本發(fā)明屬于植株培養(yǎng)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種諸葛菜胚狀體和植株的培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

諸葛菜[orychophragmusviolaceus(l.)o.e.schulz]為十字花科(cruciferae)諸葛菜屬植物，主要分布在中國，在許多地區(qū)都有自然分布或人工引種栽培。諸葛菜常被用作園林、城市綠化地被植物和花壇花卉，別稱“二月藍(lán)(蘭)”。除本身具有較高的觀賞價(jià)值外，諸葛菜還可能是創(chuàng)造紅花觀光型油菜品種的基因供體優(yōu)良材料。將油菜近緣植物芥藍(lán)(brassicaalboglabra)與諸葛菜雜交，雜種即開紫紅或粉紅花(殷家明等，1998)。另外，諸葛菜還是極具開發(fā)前景的蔬菜和飼料種質(zhì)資源。

諸葛菜在我國分布廣，遺傳變異大，多樣性豐富，這為諸葛菜的選育提供了材料基礎(chǔ)。通過花藥或花粉培養(yǎng)可以快速獲得單倍體和純合二倍體，有利于諸葛菜新材料的選育和研究。吳沿友等(吳沿友，羅鵬.1996.諸葛菜的花藥培養(yǎng).園藝學(xué)報(bào)，23(4):404-406.)進(jìn)行諸葛菜花藥培養(yǎng)，得到了少量胚狀體和再生植株，而且所得植株為混倍體，且植株的組織來源是花藥體細(xì)胞還是小孢子并不清楚。賈勇炯等(賈勇炯，唐琳，林宏輝，陳放，王幼平.1999.諸葛菜離體花粉粒誘導(dǎo)形成花粉植株的研究.四川大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，36(6):1106-1110.)從4℃低溫處理4天的諸葛菜花藥中再分離小孢子進(jìn)行培養(yǎng)，獲得了愈傷組織和再生植株，其植株再生途徑為小孢子愈傷組織，再生植株容易發(fā)生變異。然而，關(guān)于諸葛菜游離小孢子培養(yǎng)獲得胚狀體和再生植株還未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明針對(duì)上述的問題，提供了一種諸葛菜胚狀體和植株的培養(yǎng)方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種諸葛菜胚狀體和植株的培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

1)9月中下旬，將諸葛菜種子于大田播種育苗，將幼苗移栽到玻璃溫室內(nèi)土壤中，成活后每窩施復(fù)合肥5g，根據(jù)需要澆水；溫室光照為自然光，溫度不做特殊控制；開花后取樣進(jìn)行小孢子培養(yǎng)；

2)小孢子培養(yǎng)：花期上午8～9點(diǎn)，從生長健康植株取4～5mm長花蕾，經(jīng)5％氨替福民溶液消毒10～15min后用無菌水清洗；消毒花蕾置于培養(yǎng)皿中，加適量b5-13培養(yǎng)液(ph5.8，含13％蔗糖)，用注射器內(nèi)筒研磨擠壓出花粉，400目不銹鋼篩網(wǎng)過濾，將花粉懸液轉(zhuǎn)移到離心管中離心，棄上清液，再加入b5-13培養(yǎng)液搖勻離心；如此重復(fù)離心3次后，用ph6.0的nln-13培養(yǎng)液按1蕾花粉/ml密度懸??；將小孢子nln-13懸液混勻，分裝于ф6cm培養(yǎng)皿，在每皿中添加活性炭儲(chǔ)存液，封口膜封口后進(jìn)行熱激培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)移到25℃下繼續(xù)暗培養(yǎng)，肉眼可見胚狀體時(shí)轉(zhuǎn)入振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，得到子葉胚；

3)植株再生、移栽：將振蕩培養(yǎng)后的子葉胚轉(zhuǎn)移到瓊脂培養(yǎng)基上，在光照條件下培養(yǎng)；出芽后將芽切下繼代保存和擴(kuò)繁到每個(gè)花粉植株無性系具有3～5芽；移栽前1個(gè)月，將芽轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上生根；生根后的試管苗經(jīng)煉苗1周后移栽到試驗(yàn)地，最初1周內(nèi)用白色塑料膜遮蔽。

進(jìn)一步地，步驟2)中的活性炭儲(chǔ)存液通過以下步驟制備得到：在100ml超純水中加入1g活性炭和0.5g瓊脂糖，121℃高溫滅菌后儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

進(jìn)一步地，步驟2)中離心條件為：轉(zhuǎn)速為900-1500r/min，時(shí)間為1-5min。

進(jìn)一步地，步驟2)中每皿中活性炭與小孢子nln-13懸液的質(zhì)量體積比(mg/ml)為：1:4～3:4。

進(jìn)一步地，步驟2)中熱激培養(yǎng)條件具體為：32～35℃暗培養(yǎng)1-7天。

進(jìn)一步地，步驟2)中振蕩培養(yǎng)箱中的培養(yǎng)條件為：轉(zhuǎn)速為55-65r/min，時(shí)間為14～20d，溫度為25℃。

進(jìn)一步地，步驟3)中子葉胚轉(zhuǎn)移到瓊脂培養(yǎng)基中的瓊脂培養(yǎng)基為：1/2ms+3％蔗糖+7g/l瓊脂，ph＝5.8；光照條件為20℃、1000lux16h/d。

進(jìn)一步地，步驟3)中生根培養(yǎng)基為：1/2ms+0.5mg/liba+3％蔗糖+7g/l瓊脂培養(yǎng)基，ph＝5.8。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明可以獲得包括以下技術(shù)效果：

1)活性炭和熱激培養(yǎng)對(duì)胚狀體誘導(dǎo)是必需的。在ф6cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)4ml1花蕾花粉/ml的小孢子nln-13懸液時(shí)，每皿添加1mg活性炭和32℃熱激3天的培養(yǎng)子葉形胚狀體和總胚狀體產(chǎn)量最高，分別為0.92±0.18個(gè)/花蕾和1.32±0.25個(gè)/花蕾。

2)子葉形胚狀體在1/2ms培養(yǎng)基上萌發(fā)率為27.73％?；ǚ壑仓曛凶匀患颖堵蕿?5％，加倍植株染色體數(shù)為24，單倍體植株染色體數(shù)為12。加倍植株較單倍體植株生長健壯，花和花蕾較大。

3)加倍植株可育花粉率為58.35～76.03％，自交每果結(jié)籽0～0.65粒，異交每果結(jié)籽10.20～16.40粒；單倍體植株可育花粉率為0，不能結(jié)籽。

4)本發(fā)明采用純化的小孢子培養(yǎng)技術(shù)，通過添加活性炭和熱激培養(yǎng)，胚狀體產(chǎn)量高，且再生植株要么為加倍植株，要么為單倍體植株，植株的組織來源清楚，為小孢子。

5)本發(fā)明采用小孢子的nln-13培養(yǎng)懸液，通過添加活性炭和熱激培養(yǎng)來獲得胚狀體，植株再生途徑為小孢子胚狀體，再生植株不容易發(fā)生變異，利于快速獲得穩(wěn)定的后代。

6)本發(fā)明可以快速獲得數(shù)量較多的諸葛菜小孢子胚狀體和遺傳穩(wěn)定的再生植株，有利于加快諸葛菜新品種培育的進(jìn)程。

當(dāng)然，實(shí)施本發(fā)明的任一產(chǎn)品并不一定需要同時(shí)達(dá)到以上所述的所有技術(shù)效果。

附圖說明

此處所說明的附圖用來提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，構(gòu)成本發(fā)明的一部分，本發(fā)明的示意性實(shí)施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中：

圖1是本發(fā)明諸葛菜小孢子胚胎發(fā)生過程；其中，a：部分小孢子膨大；b：小孢子均等分裂；c：小孢子不均等分裂；d：多細(xì)胞團(tuán)；e：具胚柄狀結(jié)構(gòu)的原胚；f：球形原胚；g：球形胚；h：具胚柄狀結(jié)構(gòu)的圓球形胚狀體；i：卵球形胚狀體；j：桃心形胚狀體；k：心臟形胚狀體；l：培養(yǎng)28天后的胚狀體；

圖2是本發(fā)明諸葛菜小孢子胚狀體形態(tài)；其中，a：雙子葉胚狀體；b：三子葉胚狀體；c：具1胚根狀結(jié)構(gòu)三子葉胚狀體；d：單子葉胚狀體；e：合生雙胚；f：魚雷形胚狀體；g：心形胚狀體；h：球形胚狀體；i：不規(guī)則形胚狀體；標(biāo)尺＝2mm；

圖3是本發(fā)明諸葛菜小孢子植株的再生、形態(tài)、育性和倍性；其中，a：胚狀體萌發(fā)；b：加倍的小孢子植株；c：單倍體植株；d：加倍和單倍體植株的花和花蕾；e：加倍植株花粉；f：單倍體植株花粉；g：加倍植株花粉母細(xì)胞染色體(2n＝24)；h：單倍體植株花粉母細(xì)胞染色體(2n＝12)；標(biāo)尺＝10μm。

具體實(shí)施方式

以下將配合實(shí)施例來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方式，藉此對(duì)本發(fā)明如何應(yīng)用技術(shù)手段來解決技術(shù)問題并達(dá)成技術(shù)功效的實(shí)現(xiàn)過程能充分理解并據(jù)以實(shí)施。

本發(fā)明公開了一種諸葛菜胚狀體和植株的培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

1)將諸葛菜種子于大田播種育苗，將幼苗移栽到玻璃溫室內(nèi)土壤中，成活后每窩施復(fù)合肥約5g，根據(jù)需要澆水；溫室光照為自然光，溫度不做特殊控制；開花后取樣進(jìn)行小孢子培養(yǎng)；

2)小孢子培養(yǎng)：花期上午8～9點(diǎn)，從生長健康植株取4～5mm長花蕾，經(jīng)5％氨替福民溶液消毒10～15min后用無菌水清洗；消毒花蕾置于培養(yǎng)皿中，加適量b5-13培養(yǎng)液(ph5.8，含13％蔗糖)，用注射器內(nèi)筒研磨擠壓出花粉，400目不銹鋼篩網(wǎng)過濾，將花粉懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，900-1200r/min離心1-5min，棄上清液，再加入b5-13培養(yǎng)液搖勻離心；如此重復(fù)離心3次后，用nln-13培養(yǎng)液(ph6.0)按1蕾花粉/ml密度懸浮，得到小孢子nln-13懸液；將小孢子nln-13懸液混勻，分裝于培養(yǎng)皿，在培養(yǎng)皿中添加活性炭儲(chǔ)存液，每個(gè)培養(yǎng)皿中的活性炭與小孢子nln-13懸液的質(zhì)量體積比(mg/ml)為：1:4～3:4；封口膜封口后在32～35℃暗培養(yǎng)1～7天，然后轉(zhuǎn)移到25℃下繼續(xù)暗培養(yǎng)，肉眼可見胚狀體時(shí)轉(zhuǎn)入25℃的振蕩培養(yǎng)箱中55-65r/min培養(yǎng)14～20d，得到子葉胚；

其中，活性炭儲(chǔ)存液通過以下步驟制備得到：在100ml超純水中加入1g活性炭和0.5g瓊脂糖，121℃高溫滅菌后儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?/p>

3)植株再生、移栽：將振蕩培養(yǎng)后的子葉胚轉(zhuǎn)移到1/2ms+3％蔗糖+7g/l瓊脂培養(yǎng)基(ph5.8)上，在20℃、1000lux16h/d光照條件下培養(yǎng)；出芽后將芽切下繼代保存和擴(kuò)繁到每個(gè)花粉植株無性系具有3～5芽。移栽前1個(gè)月，將芽轉(zhuǎn)移到1/2ms+0.5mg/liba+3％蔗糖+7g/l瓊脂培養(yǎng)基(ph5.8)上生根；生根后的試管苗經(jīng)煉苗1周后移栽到試驗(yàn)地，最初1周內(nèi)用白色塑料膜遮蔽。

實(shí)施例1

諸葛菜種子收集于重慶北碚西南大學(xué)校園內(nèi)野生開放授粉植株，由重慶市油菜工程技術(shù)研究中心繁殖保存。2010年9月20日于大田播種育苗，11月7日將幼苗移栽到西南大學(xué)校內(nèi)玻璃溫室內(nèi)土壤中，共移栽100株，成活后每窩施復(fù)合肥約5g，根據(jù)需要澆水。溫室光照為自然光，溫度不做特殊控制。2011年2月開花后取樣進(jìn)行小孢子培養(yǎng)，10月將小孢子植株移栽到試驗(yàn)地，次年開花后進(jìn)行形態(tài)觀察和結(jié)實(shí)性鑒定，并取樣觀察花粉育性和染色體數(shù)目。

其中，小孢子培養(yǎng)具體為：花期上午8～9點(diǎn)，從生長健康植株取4～5mm長花蕾，經(jīng)5％氨替福民溶液消毒10～15min后用無菌水清洗。消毒花蕾置于培養(yǎng)皿中，加適量b5-13培養(yǎng)液(ph5.8，含13％蔗糖)，用注射器內(nèi)筒研磨擠壓出花粉，400目不銹鋼篩網(wǎng)過濾，將花粉懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，1200r/min離心3min，棄上清液，再加入b5-13培養(yǎng)液搖勻離心。如此重復(fù)離心3次后，用nln-13培養(yǎng)液(ph6.0)按1蕾花粉/ml密度懸浮。將小孢子nln-13懸液混勻，分裝于ф6cm培養(yǎng)皿，每皿4ml，在每皿中添加1mg的活性炭，封口膜封口后在32℃暗培養(yǎng)3天，然后轉(zhuǎn)移到25℃下繼續(xù)暗培養(yǎng)，肉眼可見胚狀體時(shí)轉(zhuǎn)入25℃的振蕩培養(yǎng)箱中60r/min培養(yǎng)14～20d后統(tǒng)計(jì)胚狀體產(chǎn)量。其中，活性炭儲(chǔ)存液通過以下步驟制備得到：在100ml超純水中加入1g活性炭和0.5g瓊脂糖，121℃高溫滅菌后儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?/p>

將小孢子植株移栽到試驗(yàn)地具體為：將振蕩培養(yǎng)14～20d的子葉胚轉(zhuǎn)移到1/2ms+3％蔗糖+7g/l瓊脂培養(yǎng)基(ph5.8)上，在20℃、1000lux16h/d光照條件下培養(yǎng)。出芽后將芽切下繼代保存和擴(kuò)繁到每個(gè)花粉植株無性系具有3～5芽。移栽前1個(gè)月，將芽轉(zhuǎn)移到1/2ms+0.5mg/liba+3％蔗糖+7g/l瓊脂培養(yǎng)基(ph5.8)上生根。生根后的試管苗經(jīng)煉苗1周后移栽到試驗(yàn)地，最初1周內(nèi)用白色塑料膜遮蔽。

實(shí)施例2

諸葛菜種子收集于重慶北碚西南大學(xué)校園內(nèi)野生開放授粉植株，由重慶市油菜工程技術(shù)研究中心繁殖保存。2010年9月20日于大田播種育苗，11月7日將幼苗移栽到西南大學(xué)校內(nèi)玻璃溫室內(nèi)土壤中，共移栽100株，成活后每窩施復(fù)合肥約5g，根據(jù)需要澆水。溫室光照為自然光，溫度不做特殊控制。2011年2月開花后取樣進(jìn)行小孢子培養(yǎng)，10月將小孢子植株移栽到試驗(yàn)地，次年開花后進(jìn)行形態(tài)觀察和結(jié)實(shí)性鑒定，并取樣觀察花粉育性和染色體數(shù)目。

其中，小孢子培養(yǎng)具體為：花期上午8～9點(diǎn)，從生長健康植株取4～5mm長花蕾，經(jīng)5％氨替福民溶液消毒10～15min后用無菌水清洗。消毒花蕾置于培養(yǎng)皿中，加適量b5-13培養(yǎng)液(ph5.8，含13％蔗糖)，用注射器內(nèi)筒研磨擠壓出花粉，400目不銹鋼篩網(wǎng)過濾，將花粉懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，900r/min離心5min，棄上清液，再加入b5-13培養(yǎng)液搖勻離心。如此重復(fù)離心3次后，用nln-13培養(yǎng)液(ph6.0)按1蕾花粉/ml密度懸浮。將小孢子nln-13懸液混勻，分裝于ф6cm培養(yǎng)皿，每皿4ml，在每皿中添加3mg的活性炭，封口膜封口后在35℃暗培養(yǎng)1天，然后轉(zhuǎn)移到25℃下繼續(xù)暗培養(yǎng)，肉眼可見胚狀體時(shí)轉(zhuǎn)入25℃的振蕩培養(yǎng)箱中55r/min培養(yǎng)20d后統(tǒng)計(jì)胚狀體產(chǎn)量。其中，活性炭儲(chǔ)存液通過以下步驟制備得到：在100ml超純水中加入1g活性炭和0.5g瓊脂糖，121℃高溫滅菌后儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?/p>

將小孢子植株移栽到試驗(yàn)地具體為：將振蕩培養(yǎng)20d的子葉胚轉(zhuǎn)移到1/2ms+3％蔗糖+7g/l瓊脂培養(yǎng)基(ph5.8)上，在20℃、1000lux16h/d光照條件下培養(yǎng)。出芽后將芽切下繼代保存和擴(kuò)繁到每個(gè)花粉植株無性系具有3～5芽。移栽前1個(gè)月，將芽轉(zhuǎn)移到1/2ms+0.5mg/liba+3％蔗糖+7g/l瓊脂培養(yǎng)基(ph5.8)上生根。生根后的試管苗經(jīng)煉苗1周后移栽到試驗(yàn)地，最初1周內(nèi)用白色塑料膜遮蔽。

實(shí)施例3

諸葛菜種子收集于重慶北碚西南大學(xué)校園內(nèi)野生開放授粉植株，由重慶市油菜工程技術(shù)研究中心繁殖保存。2010年9月20日于大田播種育苗，11月7日將幼苗移栽到西南大學(xué)校內(nèi)玻璃溫室內(nèi)土壤中，共移栽100株，成活后每窩施復(fù)合肥約5g，根據(jù)需要澆水。溫室光照為自然光，溫度不做特殊控制。2011年2月開花后取樣進(jìn)行小孢子培養(yǎng)，10月將小孢子植株移栽到試驗(yàn)地，次年開花后進(jìn)行形態(tài)觀察和結(jié)實(shí)性鑒定，并取樣觀察花粉育性和染色體數(shù)目。

其中，小孢子培養(yǎng)具體為：花期上午8～9點(diǎn)，從生長健康植株取4～5mm長花蕾，經(jīng)5％氨替福民溶液消毒10～15min后用無菌水清洗。消毒花蕾置于培養(yǎng)皿中，加適量b5-13培養(yǎng)液(ph5.8，含13％蔗糖)，用注射器內(nèi)筒研磨擠壓出花粉，400目不銹鋼篩網(wǎng)過濾，將花粉懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，1500r/min離心1min，棄上清液，再加入b5-13培養(yǎng)液搖勻離心。如此重復(fù)離心3次后，用nln-13培養(yǎng)液(ph6.0)按1蕾花粉/ml密度懸浮。將小孢子nln-13懸液混勻，分裝于ф6cm培養(yǎng)皿，每皿4ml，在每皿中添加2mg的活性炭，封口膜封口后在33℃暗培養(yǎng)7天，然后轉(zhuǎn)移到25℃下繼續(xù)暗培養(yǎng)，肉眼可見胚狀體時(shí)轉(zhuǎn)入25℃的振蕩培養(yǎng)箱中65r/min培養(yǎng)14d后統(tǒng)計(jì)胚狀體產(chǎn)量。其中，活性炭儲(chǔ)存液通過以下步驟制備得到：在100ml超純水中加入1g活性炭和0.5g瓊脂糖，121℃高溫滅菌后儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?/p>

將小孢子植株移栽到試驗(yàn)地具體為：將振蕩培養(yǎng)14d的子葉胚轉(zhuǎn)移到1/2ms+3％蔗糖+7g/l瓊脂培養(yǎng)基(ph5.8)上，在20℃、1000lux16h/d光照條件下培養(yǎng)。出芽后將芽切下繼代保存和擴(kuò)繁到每個(gè)花粉植株無性系具有3～5芽。移栽前1個(gè)月，將芽轉(zhuǎn)移到1/2ms+0.5mg/liba+3％蔗糖+7g/l瓊脂培養(yǎng)基(ph5.8)上生根。生根后的試管苗經(jīng)煉苗1周后移栽到試驗(yàn)地，最初1周內(nèi)用白色塑料膜遮蔽。

下面結(jié)合具體的實(shí)驗(yàn)過程來說明本發(fā)明的技術(shù)效果：

1材料與方法

1.1材料

諸葛菜種子收集于重慶北碚西南大學(xué)校園內(nèi)野生開放授粉植株，由重慶市油菜工程技術(shù)研究中心繁殖保存。2010年9月20日于大田播種育苗，11月7日將幼苗移栽到西南大學(xué)校內(nèi)玻璃溫室內(nèi)土壤中，共移栽100株，成活后每窩施復(fù)合肥約5g，根據(jù)需要澆水。溫室光照為自然光，溫度不做特殊控制。2011年2月開花后取樣進(jìn)行小孢子培養(yǎng)，10月將小孢子植株移栽到試驗(yàn)地，次年開花后進(jìn)行形態(tài)觀察和結(jié)實(shí)性鑒定，并取樣觀察花粉育性和染色體數(shù)目。

1.2方法

1.2.1小孢子培養(yǎng)程序

花期上午8～9點(diǎn)，從生長健康植株取4～5mm長花蕾，經(jīng)5％氨替福民溶液消毒10～15min后用無菌水清洗。消毒花蕾置于培養(yǎng)皿中，加適量b5-13培養(yǎng)液(ph5.8，含13％蔗糖)，用注射器內(nèi)筒研磨擠壓出花粉，400目不銹鋼篩網(wǎng)過濾，將花粉懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，1200r/min離心3min，棄上清液，再加入b5-13培養(yǎng)液搖勻離心。如此重復(fù)離心3次后，用nln-13培養(yǎng)液(ph6.0)按1蕾花粉/ml密度懸浮。將小孢子nln-13懸液混勻，分裝于ф6cm培養(yǎng)皿，每皿4ml，在每皿中添加一定量的活性炭，封口膜封口后在32℃暗培養(yǎng)數(shù)天，然后轉(zhuǎn)移到25℃下繼續(xù)暗培養(yǎng)，肉眼可見胚狀體時(shí)轉(zhuǎn)入25℃的振蕩培養(yǎng)箱中60r/min培養(yǎng)14～20d后統(tǒng)計(jì)胚狀體產(chǎn)量。

1.2.2活性炭儲(chǔ)存液的配制

在100ml超純水中加入1g活性炭和0.5g瓊脂糖，121℃高溫滅菌后儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3熱激培養(yǎng)時(shí)間對(duì)胚狀體產(chǎn)量的影響

每皿添加活性炭儲(chǔ)存液(100ul)，使活性炭濃度達(dá)到1mg/皿，32℃下分別熱激培養(yǎng)(即32℃暗培養(yǎng))0、1、3、5和7d，研究熱激培養(yǎng)時(shí)間對(duì)胚狀體產(chǎn)量的影響。在初花5d后1周內(nèi)重復(fù)取材3次，每處理每次重復(fù)5皿。

1.2.4活性炭濃度對(duì)胚狀體產(chǎn)量的影響

每皿添加0、1、2和3mg活性炭，在32℃下熱激培養(yǎng)3天，研究活性炭濃度對(duì)胚狀體產(chǎn)量的影響。在初花5d后1周內(nèi)重復(fù)取材3次進(jìn)行試驗(yàn)，每處理每次重復(fù)5皿。

1.2.5胚狀體發(fā)生過程和形態(tài)觀察

以每皿添加1mg活性炭、32℃熱激3天的培養(yǎng)物為對(duì)象，經(jīng)1、3、5、7、10和14d培養(yǎng)，分別在倒置顯微鏡下觀察胚狀體發(fā)生過程。振蕩培養(yǎng)14～20d后，在體式顯微鏡下觀察胚狀體形態(tài)。

1.2.6植株再生、移栽、育性和倍性鑒定

將振蕩培養(yǎng)14～20d的子葉胚轉(zhuǎn)移到1/2ms+3％蔗糖+7g/l瓊脂培養(yǎng)基(ph5.8)上，在20℃、1000lux16h/d光照條件下培養(yǎng)。出芽后將芽切下繼代保存和擴(kuò)繁到每個(gè)花粉植株無性系具有3～5芽。移栽前1個(gè)月，將芽轉(zhuǎn)移到1/2ms+0.5mg/liba+3％蔗糖+7g/l瓊脂培養(yǎng)基(ph5.8)上生根。生根后的試管苗經(jīng)煉苗1周后移栽到試驗(yàn)地，最初1周內(nèi)用白色塑料膜遮蔽。

在花期，對(duì)植株進(jìn)行形態(tài)觀察，取即將開放花朵，取出花藥并擠出花粉用2％醋酸洋紅染液染色后在顯微鏡下觀察統(tǒng)計(jì)花粉育性。取幼嫩花蕾用卡諾氏固定液(3份95％乙醇：1份冰乙酸)固定24小時(shí)后轉(zhuǎn)入75％酒精于冰箱內(nèi)4℃保存?zhèn)溆茫酶牧伎▽毱芳t液染色觀察花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂后期i或前期ii染色體數(shù)目。對(duì)加倍的植株采用人工輔助授粉自交，以了解自交結(jié)籽率；同時(shí)，輔助授以天然諸葛菜混合花粉，以了解異交結(jié)籽率。

2結(jié)果與分析

2.1胚狀體發(fā)生過程和形態(tài)

小孢子培養(yǎng)1天后，部分小孢子體積明顯增大，呈圓球形；另一部分小孢子體積則沒有明顯變化(圖1a)。培養(yǎng)3天后，觀察到一些小孢子發(fā)生第1次細(xì)胞分裂。分裂方式有2種，多為對(duì)稱分裂，形成2個(gè)大小近等的細(xì)胞(圖1b)；另一種是非對(duì)稱分裂，形成2個(gè)大小明顯不同的細(xì)胞(圖1c)。培養(yǎng)5天后，可觀察到多細(xì)胞團(tuán)(圖1d)和具有胚柄狀結(jié)構(gòu)的原胚(圖1e)。培養(yǎng)7天后，胚發(fā)育到球形原胚階段(圖1f)。培養(yǎng)10天后，胚發(fā)育到球形胚時(shí)期(圖1g)。培養(yǎng)14天，肉眼可見細(xì)小的白色顆粒狀培養(yǎng)物，在倒置顯微鏡下觀察為球形胚狀體和心形胚狀體，包括圓球形(圖1h)和卵球形(圖1i)胚狀體以及桃心形(圖1j)和心臟形胚狀體(圖1k)。繼續(xù)振蕩培養(yǎng)14天后，胚狀體發(fā)育到子葉期(圖1l)。

振蕩培養(yǎng)14～20d后在體式顯微鏡下觀察胚狀體形態(tài)。胚狀體可分為5種類型：子葉形胚狀體(圖2a，2b，2c，2d，2e)、魚雷形胚狀體(圖2f)、心形胚狀體(圖2g)、球形胚狀體(圖2h)和不規(guī)則形胚狀體(圖2i)。同一類型的胚狀體又有多種多樣的形態(tài)。如子葉期胚狀體就有雙子葉胚狀體(圖2a)、三子葉胚狀體(圖2b，2c)、單子葉胚狀體(圖2d)和2個(gè)雙子葉胚狀體合生(圖2e)等多樣的形態(tài)表現(xiàn)；球形胚狀體有橄欖球形、橢球形、卵球形和圓球形胚狀體等形態(tài)差異(圖2h)。

2.2熱激培養(yǎng)時(shí)間對(duì)胚狀體產(chǎn)量的影響

試驗(yàn)結(jié)果(表1)表明，相對(duì)于持續(xù)25℃培養(yǎng)，32℃熱激培養(yǎng)對(duì)于胚狀體誘導(dǎo)和形成是必需的。未經(jīng)熱激培養(yǎng)不能誘導(dǎo)形成任何形態(tài)的胚狀體，熱激培養(yǎng)1天便能誘導(dǎo)產(chǎn)生胚狀體。試驗(yàn)以熱激培養(yǎng)3天獲得的總胚狀體產(chǎn)量最高，子葉形胚狀體產(chǎn)量也最高。熱激培養(yǎng)時(shí)間再延長，總胚狀體產(chǎn)量和子葉形胚狀體產(chǎn)量都有降低的趨勢。

表1不同熱激時(shí)間下諸葛菜小孢子胚狀體產(chǎn)量(個(gè)/蕾)

注：同一列數(shù)字后字母不同表示在0.05水平上差異顯著。

2.3活性炭濃度對(duì)胚狀體產(chǎn)量的影響

試驗(yàn)結(jié)果(表2)表明，添加活性炭對(duì)于胚狀體的形成是必需的，不添加活性炭的處理未獲得任何形態(tài)的胚狀體。每皿添加1mg活性炭時(shí)總胚狀體產(chǎn)量和子葉形胚狀體產(chǎn)量最高，但與每皿添加活性炭2mg時(shí)的總胚狀體產(chǎn)量和子葉形胚狀體產(chǎn)量相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著性差異。添加活性炭過多則不利于胚狀體的形成，對(duì)子葉形胚狀體的形成影響更大。

表2不同活性炭濃度下諸葛菜小孢子胚狀體產(chǎn)量(個(gè)/蕾)

注：同一列數(shù)字后字母不同表示在0.05水平上差異顯著。

2.4植株再生、形態(tài)、育性和倍性

將子葉形胚狀體轉(zhuǎn)移到1/2ms固體培養(yǎng)基上，有的胚狀體逐漸褐化死亡；有的胚狀體胚軸伸長但不出芽；也有胚狀體很快便開始萌發(fā)并出芽，其下胚軸伸長，長出白色的根，在子葉節(jié)處長出幼芽(圖3a)。共培養(yǎng)子葉胚119個(gè)，經(jīng)過30天培養(yǎng)，有33個(gè)胚狀體萌發(fā)出芽，萌發(fā)率為27.73％。胚狀體萌發(fā)產(chǎn)生的根纖弱且數(shù)量少，將芽切下轉(zhuǎn)移到1/2ms固體培養(yǎng)基繼代保存和擴(kuò)大繁殖到每個(gè)無性系有3～5芽。移栽前1個(gè)月，將繼代保存的無性系32個(gè)轉(zhuǎn)移到1/2ms+iba0.5mg/l固體培養(yǎng)基上生根，有22個(gè)無性系生根，生根率為68.75％。生根后的試管苗經(jīng)煉苗1周后移栽到試驗(yàn)地，共移栽22個(gè)無性系，到2012年開花期有12個(gè)存活，移栽存活率為54.55％。

開花期觀察，根據(jù)植株形態(tài)特別是花器官大小，植株可分為2種類型，即加倍的植株(圖3b)和單倍體植株(圖3c)。加倍植株生長健壯，花蕾較多，花朵和花蕾較大；而單倍體植株較為纖弱，花蕾較少，花朵和花蕾較小(圖3b，3c，3d)。在存活的12個(gè)花粉植株無性系中，有3個(gè)為自然加倍植株，自然加倍率為25％。加倍植株花藥飽滿，內(nèi)含大量可育花粉(圖3e)。不同加倍植株間花粉育性有差異，3個(gè)加倍花粉植株可育花粉率分別為58.35％、62.68％和76.03％。單倍體植株花藥干癟，內(nèi)含花粉粒少，在顯微鏡下觀察全為小而不可染色的敗育花粉(圖3f)。染色體數(shù)量觀察表明，加倍植株染色體為24條(圖3g)，單倍體植株染色體為12條(圖3h)。加倍植株自交能結(jié)少量種子，表現(xiàn)自交高度不親和，3個(gè)加倍花粉植株平均每果結(jié)籽數(shù)分別為0、0.25和0.65。對(duì)3株加倍植株輔助授以天然諸葛菜混合花粉則能結(jié)較多種子，平均每果結(jié)籽數(shù)分別為10.20、12.65和16.40。單倍體植株開放式授粉和人工輔助授以天然諸葛菜混合花粉均不能結(jié)籽。

3討論

小孢子胚胎發(fā)生和胚狀體形態(tài)觀察表明，諸葛菜小孢子胚胎發(fā)生經(jīng)歷了均等或非均等細(xì)胞分裂、多細(xì)胞團(tuán)、球形原胚、球形胚、心形胚、魚雷形胚和子葉胚等時(shí)期，這與同為十字花科的蕓薹屬植物的情形相似。本發(fā)明還觀察到具有胚柄狀結(jié)構(gòu)的胚。由于具胚柄小孢子胚與合子胚更相似，因此具胚柄小孢子胚發(fā)育途徑誘導(dǎo)體系在研究胚胎發(fā)育機(jī)制方面有重要價(jià)值而受到重視。在甘藍(lán)型油菜中，小孢子培養(yǎng)溫度和時(shí)間是影響胚柄樣結(jié)構(gòu)形成的關(guān)鍵因素。本發(fā)明觀察到胚柄狀結(jié)構(gòu)可持續(xù)到魚雷形胚狀體(圖2f)，而子葉形胚狀體上觀察不到胚柄狀結(jié)構(gòu)。

在十字花科植物小孢子培養(yǎng)中溫度脅迫是誘導(dǎo)小孢子胚胎發(fā)生的重要因素，常用的處理方式是32～35℃熱激處理1至數(shù)天后轉(zhuǎn)移到常溫(25℃)培養(yǎng)。本發(fā)明結(jié)果表明，熱激對(duì)諸葛菜小孢子胚的發(fā)生具有重要作用，相對(duì)于持續(xù)25℃培養(yǎng)來說，32℃熱激培養(yǎng)對(duì)于胚狀體誘導(dǎo)和形成是必需的。低溫脅迫和傳統(tǒng)的高溫脅迫下成熟胚狀體形態(tài)相似，胚狀體萌發(fā)成苗率和花粉植株染色體自發(fā)加倍率都沒有顯著差異，而低溫脅迫較高溫脅迫下胚狀體產(chǎn)量要低得多，所需培養(yǎng)時(shí)間也較長。另外，高溫脅迫處理在十字花科植物小孢子培養(yǎng)中得到廣泛應(yīng)用，而小孢子低溫脅迫培養(yǎng)體系在其它基因型材料上的適用性還需進(jìn)一步研究。

活性炭具有吸附和減少培養(yǎng)基中的抑制成分和有毒代謝產(chǎn)物的能力，經(jīng)常用于植物組織培養(yǎng)中來改善細(xì)胞的生長和發(fā)育。本發(fā)明說明了活性炭對(duì)小孢子胚胎發(fā)生和植株再生表現(xiàn)出促進(jìn)作用，在小孢子培養(yǎng)中的重要性，結(jié)果表明，添加活性炭對(duì)諸葛菜小孢子胚胎發(fā)生是必需的。

上述說明示出并描述了發(fā)明的若干優(yōu)選實(shí)施例，但如前所述，應(yīng)當(dāng)理解發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應(yīng)看作是對(duì)其他實(shí)施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構(gòu)想范圍內(nèi)，通過上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識(shí)進(jìn)行改動(dòng)。而本領(lǐng)域人員所進(jìn)行的改動(dòng)和變化不脫離發(fā)明的精神和范圍，則都應(yīng)在發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。