本發(fā)明涉及麻櫟無(wú)性繁殖技術(shù)，尤其是一種麻櫟初代培養(yǎng)芽誘導(dǎo)方法。

背景技術(shù)：

麻櫟（Quercus acutissima Carruth）又名青岡、橡椀樹(shù)，系殼斗科（Fagaceae）櫟屬（Quercus）喬木，高達(dá)30米，胸徑達(dá)1米，樹(shù)皮深灰褐色，深縱裂。生于海拔60-2200米的山地陽(yáng)坡，成小片純林或混交林，陽(yáng)性喜光，喜濕潤(rùn)氣候。耐寒，耐干旱瘠薄，不耐水濕，不耐鹽堿，在濕潤(rùn)肥沃深厚、排水良好的中性至微酸性沙壤土上生長(zhǎng)最好，排水不良或積水地不宜種植。與其它樹(shù)種混交能形成良好的干形，深根性，萌芽力強(qiáng)，但不耐移植。抗污染、抗塵土、抗風(fēng)能力都較強(qiáng)。壽命長(zhǎng)，可達(dá)500～600年。產(chǎn)遼寧、河北、山西、山東、江蘇、安徽、浙江、江西、福建、河南、湖北、湖南、廣東、海南、廣西、四川、貴州、云南等省區(qū)。

目前，麻櫟常見(jiàn)的種植方式為播種造林和植苗造林。組織培養(yǎng)技術(shù)是一種快速無(wú)性繁殖技術(shù)，選擇麻櫟優(yōu)良家系或者無(wú)性系為材料，通過(guò)組織培養(yǎng)方法繁殖苗木，既可以滿足生產(chǎn)上的數(shù)量要求，又可保持母本性狀。組織培養(yǎng)過(guò)程中，初代培養(yǎng)是制約組織培養(yǎng)順利進(jìn)行的關(guān)鍵步驟，其中涉及了外植體的獲取、外植體的消毒、培養(yǎng)基選擇以及培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)體褐變、苗木玻璃化等重要問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種能克服芽誘導(dǎo)過(guò)程中外植體褐變以及玻璃化等問(wèn)題，提高芽誘導(dǎo)率，出芽指數(shù)以及萌芽生長(zhǎng)狀況，獲取數(shù)量多、質(zhì)量好的萌芽，從而滿足增殖培養(yǎng)的需要，促進(jìn)麻櫟組織培養(yǎng)快速繁殖體系的建立的麻櫟初代培養(yǎng)芽誘導(dǎo)方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種麻櫟初代培養(yǎng)芽誘導(dǎo)方法，采用麻櫟基部萌條為外植體，通過(guò)外植體無(wú)菌處理后，將外植體接種于優(yōu)質(zhì)初代培養(yǎng)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，置于適宜的溫度、濕度和光照強(qiáng)度條件下進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)芽的萌發(fā)；其操作步驟為，

（1）外植體選擇：選擇麻櫟基部萌發(fā)的半木質(zhì)化的萌條為外植體；

（2）外植體消毒及接種：將麻櫟萌條經(jīng)過(guò)洗潔精清洗，流水沖洗和化學(xué)試劑處理消毒后，剪切成莖段接入芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中；

（3）芽誘導(dǎo)培養(yǎng)：將接種后的外植體置于適宜室內(nèi)條件下培養(yǎng)。

以上所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基其原料含量為：1/3～1/2改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 1.0～2.0mg/L+維生素C10mg/L+瓊脂5.0g/L+蔗糖20.0g/L。

以上所述的改良WPM培養(yǎng)基組分和體積重量比為：NH₄NO₃ 780 mg/L，CaCl₂·2H₂O 192 mg/L，MgSO₄·7H₂0 300 mg/L，KH₂PO₄ 270 mg/L，Ca(NO₃)₂·4H₂O 180 mg/L，KI 0.83 mg/L，H₃BO₃ 6.2 mg/L，MnSO₄·H₂O 22.4 mg/L，ZnSO₄·7H₂O 8.6 mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25 mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.25 mg/L，Na₂·EDTA 37.3 mg/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 27.8 mg/L，肌醇85 mg/L，煙酸1.0 mg/L，鹽酸吡哆醇1.0 mg/L，鹽酸硫胺素2.0 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。

以上所述的萌條是長(zhǎng)為6~9cm、直徑0.2～0.4 cm的半木質(zhì)化的萌條。

以上步驟（2）所述的消毒及接種方法是將麻櫟萌條針葉剪去，置于三角瓶中，加入體積濃度為1~5 %的洗潔精溶液，采用紗布封住瓶口，置于轉(zhuǎn)速為200 r/min的搖床上清洗10~15 min后置于流水下沖洗1~2 h，然后用無(wú)菌水清洗2次，將外植體轉(zhuǎn)到超凈工作臺(tái)上用體積濃度0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10 min；再采用無(wú)菌水沖洗8~10次后剪成長(zhǎng)為3.5~4.0 cm長(zhǎng)的莖段接種于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶接種2個(gè)莖段。

以上步驟（3）所述的適宜室內(nèi)條件為：暗培養(yǎng)10d后轉(zhuǎn)為光照500～1000 lx，光照8～12h/d；培養(yǎng)溫度20±1℃，濕度為50~55 %。

本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)及有益效果如下：

1、本發(fā)明采用1/3～1/2改良WPM培養(yǎng)基培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，同時(shí)重點(diǎn)調(diào)整了與麻櫟出芽相關(guān)的微量元素和有機(jī)成分，使得培養(yǎng)基更科學(xué)，更有針對(duì)性，有效的克服了麻櫟組織培養(yǎng)芽誘導(dǎo)過(guò)程中易出現(xiàn)的玻璃化現(xiàn)象，更易促使麻櫟芽誘導(dǎo)的發(fā)生，促進(jìn)了萌芽的生長(zhǎng)速度和健壯度。

2、本發(fā)明以基部長(zhǎng)6~9 cm長(zhǎng)的半木質(zhì)化粗壯萌條作為外植體，保證了外植體較強(qiáng)的分生能力，促進(jìn)芽的誘導(dǎo)；本發(fā)明在外植體采集后進(jìn)行洗凈、消毒，有效降低外植體的污染率，提高了出芽率。

3、本發(fā)明將接種后的外植體置于溫度為度20±1℃，濕度為50~55%，光照由暗培養(yǎng)后轉(zhuǎn)到強(qiáng)度為500～1000 lx的室內(nèi)條件下培養(yǎng)，溫度和濕度偏低，光照強(qiáng)度也不高的室內(nèi)條件，有利于減少芽誘導(dǎo)過(guò)程中玻璃化的發(fā)生。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。

實(shí)施例1：

選擇麻櫟基部萌發(fā)、長(zhǎng)為6~7cm、直徑0.2～0.3 cm的半木質(zhì)化的萌條作為外植體。將麻櫟萌條針葉剪去，置于三角瓶中，加入體積濃度為1 %的洗潔精溶液，采用紗布封住瓶口，置于轉(zhuǎn)速為200 r/min的搖床上清洗10 min后置于流水下沖洗2 h，然后用無(wú)菌水清洗2次，將外植體轉(zhuǎn)到超凈工作臺(tái)上用體積濃度0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10 min；再采用無(wú)菌水沖洗8~10次后剪成長(zhǎng)為3.5 cm長(zhǎng)的莖段接種于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶接種2個(gè)莖段。

所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基其原料含量為：1/3改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 1.0mg/L+維生素C10mg/L+瓊脂5.0g/L+蔗糖20.0g/L。其中改良WPM培養(yǎng)基組分和體積重量比為：NH₄NO₃ 780 mg/L，CaCl₂·2H₂O 192 mg/L，MgSO₄·7H₂0 300 mg/L，KH₂PO₄ 270 mg/L，Ca(NO₃)₂·4H₂O 180 mg/L，KI 0.83 mg/L，H₃BO₃ 6.2 mg/L，MnSO₄·H₂O 22.4 mg/L，ZnSO₄·7H₂O 8.6 mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25 mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.25 mg/L，Na₂·EDTA 37.3 mg/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 27.8 mg/L，肌醇100 mg/L，煙酸1.0 mg/L，鹽酸吡哆醇1.0 mg/L，鹽酸硫胺素2.0 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。

將接種后的外植體置于溫度20±1℃，濕度為50 %室內(nèi)暗培養(yǎng)10d后轉(zhuǎn)為光照500 lx，光照12h/d的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)芽的萌發(fā)。

實(shí)施例2：

選擇麻櫟基部萌發(fā)、長(zhǎng)為7~8cm、直徑0.2～0.3 cm的半木質(zhì)化的萌條作為外植體。將麻櫟萌條針葉剪去，置于三角瓶中，加入體積濃度為2%的洗潔精溶液，采用紗布封住瓶口，置于轉(zhuǎn)速為200 r/min的搖床上清洗10 min后置于流水下沖洗1.5 h，然后用無(wú)菌水清洗2次，將外植體轉(zhuǎn)到超凈工作臺(tái)上用體積濃度0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10 min；再采用無(wú)菌水沖洗8~10次后剪成長(zhǎng)為3.5 cm長(zhǎng)的莖段接種于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶接種2個(gè)莖段。

所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基其原料含量為：1/3改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 1.5mg/L+維生素C10mg/L+瓊脂5.0g/L+蔗糖20.0g/L。其中改良WPM培養(yǎng)基組分和體積重量比為：NH₄NO₃ 780 mg/L，CaCl₂·2H₂O 192 mg/L，MgSO₄·7H₂0 300 mg/L，KH₂PO₄ 270 mg/L，Ca(NO₃)₂·4H₂O 180 mg/L，KI 0.83 mg/L，H₃BO₃ 6.2 mg/L，MnSO₄·H₂O 22.4 mg/L，ZnSO₄·7H₂O 8.6 mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25 mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.25 mg/L，Na₂·EDTA 37.3 mg/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 27.8 mg/L，肌醇100 mg/L，煙酸1.0 mg/L，鹽酸吡哆醇1.0 mg/L，鹽酸硫胺素2.0 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。

將接種后的外植體置于溫度20±1℃，濕度為50 %室內(nèi)暗培養(yǎng)10d后轉(zhuǎn)為光照500lx，光照10h/d的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)芽的萌發(fā)。

實(shí)施例3：

選擇麻櫟基部萌發(fā)、長(zhǎng)為7~8cm、直徑0.3～0.4 cm的半木質(zhì)化的萌條作為外植體。將麻櫟萌條針葉剪去，置于三角瓶中，加入體積濃度為4%的洗潔精溶液，采用紗布封住瓶口，置于轉(zhuǎn)速為200 r/min的搖床上清洗15 min后置于流水下沖洗1 h，然后用無(wú)菌水清洗2次，將外植體轉(zhuǎn)到超凈工作臺(tái)上用體積濃度0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10 min；再采用無(wú)菌水沖洗8~10次后剪成長(zhǎng)為4.0 cm長(zhǎng)的莖段接種于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶接種2個(gè)莖段。

所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基其原料含量為：1/2改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 1.5mg/L+維生素C10mg/L+瓊脂5.0g/L+蔗糖20.0g/L。其中改良WPM培養(yǎng)基組分和體積重量比為：NH₄NO₃ 780 mg/L，CaCl₂·2H₂O 192 mg/L，MgSO₄·7H₂0 300 mg/L，KH₂PO₄ 270 mg/L，Ca(NO₃)₂·4H₂O 180 mg/L，KI 0.83 mg/L，H₃BO₃ 6.2 mg/L，MnSO₄·H₂O 22.4 mg/L，ZnSO₄·7H₂O 8.6 mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25 mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.25 mg/L，Na₂·EDTA 37.3 mg/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 27.8 mg/L，肌醇100 mg/L，煙酸1.0 mg/L，鹽酸吡哆醇1.0 mg/L，鹽酸硫胺素2.0 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。

將接種后的外植體置于溫度20±1℃，濕度為55 %室內(nèi)暗培養(yǎng)10d后轉(zhuǎn)為光照1000 lx，光照10h/d的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)芽的萌發(fā)。

實(shí)施例4：

選擇麻櫟基部萌發(fā)、長(zhǎng)為8~9cm、直徑0.3～0.4 cm的半木質(zhì)化的萌條作為外植體。將麻櫟萌條針葉剪去，置于三角瓶中，加入體積濃度為5 %的洗潔精溶液，采用紗布封住瓶口，置于轉(zhuǎn)速為200 r/min的搖床上清洗15 min后置于流水下沖洗1h，然后用無(wú)菌水清洗2次，將外植體轉(zhuǎn)到超凈工作臺(tái)上用體積濃度0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10 min；再采用無(wú)菌水沖洗8~10次后剪成長(zhǎng)為4.0 cm長(zhǎng)的莖段接種于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶接種2個(gè)莖段。

所述的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基其原料含量為：1/2改良WPM培養(yǎng)基+6-BA 2.0mg/L+維生素C10mg/L+瓊脂5.0g/L+蔗糖20.0g/L。其中改良WPM培養(yǎng)基組分和體積重量比為：NH₄NO₃ 780 mg/L，CaCl₂·2H₂O 192 mg/L，MgSO₄·7H₂0 300 mg/L，KH₂PO₄ 270 mg/L，Ca(NO₃)₂·4H₂O 180 mg/L，KI 0.83 mg/L，H₃BO₃ 6.2 mg/L，MnSO₄·H₂O 22.4 mg/L，ZnSO₄·7H₂O 8.6 mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25 mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.25 mg/L，Na₂·EDTA 37.3 mg/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 27.8 mg/L，肌醇100 mg/L，煙酸1.0 mg/L，鹽酸吡哆醇1.0 mg/L，鹽酸硫胺素2.0 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。

將接種后的外植體置于溫度20±1℃，濕度為55 %室內(nèi)暗培養(yǎng)10d后轉(zhuǎn)為光照1000 lx，光照8h/d的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)芽的萌發(fā)。