專利名稱：：花葉花桿綠竹芽體組織培養(yǎng)基及組培快繁方法花葉花桿綠竹芽體組織培養(yǎng)基及組培快繁方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種中徑叢生竹的芽體組織培養(yǎng)基及組培快繁方法。
背景技術(shù)：
：花葉花桿綠竹(勘邊6wsa0/^a邊i'/w/A是禾本科竹亞科綠竹屬，叢生竹種，桿與葉片現(xiàn)白綠條紋，具有獨(dú)特的觀賞價值。它是我國南方優(yōu)良的筍材兩用竹種之一，是制作家具、樂器和工藝品的優(yōu)良材料。夢產(chǎn)于春末秋初(5~10月)，筍期長達(dá)5個月，夢質(zhì)脆嫩，鮮甜可口，營養(yǎng)豐富，含有17種人體必需的氨基酸和磷、鐵、鈣等礦物元素及維生素。竹材纖維長，易分解，是優(yōu)良的造紙?jiān)??；ㄈ~花桿綠竹根系發(fā)達(dá)，在美化環(huán)境，防浪護(hù)岸，防止水土流失方面起著重要作用。一直以來靠移栽母竹或竹鞭來繁殖，速度慢、用地多、運(yùn)輸不便、成本高和受季節(jié)制約。近年，探索竹類組織培養(yǎng)和快繁4支術(shù)的有志者日益增多。綜合竹類組織培養(yǎng)研究現(xiàn)狀，本申請人有志于利用植林的頂芽和側(cè)芽為外植體誘導(dǎo)出花葉花桿綠竹再生植林，大量而迅速的獲得性狀不變異竹苗，無疑具有一定的研究價值和現(xiàn)實(shí)意義，現(xiàn)已初見成效。經(jīng)檢索和市場調(diào)查，至今未見用花葉花桿綠竹的芽體為外植體組織誘導(dǎo)出再生植抹的資料報(bào)道和相關(guān)實(shí)物問世。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是用花葉花桿綠竹的芽體為外植體，配制一種有效的組織培養(yǎng)基，用于花葉花桿綠竹的芽體組織培養(yǎng)并誘導(dǎo)其試管苗生根，提供一套完整的組培快繁方法。具體說本發(fā)明的任務(wù)有四一是提供一種誘導(dǎo)叢生芽的培養(yǎng)基，二是提供一種叢生芽增殖培養(yǎng)基，三^1提供前期和后期生^^養(yǎng)基，四是提供整套花葉花桿綠竹芽體組織培養(yǎng)快速繁殖方法。上述任務(wù)通過如下措施實(shí)現(xiàn)本花葉花桿綠竹芽體組織培養(yǎng)基，含有MS基本培養(yǎng)基、MS鹽類，還含有0.3-3mg/L或1-5mg/L的BA即千M腺噤呤或50卯m的IBA即巧l咮丁酸和100mg/L的肌醇、White's維生素，附加各占培養(yǎng)基總重量0.2-0.4%的水晶洋菜和1.5-4.5%的蔗糖，配制成三個階段分別應(yīng)用的誘導(dǎo)叢生芽培養(yǎng)基、叢生芽增殖培養(yǎng)基、前期和后期生才峰養(yǎng)基，各培養(yǎng)基的pH值5.2-6.0。由MS鹽類、White's維生素、100mg/L的肌醇、0.3-3.Omg/L的BA、占培養(yǎng)基總重量0.2-0.4%的水晶洋菜和1.5-4.5%的蔗糖，配制成誘導(dǎo)叢生芽培養(yǎng)基，pH值5.2-6.0。由MS鹽類、White's維生素、100mg/L的肌醇、1-5.Omg/L的BA、占培養(yǎng)基總重量0.2-0.4%的水晶洋菜和1.5-4.5%的蔗糖，配制成叢生芽增殖培養(yǎng)基，pH值5.2-6.0。由100mg/L的肌醇、White's維生素、50ppm的IBA、占培養(yǎng)基總重量2.5%的水晶洋菜和3%的蔗糖，配制成前期生才艮培養(yǎng)基，由MS基g養(yǎng)基作后期生根培養(yǎng)基。用本花葉花桿綠竹芽體組織培養(yǎng)基進(jìn)行組培快繁方法經(jīng)過下列步驟(1)外植體的采集與消毒采集春天萌發(fā)枝條，帶回實(shí)驗(yàn)室，剝?nèi)U籜，自來水沖洗2h，在稀釋至0.5%NaCI0溶液中，真空條件下浸泡10min,用無菌水沖洗五次后，顯微鏡下切取長約0.2-l鵬頂芽和側(cè)芽芽體組織；(2)叢生芽的誘導(dǎo)將切得的芽體組織接種到如權(quán)利要求2所述的誘導(dǎo)叢生芽的培養(yǎng)基中，光照強(qiáng)度2500Lux、溫度25土2匸、光照16h/d^下，7-10d后芽始萌，15-20d后基部生出新的叢生芽；(3)叢生芽增殖與快繁將上述叢生芽切下，接種于如權(quán)利要求3所述的叢生芽增殖培養(yǎng)基中，光照強(qiáng)度2500Lux，光照16h/d，25±2TC糾下，10-15d后伸長，兩個月后增殖系數(shù)達(dá)3-5倍；(4)誘導(dǎo)生根與移栽將伸長后的叢生芽3-4個為一叢，接種到如權(quán)利要求4所述的前期生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)1-3天，再接種到后期生根培養(yǎng)基即MS基本培養(yǎng)基中，光照強(qiáng)度3700Lux，光照16h/d，25土2iC^Ht下，15-20d后開始生根，培養(yǎng)50-60d后，生根率達(dá)40%，取生長良好的再生植林置于馴化室，強(qiáng)光20000Lux下馴化2周移栽，先用清水洗去根部的培養(yǎng)基，種植于蛭石珍珠巖泥炭=1:1:1的混合基質(zhì)中，單個花盆套透明塑料袋，該袋每二天剪一小口，一周后棄袋移入溫室栽種即成。本發(fā)明的有益效果是突破了中徑叢生竹，尤其是用花葉花桿綠竹的芽體組織為外植體，誘導(dǎo)出再生植林的難題，一改傳統(tǒng)的母竹移栽、竹鞭移栽的方法，節(jié)省了母竹、用地面積、培植時間和運(yùn)輸成本，且不受季節(jié)的制約，為景點(diǎn)用竹、夢用竹、大面積綠化用竹提供了快速而充足地繁殖竹苗的有效途徑。具體實(shí)施方式本發(fā)明下面結(jié)合實(shí)施例作進(jìn)一步詳述我國的竹類組織培養(yǎng)出再生植抹，尚處于起步階段。有所成就的是以芽繁芽，未經(jīng)過脫分化的方式實(shí)現(xiàn)，而且選用的是幼年植林、胚等組織，未見有用成年植林頂芽和側(cè)芽的芽體為外植體，組培成再生植林的報(bào)導(dǎo)，眾多竹類組培實(shí)踐者公認(rèn)竹類組培苗生根困難。因此，本發(fā)明的主攻方向是創(chuàng)造優(yōu)良的人工環(huán)境，從改善叢生竹的組織細(xì)胞增殖、生根條件著手，來攻克叢生竹組培難點(diǎn)。為此，對培養(yǎng)基原料的選用、選配，濃度、pH值、光照、溫度做了一系列對比試驗(yàn)，如叢生芽增殖培養(yǎng)時，采用不同的芽M進(jìn)行對比試驗(yàn)，篩選出增殖系數(shù)高達(dá)3-5倍的培養(yǎng)基,從而為最佳芽叢數(shù)增殖提供了培育的1^1^#。針對叢生竹種組培苗生根困難的問題，先用50卯mlBA溶液中培養(yǎng)不同天數(shù)，篩選出最佳處理天數(shù)，再用不同的IBA濃度處理，從而篩選最佳濃度，接種到MS基本培養(yǎng)基，60天的生根率可達(dá)40%?？傊?，花葉花桿綠竹芽體組培出再生植林，是對外植體的處理?xiàng)l件、培養(yǎng)基、基質(zhì)等進(jìn)行嚴(yán)格篩選的結(jié)果?；ㄈ~花桿綠竹芽體培養(yǎng)基中MS基本培養(yǎng)基、MS鹽類、White's維生素可市售獲得，為行業(yè)中通用，按商品說明書配用。另需加入BA、IBA生長促進(jìn)劑、凝固劑和營養(yǎng)劑，凝固劑及其添加量選定為0.25%的水晶洋菜，3"/。的蔗糖營養(yǎng)劑，這是一種優(yōu)選方案，培養(yǎng)基的pH值5.2-6.0，最佳值為5.7，按生長促進(jìn)劑的成分與添加量的不同，配制成不同誘導(dǎo)階段應(yīng)用的培養(yǎng)基一是誘導(dǎo)叢生芽的培養(yǎng)基，二是叢生芽增殖培養(yǎng)基，三是前期和后期生糾養(yǎng)基?，F(xiàn)將二種叢生芽培養(yǎng)基的四個實(shí)施例的原料與配比列表如下<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>兩種叢芽培養(yǎng)基中因肌醇為100mg/L的單一定值，White，s維生素為通用商品，加入量按商品說明書辦，故未在表中列入。還有一種前期和后期生根培養(yǎng)基，因給出的各原料都是最佳的單一配比數(shù)值，因此不列A^內(nèi)，只在步驟(4)中插入介紹。用花葉花桿綠竹的頂芽和側(cè)芽的芽體做外植體，進(jìn)行組培快繁方法最佳方案的實(shí)施例1介紹如下(參閱表中實(shí)施例1),步驟是(1)外植體的采集與消毒采集帶有萌發(fā)頂芽和側(cè)芽的枝條，帶回實(shí)驗(yàn)室，剝?nèi)U籜，自來水沖洗2h，在稀釋至0.5%NaCI0溶液中，真空條件下浸泡10min，用無菌水沖洗五次，顯微鏡下切取長約0.2-lmm的芽體組織；(2)叢生芽的誘導(dǎo)將切得的芽體組織接種到權(quán)利要求2所述的MS鹽類、White's維生素、100mg/L的肌醇、1.0mg/L的BA、0.25水晶洋菜、3%蔗糖，配制成的誘導(dǎo)叢生芽的培養(yǎng)基中，光照強(qiáng)度2500Lux、溫度25土2X:、光照16h/d條件下，7-10d后芽始萌，15-20d后基部生出新的叢生芽；(3)叢生芽增殖與快繁將上述叢生芽切下，接種到權(quán)利要求3所述的由MS鹽類、White's維生素、100mg/L的肌醇、3.0mg/L的BA、0.25%水晶洋菜、3%蔗糖，配制成的誘導(dǎo)叢生芽增殖培養(yǎng)基中，光照強(qiáng)度2500Lux，光照16h/d，25土2"C糾下，10-15d后伸長，兩個月后增殖系數(shù)達(dá)3-5倍；(4)誘導(dǎo)生^L與移栽將伸長后的叢生芽3-4個為一叢，接種到權(quán)利要4所述的100mg/L的肌醇、White's維生素、50ppm的IBA、0.25%的水晶洋菜、3%的蔗糖配制成的前期生#^養(yǎng)基培養(yǎng)l-3天，再接種到后期生才MI"養(yǎng)基即MS基4^養(yǎng)基中，光照強(qiáng)度3700Lux，光照16h/d，25土2X:糾下，15-20d后開始生根，培養(yǎng)60d后，生根率達(dá)40%，取生長良好的再生植林置于馴化室，強(qiáng)光20000Lux下馴化2周移栽，先用清水洗去4艮部的培養(yǎng)基，種植于三者體積比為蛭石珍珠巖泥炭-l:l:l的混合而成的基質(zhì)中，單個花盆套透明塑料袋，該袋每二天剪一小口，一周后棄袋移入溫室栽種即成。其余實(shí)施例2-4參照表中對應(yīng)的原料及配比值，按實(shí)施例1相同方法，均能分化、誘導(dǎo)和快繁出花葉花桿綠竹苗，只是分化率、叢芽數(shù)、生根率、健壯程度有差異，總的說所取值越接近最佳方案值的越理想，如有需要，本申請人將隨時提供各階段實(shí)物苗的照片，以供審核。權(quán)利要求1、一種花葉花桿綠竹芽體組織培養(yǎng)基，含有MS基本培養(yǎng)基、MS鹽類，其特征是還含有0.3-3mg/L或1-5mg/L的BA即芐氨基腺嘌呤或50ppm的IBA即吲哚丁酸、White’s維生素、100mg/L的肌醇，附加占各自培養(yǎng)基總重量0.2-0.4％的水晶洋菜和1.5-4.5％的蔗糖，配成三個階段分別應(yīng)用的誘導(dǎo)叢生芽培養(yǎng)基、叢生芽增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基，各培養(yǎng)基的pH值5.2-6.0。2、如權(quán)利要求1所述的花葉花桿綠竹芽體組織培養(yǎng)基，其特征是是由MS鹽類、White's維生素、100mg/L的肌醇、0.3-3.Omg/L的BA、占培養(yǎng)基總重量0.2-0.4。/。的水晶洋菜和1.5-4.5%的蔗糖，配制成誘導(dǎo)叢生芽培養(yǎng)基，pH值5.2-6.0。3、如權(quán)利要求1所述的花葉花桿綠竹芽體組織培養(yǎng)基，其特征是由MS鹽類、White's維生素、100mg/L的肌醇、1-5.Omg/L的BA、占培養(yǎng)基總重量O.2-0.4%的水晶洋菜和1.5-4.5%的蔗糖，配制成叢生芽增殖培養(yǎng)基，pH值5.2-6.0。4、如權(quán)利要求1所述的花葉花桿綠竹芽體組織培養(yǎng)基，其特征是由100mg/L的肌醇、White's維生素、50卯m的IBA、占培養(yǎng)基總重量0.25%的水晶洋菜和3%的蔗糖，配制成前期生才艮培養(yǎng)基，由MS基#養(yǎng)基作后期生根培養(yǎng)基。5、一種用如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的花葉花桿綠竹芽體組織培養(yǎng)基進(jìn)行組培快繁方法經(jīng)過下列步驟(l)外植體的采集與消毒采集春天萌發(fā)枝條，帶回實(shí)驗(yàn)室，剝?nèi)U籜，自來水沖洗2h,在稀釋至0.5%NaCI0溶液中，真空條件下浸泡lOmin，用無菌水沖洗五次后，顯微:鏡下切取長約0.2-lmm芽體的組織；(2)叢生芽的誘導(dǎo)將切得的芽體組織接種如權(quán)利要求2所述的誘導(dǎo)叢生芽的培養(yǎng)基中，光照強(qiáng)度2500Lux、溫度25土2X:、光照16h/d條件下，7-10d后芽始萌，15-20d后基部生出新的叢生芽；(3)叢生芽增殖與快繁將上述叢生芽切下，接種到如權(quán)利要求3所述的叢生芽增殖培養(yǎng)基中，光照強(qiáng)度2500Lux，光照16h/d，25土2iC糾下，10-15d后伸長，兩個月后增殖系數(shù)達(dá)3-5倍；(4)誘導(dǎo)生根與移栽將伸長后的叢生芽3-4個為一叢，接種到如權(quán)利要求4所述的前期生才M^養(yǎng)基中培養(yǎng)1-3天，再接種到后期生根培養(yǎng)基即MS基本培養(yǎng)基中，光照強(qiáng)度3700Lux，光照16h/d，25土2X:^Ht下，15-20d后開始生根，培養(yǎng)50-60d后，生根率達(dá)4(^,取生長良好的再生植林置于馴化室，強(qiáng)光20000Lux下馴化2周移栽，先用清水洗去根部的培養(yǎng)基，種植于蛭石珍珠巖泥炭=1:1:1的基質(zhì)中，單個花盆套透明塑料袋，該袋每二天剪一小口，一周后棄袋移入溫室栽種即成。全文摘要一種花葉花桿綠竹芽體組織培養(yǎng)基主要由MS基本培養(yǎng)基、MS鹽類、BA1.0-5.0mg/L和IBA20-100ppm、White’s維生素、100mg/L的肌醇組成，能有效地誘導(dǎo)增殖叢生芽和生根，快速培育、繁殖出再生苗。用本組織培養(yǎng)基組培快繁花葉花桿綠竹經(jīng)過下列四個步驟一是外植體的采集與消毒，二是叢生芽的誘導(dǎo)，三是叢生芽的增殖與快繁，四是誘導(dǎo)生根與移栽。采用本培養(yǎng)基與組培快繁方法，兩個月能使增殖系數(shù)達(dá)3.0-5.0，試管生根率高達(dá)40％，試管苗的移栽成活率達(dá)95％。本發(fā)明突破了竹類外植體組織培養(yǎng)出再生植株的難題，節(jié)省了用地、母株、時間與成本，繁殖不受季節(jié)制約，為大量盆景培植、大面積綠化用竹，奠定了快速和充足的竹苗生產(chǎn)基礎(chǔ)。文檔編號C12N5/04GK101386835SQ20081012161公開日2009年3月18日申請日期2008年10月14日優(yōu)先權(quán)日2008年10月14日公開號200810121613.發(fā)明者偉方,林新春,桂仁意,裴海燕,陳懿涵,黃麗春申請人:浙江林學(xué)院