專利名稱：檢測鈉/鉀離子比的方法和試劑盒以及系統(tǒng)的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，具體而言涉及一種鈉/鉀離子比檢測方法和試劑盒以及系統(tǒng)。
背景技術：
人體內(nèi)的鈉、鉀是維持細胞生理活動的主要陽離子，是保持機體的正常滲透壓及酸堿平衡，參與糖及蛋白質代謝，保證神經(jīng)肌肉的正常功能所必需，其含量是人體生理活動的重要指標。尿液、血清中鈉、鉀離子的含量水平在臨床上可用于診斷一些腎臟、心臟等方面的疾病。人體內(nèi)的鈉鉀離子水平處于一個平衡狀態(tài)，其比率的改變對人體健康有著重要影響。對健康而言，監(jiān)測鈉/鉀的比例可能比二者單獨的絕對數(shù)值更重要。在臨床上，通過檢測唾液鈉/鉀比，可診斷醛固酮增多癥。此外，美國學者近日研究證實24小時尿鈉/鉀比對心血管疾病風險的預測價值顯著優(yōu)于單純的尿鈉或尿鉀檢測。由此可見，鈉/鉀比的監(jiān)測對預防心血管疾病具重要意義。現(xiàn)有技術中測定鈉、鉀離子濃度的方法主要有中子活化法、同位素稀釋質譜法、化學測定法、火焰光度法、離子選擇電極法、酶動力學法、原子分光光度法等。目前，臨床上經(jīng)常使用的方法是火焰光度法和離子選擇電極法。(I)火焰光度法火焰光度法是一種發(fā)射光譜分析法，利用火焰中激發(fā)態(tài)原子回降至基態(tài)時發(fā)射的光譜強度進行含量分析，可檢測血清、尿液、腦脊液及胸腹水的Na+和K+，該方法屬于經(jīng)典的標準參考法，優(yōu)點是結果準確可靠，廣為臨床采用。通常采用的定量方法有外標準法和內(nèi)標準法。外標準法一般操作誤差較大，不常采用。內(nèi)標法是標本及標準液采用加進相同濃度的內(nèi)部標準元素進行測定，一般是加入鋰內(nèi)標，測定的是鋰/鈉或鉀電流的比值，而不是單獨鈉或鉀的電流，這樣，可減小燃氣和火焰溫度波動等因素引起的誤差，因而有較好的準確性。(2)離子選擇電極法(ISE法):在專用儀器上進行血清和尿液的鉀、鈉離子測定。因其具有標本用量少，快速準確，操作簡便等優(yōu)點，是目前所有方法中最為簡便準確的方法，幾乎有取代其他方法的趨勢。其原理是離子選擇電極是一種電化學傳感器，其結構中有一個對特定離子具有選擇性響應的敏感膜電極，將離子活度轉換成電位信號，在一定范圍內(nèi)，其電位與溶液中特定離子活度的對數(shù)呈線性關系，通過與已知離子濃度的溶液比較可求得未知溶液的離子活度，按其測定過程又分為直接測定法和間接測定法，目前大部分采用間接測定法，由于間接測定法將待測樣本稀釋后測定，所測離子活度更接近離子濃度。目前主要的電極種類有玻璃膜電極，感應材料為玻璃膜；固相電極，由難溶金屬物質加壓成型；液態(tài)膜電極，將環(huán)氧樹脂或內(nèi)裝聚氯乙烯作為感應膜；纈氨霉素膜制成的K+電極。這些電極都具有一定壽命，使用一段時問后，電極會老化，且價格昂貴。(3)化學測定法目前Na+、K+的化學測定主要利用復環(huán)王冠化合物如穴冠醚或球冠醚，亦稱為冠醚，均為離子載體進行測定，由于大環(huán)結構內(nèi)有空穴，分子內(nèi)部氧原子有未共用電子對可與金屬離子結合，根據(jù)空穴大小，可選擇性結合不同直徑的金屬離子，從而可達到測出離子濃度的目的。(4)酶法酶法測定鉀的原理是利用鈉依賴的β -半乳糖苷酶催化人工底物ONPG(鄰硝基酚β -D-吡喃半乳糖苷);分解釋放出有色產(chǎn)物鄰硝基酚，在波長420nm處測吸光度變化。酶法測鉀的原理是利用對丙酮酸激酶的激活作用，后者催化磷酸烯醇式丙酮酸變?yōu)槿樗嵬瑫r伴有還原型輔酶I的消耗，在波長340nm處測NADH的吸光度下降。酶法的優(yōu)點是不需特殊儀器，缺點是價格較貴。(5)原子分光光度法也可用于檢測血清中鉀、鈉離子，但操作復雜，誤差較大，不及火焰光度法簡便?，F(xiàn)有的這些方法都是分別測定鈉、鉀離子濃度，再在測出的數(shù)值基礎上計算鈉/鉀離子比。到目前為止，尚沒有直接測定鈉/鉀離子比的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的提供一種利用菁染料超分子與鳥嘌呤四鏈體(G-四鏈體)作用體系檢測鈉/鉀離子比的新方法，以 及應用該方法配制而成的鈉/鉀比檢測試劑盒。利用該試劑盒中的試劑，可利用熒光光譜儀器定量分析液體中鈉/鉀離子比，測定過程不受其他元素的影響，精確度高。同時，由于該試劑靈敏度很高，對不同鈉/鉀離子比表現(xiàn)出顏色上的變化，肉眼可見，可實現(xiàn)可視化檢測。本發(fā)明的總體技術路線為通過加入鈉/鉀離子來調控G-四鏈體結構的形成或構象轉變，隨之菁染料識別G-四鏈體結構的變化，從而反映出鈉/鉀比值水平。具體為在低鈉/鉀比的環(huán)境下，DNA序列形成反平行結構G-四鏈體，隨鈉/鉀比降低反平行G-四鏈體則發(fā)生構象轉變，隨著G-四鏈體構象轉變，菁染料的聚集形態(tài)發(fā)生變化，從而在顏色上發(fā)生改變，達到肉眼觀測，同時在熒光光譜上也發(fā)生明顯的變化，熒光強度的變化程度與鈉/鉀比值成正比，從而實現(xiàn)定量反映鈉/鉀比水平。本發(fā)明的第一方面提供一種檢測液體樣品中鈉/鉀比的方法，所述方法包括以下步驟(I)用PH6. 2 8. 2的緩沖溶液和可溶性鈉鹽和鉀鹽配制鈉/鉀離子比不同的多個溶液樣本，其中每個所述溶液樣本中含有相同濃度的在鈉、鉀離子存在下能夠分別形成不同G-四鏈體結構的DNA分子以及相同濃度的菁染料；(2)將所述多個溶液樣本置于熒光光譜儀下，采用540nm至570nm的激發(fā)波長，檢測在采集波長處的熒光強度；(3)以各個所述溶液樣本的鈉/鉀比作為橫坐標或縱坐標，以步驟(2)中測得的在采集波長處的熒光強度值為縱坐標或橫坐標作圖，從而獲得鈉/鉀比的標準曲線；(4)在待測液體樣品中加入所述DNA分子和菁染料，并調節(jié)pH值，以使待測液體樣品中所述DNA分子的濃度、菁染料的濃度以及pH值與步驟(I)中的溶液樣本一致，從而得到測試溶液；(5)將步驟(4)中獲得的測試溶液置于熒光光譜儀下，采用與步驟(2)中相同的激發(fā)波長，檢測波長在所述采集波長處的熒光強度；(6)利用步驟(5)中測得的熒光強度值在步驟(3)中獲得的鈉/鉀比標準曲線中找到對應的測試溶液的鈉/鉀比值；其中所述采集波長在570nm至700nm范圍內(nèi)。本發(fā)明的方法可以方便地用于檢測各種溶液樣品中的鈉/鉀比值，例如，可以檢測人或動物血液、尿液、唾液、細胞或其他體液中的鈉/鉀比。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中所述緩沖液選自三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液、硼酸-硼砂緩沖液、三乙醇胺緩沖液、咪唑-鹽酸緩沖液、雙甘氨肽緩沖液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖液。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中所述在鈉、鉀離子存在下能夠分別形成不同G-四鏈體結構的DNA分子為分子序列中含有下式I的結構的DNA分子GGYGGZGGMGG式I其中式I中的G代表鳥嘌呤，Y、Z、M分別代表一個或多個任意堿基，G代表鳥嘌呤堿基。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中所述菁染料為下式II的化合物
權利要求
1.一種檢測液體樣品中鈉/鉀離子比的方法，所述方法包括以下步驟 (1)用PH6.2 8. 2的緩沖溶液和可溶性鈉鹽和鉀鹽配制鈉/鉀離子比不同的多個溶液樣本，其中每個所述溶液樣本中含有相同濃度的菁染料及在鈉、鉀離子存在下能夠分別形成不同G-四鏈體結構的DNA分子； (2)將所述多個溶液樣本置于熒光光譜儀下，采用540nm至570nm的激發(fā)波長，檢測采集波長處的熒光強度值； (3)以各個所述溶液樣本的鈉/鉀比作為橫坐標或縱坐標，以步驟(2)中測得的采集波長處的熒光強度值為縱坐標或橫坐標作圖，從而獲得鈉鉀離子比的標準曲線； (4)在待測液體樣品中加入所述的DNA分子，并調節(jié)pH值，以使待測液體樣品中的菁染料和DNA分子的濃度以及pH值與步驟(I)中的溶液樣本一致，從而得到測試溶液； (5)將步驟(4)中獲得的測試溶液置于熒光光譜儀下，采用與步驟(2)中相同的激發(fā)波長，檢測波長在所述采集波長處的熒光強度值； (6)利用步驟(5)中測得的中測得的熒光強度值在步驟(3)中獲得的鈉/鉀離子比標準曲線中找到對應的測試溶液的鈉/鉀比值； 其中所述采集波長在570nm至700nm的范圍內(nèi)。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述在鈉、鉀離子存在下能夠分別形成不同G-四鏈體的DNA分子為分子序列中含有下式I的結構的DNA分子GGYGGZGGMGG 式I 其中Y、Z和M獨立地代表一個或多個任意堿基，G代表鳥嘌呤堿基。
3.如權利要求1或2所述的方法，其中所述G-四鏈體DNA的序列選自以下序列TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG、AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG、TTGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGA、TGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAA、AGGGAGGGCGCTGGGAGGAGGG、GGGCGCGGGAGGAATTGGGCGGG、GGTTGGTGTGGTTGG、 TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG、 GGGCGCGGGAGGAAGGGGGCGGG 或GGGCGCGGGAGGAATTGGGCGGG。
4.如權利要求1或2所述的方法，其中所述菁染料為式II的化合物，
5.如權利要求4所述的方法，其中所述C1-C6的烷基選自甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、戊基、異戊基、正己基或異己基。
6.如權利要求4所述的方法，其中R1選自甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、戊基、異戊基、正己基、異己基、苯基、甲基苯基或二甲基苯基；R2、R3> R4和R5獨立地選自甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、戍基、異戍基、正己基或異己基。
7.如權利要求4所述的方法，其中所述5元至7元環(huán)結構為含有或不含有N或S原子的飽和或不飽和環(huán)結構。
8.如權利要求4所述的方法，其中Y選自氟、氯、溴、碘陰離子或三乙胺陽離子。
9.如權利要求1或2所述的方法，其中所述緩沖液選自三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液、硼酸-硼砂緩沖液、三乙醇胺緩沖液、咪唑-鹽酸緩沖液、雙甘氨肽緩沖液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖液、磷酸鈉-磷酸氫鈉緩沖液、巴比妥鈉-鹽酸緩沖液、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液、硼砂-氫氧化鈉緩沖液或磷酸鈉緩沖液。
10.如權利要求1所述的方法，其中所述溶液樣本中鈉/鉀離子比的范圍優(yōu)選在O至10的范圍；所述在鈉、鉀離子存在下能夠分別形成不同G-四鏈體結構的DNA分子在溶液樣本中的濃度在O. 5至30 μ mo I/L的范圍；所述菁染料在溶液樣本中的濃度在I至30 μ mo I/L的范圍。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測鈉/鉀離子比的方法和試劑盒以及系統(tǒng)。本發(fā)明涉及檢測溶液中鈉/鉀離子摩爾比的方法，包括(1)配制鈉/鉀離子比不同的多個溶液樣本，其中每個所述溶液樣本中含有相同濃度的菁染料及在鈉、鉀離子存在下能夠分別形成不同G-四鏈體結構的DNA分子；(2)檢測采集波長處的熒光強度值；(3)以各個所述溶液樣本的鈉/鉀比作為橫坐標或縱坐標，以步驟(2)中測得的采集波長處的熒光強度值為縱坐標或橫坐標作圖，從而獲得鈉鉀離子比的標準曲線；(4)在待測液體樣品中加入所述的DNA分子，并調節(jié)pH值，從而得到測試溶液；(5)檢測波長在所述采集波長處的熒光強度值；(6)在鈉/鉀離子比標準曲線中找到對應的測試溶液的鈉/鉀比值。
文檔編號C09B23/06GK103063629SQ20121055312
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月18日 優(yōu)先權日2012年12月18日
發(fā)明者孫紅霞, 唐亞林, 向俊鋒, 楊千帆, 管愛嬌, 劉巖 申請人:中國科學院化學研究所