迷賦形劑在室溫下是固體但在直腸溫度下是液體，因而將在直腸中融 化釋放活性組分.這種材料包括，但不限于，可可脂、蜂蠟和聚乙二 醇.
當(dāng)希望的治療涉及通過表面施用容易達(dá)到的區(qū)域或器官時(shí)，本發(fā) 明的藥物組合物的表面施用是有用的.對(duì)于向皮膚的表面應(yīng)用，藥物 組合物應(yīng)配制為含有懸浮于或溶于栽體的活性組分的適合的軟骨劑. 用于表面施用本發(fā)明的化合物的栽體包括但不限于，礦物油、液體石 油、白石油、丙二醇、聚氣乙烯聚氧丙烯化合物、乳化蠟和水.做為 選擇，藥物組合物可配制為適合的洗液或乳奮劑，其含有懸浮于或溶 于栽體的活性化合物，所述栽體有適合的乳化劑.適合的栽體包括但
不限于，礦物油、單硬脂酸山梨糖醇酐酯、聚山梨酸酯60、十六烷基 酯蠟、cetearyl alcohol、 2-辛基十二醇、苯甲醇和水，本發(fā)明的藥物組
低位腸i.表面地穿表皮貼片也包括在本發(fā)明中. -
本發(fā)明的藥物組合物可以通過真氣霧劑或吸入來施用。根據(jù)藥物 制劑領(lǐng)域公知的技術(shù)來制備這種組合物，可以制備為鹽水的溶液，采 用苯甲醇或其他適合的防腐劑，采用吸收促進(jìn)劑來增強(qiáng)生物利用率， 和/或本領(lǐng)域已知的其他增溶劑或分散刑。
具有此處的化學(xué)式的化合物和其他試劑的組合物(例如，治療試 劑)可以使用可植入裝置來施用.可植入裝置和相關(guān)的技術(shù)是本領(lǐng)域 已知的，當(dāng)希望連續(xù)的或定時(shí)釋放來遞送在此描繪的化合物或組合物 時(shí)作為遞送系統(tǒng)是有用的.另外，可植入裝置遞送系統(tǒng)對(duì)于靶向化合 物或組合物遞送的特定位點(diǎn)(例如，局部位置、器官)是有用的。Negrin et al" Biomaterials， 22 (6) :563 (2001 )。包括可選擇性的遞送方法的 定時(shí)釋放技術(shù)也可用于本發(fā)明.例如，基于多聚體技術(shù)、持續(xù)釋放技 術(shù)和密封技術(shù)的定時(shí)釋放制劑(例如，聚合物、脂質(zhì)體)也可用于遞 送在此描繪的化合物和組合物。
還處在本發(fā)明的范閨內(nèi)的是遞送此處的活性化學(xué)治療組合物的貼 片.貼片包括材料層(例如，聚合物、布、紗布、繃帶)和如在此描 繪的此處的化學(xué)式的化合物.材料層的一面可以具有附著于其上的保護(hù)層來抵抗化合物或組合物的通過，貼片可以另外包括粘附劑來將貼 片保持在受試者上.粘附劑是一種組合物，包括天然或合成來源的那 些，當(dāng)與受試者的皮膚接觸時(shí)，暫時(shí)地附著到皮膚上.其可以是抗水 的。粘附劑可以置于貼片上，以保持貼片與受試者的皮膚接觸持續(xù)一 延長(zhǎng)的時(shí)間。所述粘附劑被制成具有一定膠粘性或粘附強(qiáng)度，從而它 將裝置保持在進(jìn)行了偶然接觸的部位，然而，在一定的積極行為時(shí)(例 如，撕、剝、或其他有意的去除)，所述粘附劑給施于該裝置或粘附劑 本身的外部壓力讓路，并允許粘附接觸的解除.粘附劑可以是壓力敏 感的，也就是說，這可以容許通過對(duì)粘附劑或裝置施加壓力(例如， 按、擦)將粘附劑(和要附著于皮膚的裝置)置于皮膚上.
當(dāng)本發(fā)明的組合物包含在此描述的化學(xué)式的化合物和一種或多種 其他治療或預(yù)防試劑的組合時(shí)，所述化合物和所述其他試劑都應(yīng)以約1
到100%的劑量水平存在，更優(yōu)選的為單治療(monotherapy)服法中 通常施用的劑量的約5到95%之間.所述其他試劑可以獨(dú)立于本發(fā)明 的化合物作為多次劑量服法的部分來施用.做為選擇，這些試劑可以 是單個(gè)劑型的部分，在單個(gè)組合物中與本發(fā)明的化合物混合在一起。 以上描述的化合物和方法可以用于治療性調(diào)節(jié)Na+通道功能。 通過以下非限制性實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明的特定實(shí)施方式
實(shí)施例1:新的Na+通道a亞基的鑒定
1. 首先，4吏用用于RT-PCR的Superscript First-Strand Synthesis System (InVitrogen )從小鼠腦polyA RNA ( Stratagene and Clontech) 產(chǎn)生cDNA.設(shè)計(jì)引物用于擴(kuò)增小鼠Navl,:3a亞基.相應(yīng)于小鼠Na4.3 a亞基的部分序列的cDNA (GenBank Acc. No.NM_018732 )與公開 的大鼠cDNA序列的中部(NM—013119;從起始密碼子開始的核苷酸 2461 )進(jìn)行比對(duì).為了鑒定小鼠Nav1.3 a亞基的全長(zhǎng)序列，使用BLAST
(Blake JA， et al. MGD: The Mouse Genome Database.池c/e/c J"Vfc 及es31: 193-195, 2003)將大鼠序列(NM_013199)與小鼠基因組進(jìn)行 比較.
2. 設(shè)計(jì)5，引物與推定的起始密碼子上游的7個(gè)核苷酸退火，設(shè)計(jì)3，引 物與推定的終止密碼子下游的124個(gè)核苷酸退火.每個(gè)引物在末端含有NotI限制性位點(diǎn)。設(shè)計(jì)引物與非翻譯區(qū)退火.與非翻譯區(qū)退火的引 物較少可能擴(kuò)增非Navl,3a亞基基因，即，小鼠Navl.l和Nav1.2 a亞 基基因.用于擴(kuò)增mNav1.3的3，引物被設(shè)計(jì)為與相應(yīng)于大鼠Navl.l、 Nav1.2和Nav1.3 a亞基3，非翻譯區(qū)之間的高變區(qū)域的非翻譯區(qū)退火， 來提高對(duì)mNav1.3的特異性.在大鼠Navl a亞基基因中的這個(gè)區(qū)域中， 大鼠Na4.1在32個(gè)核苷酸中有17個(gè)與大鼠Na4.2不同，大鼠Navl.2 在32個(gè)核苷酸中有13個(gè)與大鼠Na丄3不同.這個(gè)翻譯區(qū)在大鼠和小 鼠序列之間還具有高度的同源性；32個(gè)核苷酸中的僅29個(gè)是保守的.
3. 使用Herculase Hotstart DNA聚合酶(Stratagene; 30循環(huán))從小 鼠腦cDNA擴(kuò)增出編碼小鼠Nav1.3 a亞基的小鼠Navl.3 a亞基cDNA 的克隆.通過瓊脂糖凝膠電泳分辨PCR產(chǎn)物，使用Qiaquick Gel Extraction試劑盒(Qiagen )從凝膠中提取RCP產(chǎn)物.使用TOPO XL PCR克隆試劑盒(Invitrogen )將提取的產(chǎn)物亞克隆到pCR-XbTOPO 栽體中，將產(chǎn)生的栽體轉(zhuǎn)化到XL10 Gold Ultracompetent細(xì)胞
(Stratagene)中'培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌.使用Aurum Miniprep ( Biorad) 從轉(zhuǎn)化的細(xì)菌分離DNA.
通過對(duì)未切的DNA和Notl (New England Biolabs)消化的DNA 進(jìn)行瓊脂糖凝膠分析來鑒定含有小鼠Nav1.3 a亞基插入物的克隆.進(jìn) 行兩個(gè)克隆的5，和3，末端的序列分析(A和B; SeqWright)來證實(shí)小 鼠Navl,3 a亞基插入物的存在.
通過maxi prep ( Qiagen)培養(yǎng)含有克隆A和B的細(xì)菌用于制備 更大量的DNA.
4. 進(jìn)行克隆A和B的全長(zhǎng)測(cè)序(SeqWright).確定克隆A和B中是 否存在PCR錯(cuò)誤，將兩個(gè)克隆的核普酸序列相互比較、與小鼠Na4.3 a亞基基因組序列比較、與大鼠Nav1.3 a亞基cDNA的序列
(NM_013199 )比較，和與兩個(gè)人類Nav1.3 a亞基cDNAs( NM—006922 和AF225986)比較.此外，產(chǎn)生由克隆A和B的核苷酸序列編碼的預(yù) 測(cè)的氨基酸序列，并與大鼠和人類Nav1.3 a亞基蛋白序列進(jìn)行比較。
克隆A含有相對(duì)于鼠基因組序列和人類Nav1.3 a亞基序列的一個(gè) 核苷酸改變.克隆A還含有相對(duì)于克隆B的83個(gè)核苷酸刪除.克隆A和克隆B都含有在一列六個(gè)A中的額外的A,這很可能是 由PCR錯(cuò)誤導(dǎo)入的.在編碼序列中這個(gè)核苷酸的存在將移動(dòng)閱讀框， 并編碼1504個(gè)氨基酸的蛋白(與已知的Nav a亞基多肽中大約1940氨 基酸個(gè)相對(duì)比).并且，額外的A不存在于基因組鼠序列中.大鼠和 人類序列在該位置也缺少額外的核苷酸.
克隆B含有不存在于克隆A或鼠、大鼠和人類基因組序列中相應(yīng) 基因組區(qū)域中的兩個(gè)核苷酸改變，因而被確定為是錯(cuò)誤.克隆B還具 有不存在于克隆A或鼠、大鼠和人類基因組序列中相應(yīng)位置中的額外 核苷酸，其也被確定為是錯(cuò)誤.
5. 使用以下步驟對(duì)小鼠Navl,3a亞基克隆中發(fā)現(xiàn)的突變進(jìn)行修復(fù)，對(duì) 于修復(fù)的步驟l,通過用來自克隆B的相應(yīng)片段替換突變的片段，來糾 正克隆A中的突變和83個(gè)核苷酸剁除，如下.用Xcml (New England Biolabs)消化克隆A和B。對(duì)克隆A的大片段(其沒有突變和刪除) 和克隆B的小片段(替換克隆A的片段)進(jìn)行分辨，使用QiaquickGel Extraction試劑盒從瓊脂糖凝膠中提取。使用T4 DNA連接酶(New England Biolabs)連接消化的片段.將連接的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入MAX Efficiency Stbl2感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen )'培養(yǎng)細(xì)菌，用Aurum miniprep分離DNA,通過對(duì)未切的DNA和用Smal和Narl (New England Biolabs)消化的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠分析，鑒定含有合適的 Xcml片段的克隆。
對(duì)幾個(gè)克隆進(jìn)行序列分析(SeqWright),來鑒定其中突變和83 個(gè)核苷酸刪除被修復(fù)的DNA,并證實(shí)兩個(gè)額外核普酸的存在(一個(gè)額 外核苷酸存在于克隆A中， 一個(gè)隨克隆B的XcmI片段帶來).
6. 對(duì)于修復(fù)分離的小鼠Na4.3 a亞基cDNA的步驟2，使用了在其中 突變和83個(gè)核苷酸刪除已經(jīng)修復(fù)了的克隆.用QiiickChange XL定點(diǎn) 誘變?cè)噭┖?Stratagene)糾正了這個(gè)克隆中的一個(gè)額外的核苷酸。設(shè) 計(jì)定點(diǎn)誘變引物.進(jìn)行誘變反應(yīng)，將反應(yīng)的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入XL10 Gold Ultracompetent細(xì)胞(Stratagene),培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌，通過Aurum miniprep分離DNA.用DNA的Smal消化來分析克隆.對(duì)幾個(gè)克隆進(jìn) 行序列分析來鑒定其中額外的核苷酸被修復(fù)的DNA.重新生長(zhǎng)來自正確克隆的細(xì)菌，從而含有額外核苷酸的插入物可以轉(zhuǎn)移到pcDNA6B并 被修復(fù).
7. 為了將含有一個(gè)額外核苷酸的小鼠Nav1.3 a亞基cDNA從pCR-XL-TOPO轉(zhuǎn)移到pcDNA6B，用EcoRV和Spel( New England Biolabs) 消化該克隆.用EcoRV和Xbal( New England Biolabs )消化pcDNA6B. 對(duì)消化片段進(jìn)行分辨，使用Quiaquick Gel Extraction試劑盒從瓊脂糖 凝膠中提取，使用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接.將連接的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入XL10 Gold Ultracompetent細(xì)胞.培養(yǎng)細(xì)菌,用Aurum miniprep分離DNA。 通過對(duì)未切的DNA和Smal消化的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠分析來鑒定含 有小鼠Navl.3 a亞基插入物的克隆.重新生長(zhǎng)一個(gè)克隆用于最后的修 復(fù)步驟.
8. 對(duì)于修復(fù)過程的步驟3,在pcDNA6B中在小鼠Nav1.3 a亞基中含有 額外核苷酸的片段用如下新擴(kuò)增的片段進(jìn)行替換.設(shè)計(jì)引物來擴(kuò)增小 鼠Nav1.3 a亞基的內(nèi)部片段(從起始密碼子開始的核苷酸3950-4675). 使用PfuTurbo Hotstart DNA聚合醃(Stratagene)從小鼠腦cDNA (在 步驟1產(chǎn)生)擴(kuò)增這個(gè)片段，通過瓊脂糖凝膠電泳分辨，用Quiaquick Gel Extraction試劑盒從瓊脂糖凝膠提取.將該片段亞克隆入pCR-XL-TOPO載體，并轉(zhuǎn)化入One Shot TOP10感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen )。 培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌，通過Aurum minipr印分離DNA.通過對(duì)用EcoRI 消化的和用ScaI和BglI (New England Biolabs)雙消化的DNA進(jìn)行 瓊脂糖凝膠分析來鑒定含有小鼠Nthev1.3 a亞基片段的克隆。對(duì)幾個(gè)克 隆進(jìn)行序列分析來鑒定沒有突變的DNA克隆。重新生長(zhǎng)一個(gè)克隆.
用來自pCR-XL-TOPO的正確片段置換pcDNA6B中小鼠Nav1.3 a亞基中含有額外核苷酸的片段如下進(jìn)行.用Hpal和BstEII (New England Biolabs)消化兩個(gè)克隆.對(duì)消化的片段進(jìn)行分辨，使用 Quiaquick Gel Extraction試劑盒從瓊脂糖凝膠中提取.使用T4 DNA 連接醉連接片段，將連接的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入MAX Efficiency Stbl2感受態(tài)細(xì) 胞，培養(yǎng)細(xì)菌，用Aurum miniprep分離DNA,通過用Hpal、 BstEII 和Smal限制消化來分析克隆.對(duì)幾個(gè)克隆的"交換"片段進(jìn)行測(cè)序 (SeqWright)來鑒定其中額外的核苷酸被修復(fù)的克隆.進(jìn)行單個(gè)克隆的全長(zhǎng)測(cè)序來證實(shí)在定點(diǎn)誘變方法期間(修復(fù)的步驟2)沒有產(chǎn)生新的 突變.
實(shí)施例2:編碼序列的確定
表l.描繪了小鼠Nay1.3 a亞基的編碼序列.cDNA的編碼序列相 應(yīng)于表l中所示序列的核苷酸8到核苷酸5947. SEQIDNO:l相應(yīng)于 表l所示序列的編碼序列部分.SEQ ID NO:l的預(yù)測(cè)的氨基酸序列在 SEQ ID NO:2和表2中示出.SEQ ID NO:3相應(yīng)于表1所示的完整序 列.核苷酸8-10的粗體、下劃線的ATG序列，和核苷酸5945-5947的 粗體、下劃線的TGA序列分別代表編碼序列的起始和終止密碼子.
Table l.小鼠Nav1.3 a亞基的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)
51 101 151 201 251 301 351 401 451 501 551 601 651 701 751 801 851 9Q1 951 1001 1051 1101 1151 1201 1251 1301 1351 1401 1451 1501 1551 1601 1651 1701 1751
TGAAAAGATO GCCCAGGCAC TGCTGGTACC GCCTTTT^SH TCGAGMTCT CTTGCTGCTA GAGAAAGCCA AGAAACCCAA GAAAGAACAA GCCAAAGCCA AACAGTGACT TGGAAGCTGG ATGGAGACAT TCCTCCAGAG ATGGTGTCGG CCCTACTACG TCAGTAAGAA AACTTTTGTA AATTTTTCGA TTCAGTGCCA CCTCCGCCTT ACCCCGTTAG GAAAATTGCT ATTAAGATTT ATGCTTATCA TGTGCACTAT TTTGACCAAC CAATCCTCCT GACTGGACGA AGAATGTAGA ATACCTTTGA GTCACTTATA AAGATCTTGG GATTTCACAT TTCTTCGTGA CCCATGGAAC CGTGATGGCA TATGTGACAG AGTTTGTGGA TGAGAACGTT CAGAGTTCTC CGAGCATTGA GGTTTAAAGA CCATCGTGGG GGCCCTGATC TGACGTCATG ATACTCACTG TGTTCTGTCT GGCTGCAGCT CTTCATGGGC AACCTGAGGA CCAAGCGATT CTGCTTTTGA GATCAACACT AATGGACTCA AATGGGACAT TTGTTAATGT GGAAGGACTA TATCGCAGAT GACAGCCACT AAAGATCCTT TACTTTGTGG AAATGGGTCC AGGGTACATC TGTGTGAAGG CTGGACGAAA GCTTTGACAC ATTTAGCTGG GCCTTCTTAT CAAGACTACT GGGAGAACCT TTACCAGTTG AACCTACATG ATCTTTTTCG TCCTGGTAAT TGGTGAACTT GATCCTGGCT GTGGTGGCCA CAGGCCACAC TGGAGGAGGC TGAGCAGAM GTTGGAGCAG TTGAAAAAGC AGCAAGAGGA CCTCAGCAGC GTCCAGAGAC TTCAGTGGGA CTGGAGAGTT CTTCAGAAGC TTCCAAGTTG GTGGAGGAAT CGGAGGAA6A AGAGGAGACA ACCACAGACC CGAAGGAGAC AGGTTTCCCA GTCAAGCGAA GGAGTTTCCT GTTCTCCCTG CGACAAGAAG CTGTGCTCTC CCCATCAGTC CCCTGTTTTC CCCAAGACGC AATAGCAAAA GGTCGGGCGA AGGACGTGGG GTCTGAGAAT
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4551 GCATCATGAT CCTCATCTGC CTCAACATGG TGACCATGAT GGTGG織CG
4601 GACGACCAGA GCAAATACAT GACCCTGGTT TTGTCCCGAA TCAACCTGGT
4651 ATTCATCGTC CTCTTCACTG GGGAGTTTCT GCTGAAGCTC ATCTCTCTCA
4701 GATACTACTA CTTCACGATT GGCTGGAACA TCTTTGACTT TGTGGTGGTG
4751 ATTCTCTCAA TTGTAGGAAT GTTCCTTGCT GAGCTGATAG AGAAGTATTT
4801 TGTGTCTCCT ACCCTGTTCC GAGTCATCCG CCTGGCCAGG ATTGGACGAA
4851 TCCTACGCCT GATCAAAGGC GCCftAGGGGA TCCGCACGCT GCTCTTTGCT
4901 CTGATGATGT CCCTTCCTGC GCTGTTCAAC ATCGGCCTCC TGCTTTTCCT
4951 CGTCATGTTC ATCTACGCCA TCTTTGGGAT GTCCAACTTT GCCTATGTTA
5001 AAAAAGAGGC TGGAATTGAT GACATGTTCA ACTTTGAGAC TTTTGGCAAC
5051 AGCATGATCT GCCTGTTCCA AATCACCACC TCTGCGGGCT GGGATGGACT
5101 GTTGGCCCCC ATCGTCAACA GTGCACCTCC TGACTGTGAC CCTGATGCAA
5151 TTCACCCTGG AAGCTCAGTG MGGGAGACT GTGGGAACCC ATCTGTGGGG
5201 ATTTTCTTTT TTGTCAGCTA CATCATCATA TCCTTCCTGG T窗GGTGAA
5251 CATGTACATT GCTGTCATCC TGGAGAACTT CAGCGTTGCC ACAGAAGAAA
5301 GTGCAGAGCC CCT6AGT(3AG GACGACTTTG AGATGTTCTA CGAGGTCTGG
5351 GAGAAGTTCG ACCCTGACGC CACCCA(3TTC ATAGAGTTCT GCAAGCTCTC
5401 TGACTTTGCA GCTGCCCTGG ATCCTCCCCT CCTCATCGCA AAGCCAAACA
5451 AAGTCCAGCT CATT6CCATG GACCTGCCCA TGGTGAGTGG AGACCGCATC
5501 CACTGCCTGG ACATCTTATT TGCTTTTACA AAGCGGGTCC TGGGTGAGAG
5551 TGGAGAGATG GATGCCCTTC GAATCCAGAT GGAAGATCGG TTCATGGCTT
5601 CCAATCCCTC CAAGGTCTCT TATGAGCCCA TTACCACCAC TCTGAAGCGC
5651 AAACAAGAGG AGGTGTCTGC TGCTATCATT CAGCG*AATT ACAGATGTTA
5701 TCTTTTAAAG CAAAGGTTAA AARACATATC AAATACGTAT GACAAAGAGA
5751 CAATCAAGGG GAGGATTGTC TTGCCTATAA AAGGAGATAT GGTTATTGAC
5801 AAATTAAATG GGAATTCCAC CCCAGAAAAG ACAGATGGGA GTTCCTCTAC
5851 CACCTCCCCT CCTTCCTATG ACAGTGTAAC AAAACCAGAT AAGGAAAAGT
5901 TT6AGAAAGA CAAACCAGAA AAAGAAAGCA AAGGGAAAGA GGTCTGAGAG
5951 AATCAAAAGT AAAAAAACAA AACAAAAAAA ATTTCAAAAA TTTaSSSaGG
6001 AAACAAAGAA ATGTCTTTGT AATCAATTGT TTACAGCCTC TGAAGGTAAA
6051 GTGTCCGTGT CAACTGGACT C
表2.mNavl.3a亞基的氨基酸序列(SEQIDNO:2)
MAQALLVPPGPESFRLFTRESLAAIEKRAAEEKAKKP咖QDIDDE抓PK PNSDLEAGKNIiPFIYGDIPPEMV3EPIjEDIiDPYYVSKKTFVVIiNKGKAIF RFSATSALYILTPL賠RKIAIKILVHSIiFSMLIMCTILTNCVFMTIiSNP PDWTKNVEYTFTGIYTFESIiIKILARGFCLEDFTFIiRDPWNWLDFSVIVM
ayvtefvdlgnvsalrtfrvlralktisvipglktivgaliosvkklsdv miiitvfclsvfaliglqlfmgnlrnkclqwppsdsafeinttsyfngtmd s恥tfvnvtmstfnwkdyiaddshfyvldgqkdplk:gngsdagqcpegy icvkagrnpnygytsfdtfswaflslfrlmtqdywenlyqltiiraagkty mi ffvlvi fiigsfyiivnlilawamayeeonqatiieeaeqkeaefqqmle qlkkqqeeaqavaaasaasrdfsgigglgeuciessseasklssksakewr nrrkkrrqre肌egnhrpegdrfpksesedsvkrrsflfsldgnplsgdk
KLCSPHQSIiIiSIRGSX^SPRRNSKTSIFSFRGRAKDVGSENDFADDEHST FEDSESRRDSLFVPHRPGERRNSNVSQASMSSRMVPGLPANGKMHSTVDC NGWSLGTTTETEVRKRRLSSYQISMEMLEDSSGRQRAMSIASII/raTME ELEESRQKCPPCWYRFANVFLIWDCCDSWLKVKHLVNIiIVMDPFVDLAIT ICIVLNTLFMAMEHYPMTEQFSSVLTVGNLVFTGIFTAEMVLKI副DPY YYFQEGWMIFDGIIVSIiSIiMEIi(3IANVEGili3VXRSFRIjLRVFKIAK3WPT LNMLIKIIGNSVGALGNLTLVLAIIV打FAWGMQLPGKSYKECVCK畫 DCKL卿H柳DFFHSFLIVFRVLCGEWIET柳DCMEVAGQTMCIiIVFMLVMVIG肌WL肌FLALLLSS咖咖LAATDDD鄉(xiāng)鄉(xiāng)NLQIAVGRMQKGIDY
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GMVPDFVTOQVPDISIMILICLNMVTlilMVETDDQSKYMTLVLSRINLVFI
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PTLFRVIRLARIGRILRLIKGAKGIRTLLFALMMSLPALPNIGLLLFLVM
ETYAIFGMSNFAYVKKEAGIDDMFNFETFGNSMICLFQITTSAGWDGLLA
PILNSAPPDCDPDAIHPGSSVKGDCGNPSVGIPFFVSYIIISFLWVNMy
IAVILENFSVATEESAEPLSEDDFEMFYEVWEKFDPDATQFIEFCKLSDF
AAALDPPLLIAKPMKVQLIAMDLPMVSGDRIHCLDILFAFTKRVLGESGE
MDALRIQMEDRFMASNPSKVSYEPITTTLKRKQEEVSAAIIQ咖YRCYLL
KQRLKNISNTYDKETIKGRIVLPIKGDMVIDKLNGNSTPEKTDGSSSTTS
PPSYDSVT咖KEKFEKD咖KESKGKEV
實(shí)施例3:新的Na+通道a亞基的表達(dá)
在非洲爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中使用二電極電壓鉗技術(shù)分析實(shí)施 例1中分離的小鼠Nav1.3 a亞基的功能特征.通過標(biāo)準(zhǔn)克隆方法擴(kuò)增 Nav1.3 a亞基cDNA并亞克隆入pcDNA6栽體(Invitrogen)。將小鼠 Navl,3a亞基(2ng/nl) cDNA的約46納升注射到去濾泡的非洲爪檐 卵母細(xì)胞中，5天后測(cè)量電流，在1.8mMCaCl2、 5mMHEPES-Na、 2 mMKC1、1 mM MgCl和96 mMNaAc，pH 7.5的溶液中4吏用0.5-1.0 MQ 電阻(3M KC1)的電極記錄六個(gè)細(xì)胞的鈉電流.將卵母細(xì)胞保持在-100 mV,去極化到電壓-80 mV到50 mV.使用P/4泄漏減去(leak subtraction )方案得到數(shù)據(jù).附困3顯示了在不同的去極化電壓下代表 性的鈉電流.六個(gè)細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)化、平均化的峰值電流-電壓相互關(guān)系在 附圖4中顯示.在-40 mV通道開始打開，在0mV達(dá)到最大電流，這 些數(shù)據(jù)顯示，Na4,3acDNA編碼的通道是功能性的，它展現(xiàn)了這種通 道的預(yù)期的生物物理學(xué)性質(zhì).
在此引用的所有參考文獻(xiàn)，不論是印刷的、電子的、計(jì)算機(jī)可讀 存儲(chǔ)介質(zhì)還是其他形式，特意地通過引用完全合并，包括但不限于， 摘要、論文、學(xué)報(bào)、出版物、文本、文集、因特網(wǎng)網(wǎng)站、數(shù)據(jù)庫、軟 件包、專利和專利出版物.已經(jīng)描述了本發(fā)明的許多實(shí)施方式.盡管 如此，要理解的是，可以進(jìn)行各種修改而不背離本發(fā)明的精神和范閨. 因此，其他實(shí)施方式在以下的權(quán)利要求的范圍之內(nèi).
權(quán)利要求
1. 一種分離的鈉通道III型α亞基(mNav1.3α亞基)多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。
2. 權(quán)利要求l的多肽，其中該多肽基本上由SEQIDNO:2的氨基 酸序列組成.
3. 包含SEQ ID NO:2的至少10個(gè)連續(xù)氨基酸的分離的mNav1.3 a亞基多肽，其中所述多肽包括以下氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)異亮氨酸 289、脯氨酸S18、絲氨酸728、絲氨酸1355、天冬酜胺l卯9、蘇氨酸 1910和纈氨酸1921.
4. 編碼權(quán)利要求1-3的任何一個(gè)的多肽的分離的mNav1.3 a亞基核 酸分子.
5. 權(quán)利要求4的核酸分子，其中所述核酸包含SEQIDNO:l的核 苷酸序列。
6. 權(quán)利要求5的核酸分子，其中所述核酸分子基本上由SEQ ID NO:l的核苷酸序列組成.
7. 權(quán)利要求4的核酸分子，其中所述核酸是SEQIDNO:l的核酸序列的等位基因.
8. 權(quán)利要求4的mNav1.3 a亞基核酸分子的片段，其中所述片段 編碼以下的氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)異亮氨酸289、脯氨酸518、絲氨 酸728、絲氨酸1355、天冬酰胺1909、蘇氨酸1910和纈氨酸1921。
9. 一種表達(dá)栽體，包含與啟動(dòng)子可操作連接的權(quán)利要求4的 mNav1.3 a亞基核酸分子，
10. 包含權(quán)利要求4的核酸的宿主細(xì)胞。
11. 優(yōu)先地結(jié)合權(quán)利要求1的mNav1.3 ct亞基多肽的試劑.
12. —種試劑，其與權(quán)利要求l的mNavl.:3a亞基多肽選擇性地結(jié) 合，并且不與鈉通道I型或II型a亞基多肽結(jié)合.
13. 權(quán)利要求12的試劑，其中所述試劑是小分子、核酸或蛋白。
14. 權(quán)利要求12的試劑，其中所述試劑調(diào)節(jié)mN^1.3 a亞基多肽 活性.
15. 權(quán)利要求13的試劑，其中所述試劑是抗體或其抗原結(jié)合片段.
16. 權(quán)利要求15的試劑，其中所述抗體是多克隆抗體或單克隆抗體。
17. 包含權(quán)利要求12的試劑和藥學(xué)上可接受的栽體的藥物組合物.
18. 調(diào)節(jié)細(xì)胞中mNav:L3a亞基多肽活性的方法，所述方法包括 提供包含mNav1.3 a亞基多肽的鈉通道，其中所述mNav1.3 a亞基多肽是根據(jù)權(quán)利要求1 _ 3的任何一項(xiàng)的多肽；使所述通道與有效調(diào)節(jié)mNav1.3 a亞基多肽的活性的量的mNav1.3 a亞基多肽調(diào)節(jié)物接觸.
19. 權(quán)利要求18的方法，其中所述調(diào)節(jié)物是小分子、核酸或蛋白.
20. 鑒定調(diào)節(jié)mNavl.3a亞基多肽活性的試劑的方法，所述方法包括提供包含mNav1.3 a亞基多肽的第 一鈉通道，其中所述mNav1.3 a 亞基多肽是根據(jù)權(quán)利要求1 - 3的任何一項(xiàng)的多肽； 使所述通道與測(cè)試化合物接觸；以及評(píng)估所述鈉通道的活性，其中相對(duì)于參考值的活性變化是該化合物是調(diào)節(jié)所述通道的試劑的指示。
21. 權(quán)利要求20的方法，其中所述測(cè)試化合物是小分子、肽或核酸。
22. 權(quán)利要求20的方法，其中所述鈉通道被包含在生物樣品內(nèi).
23. 權(quán)利要求20的方法，其中所述通道與多種測(cè)試化合物接觸.
24. 權(quán)利要求20的方法，其中所述樣品包含細(xì)胞膜.
25. 權(quán)利要求24的方法，其中所述樣品包含細(xì)胞。
26. 權(quán)利要求25的方法，其中所述細(xì)胞是真核細(xì)胞，
27. 權(quán)利要求26的方法，其中所述細(xì)胞是非洲爪蟾卵母細(xì)胞。
28. 權(quán)利要求26的方法，其中所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞.
29. 權(quán)利要求20的方法，其中所述活性包含鈉濃度的調(diào)節(jié).
30. 權(quán)利要求20的方法，其中所述評(píng)估包括檢測(cè)鈉排出'
31. 權(quán)利要求20的方法，其中所述接觸在不存在測(cè)試化合物，產(chǎn)生第一鈉排出量的條件下發(fā)生.
32. 權(quán)利要求20的方法，其中所述評(píng)估包括使用Na+流量分析。
33. 權(quán)利要求20的方法，其中所述分析使用膜片鉗電生理學(xué).
34. 權(quán)利要求20的方法，其中所述分析使用二電極電壓鉗電生理學(xué).
35. 權(quán)利要求20的方法，其中所述分析包括使用鈉敏感性染料.
36. 權(quán)利要求20的方法，其中所述分析是高通量分析.
37. 權(quán)利要求20的方法，進(jìn)一步包括步驟提供包含mNavl,3a亞基多肽的第二鈉通道，其中所述mNavl.3a 亞基多肽不同于根據(jù)權(quán)利要求1 - 3的mNav1.3 a亞基多肽； 用測(cè)試化合物接觸所述第二鈉通道； 評(píng)估所述第二鈉通道的活性.
38. 權(quán)利要求37的方法，進(jìn)一步包括比較存在測(cè)試化合物的情況 下第一鈉通道的活性和存在測(cè)試化合物的情況下笫二鈉通道的活性.
39. 權(quán)利要求37的方法，其中提供多個(gè)鈉通道.
40. 權(quán)利要求20的方法，其中所述mNav1.3 a亞基多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列.
41. 鑒定在治療與鈉電流調(diào)節(jié)有關(guān)的失調(diào)中有用的試劑的方法，所 述方法包括提供包含根據(jù)權(quán)利要求1 一 3的任何一個(gè)的mNavl.3 a亞基多肽的 鈉通道；用測(cè)試化合物接觸所述通道；和評(píng)估所述通道的活性，其中相對(duì)于參考值的活性變化是測(cè)試化合 物是在與鈉電流有關(guān)的失調(diào)中有用的試劑的指示.
42. 權(quán)利要求41的方法，其中所述失調(diào)是疼痛、感覺異常、中風(fēng)、頭部外傷、神經(jīng)變性失調(diào)或與神經(jīng)元的超興奮性有關(guān)的失調(diào).
43. 權(quán)利要求41的方法，進(jìn)一步包括體內(nèi)施用所述化合物。
44. 權(quán)利要求41的方法，進(jìn)一步包括為了體內(nèi)使用而修飾所述化 合物.
45. 權(quán)利要求41的方法，進(jìn)一步包括評(píng)估由所述化合物對(duì)相關(guān)的 人類NavL3a亞基多肽的調(diào)節(jié).
46. 治療患有與鈉通道電流有關(guān)的失調(diào)的受試者的方法，所述方法 包括鑒定與mNav1.3 a亞基多肽選擇性結(jié)合的試劑，和 向需要這種治療的受試者施用藥理學(xué)試劑，所述藥理學(xué)試劑對(duì)于 包含mNav1.3 a亞基多肽的鈉通道有選擇性.
47.權(quán)利要求46的方法，其中所述失調(diào)是疼痛、感覺異常、中風(fēng)、 頭部外傷、神經(jīng)變性失調(diào)或與神經(jīng)元的超興奮性有關(guān)的失調(diào).
全文摘要
在此公開了新的鈉通道核酸和多肽。還公開了使用這種新的核酸和多肽的方法。
文檔編號(hào)C12NGK101421300SQ200480041649
公開日2009年4月29日 申請(qǐng)日期2004年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月12日
發(fā)明者A·霍恩斯滕, R·弗蘭科 申請(qǐng)人:塞恩藥品公司