一個(gè)高產(chǎn)藥用天然產(chǎn)物的硬紫草轉(zhuǎn)基因毛狀根株系的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一個(gè)能高產(chǎn)藥用天然產(chǎn)物(紫草寧及其衍生物)的硬紫草的轉(zhuǎn)基因毛狀根株系。該株系是通過(guò)構(gòu)建一個(gè)硬紫草乙烯合成的關(guān)鍵酶基因(LeACS-1)的植物過(guò)表達(dá)載體，然后將該載體轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834后侵染硬紫草無(wú)菌苗而獲得。該株系所產(chǎn)紫草寧及其衍生物的含量是直接用ATCC15834侵染硬紫草無(wú)菌苗所獲得的毛狀根株系的2.73倍。另外，該株系亦易于繁殖、生長(zhǎng)迅速。本發(fā)明不僅可有效解決我國(guó)野外硬紫草資源日益短缺、人工栽培周期長(zhǎng)、受氣候及地理?xiàng)l件等因素制約等問(wèn)題，并且可高效大量生產(chǎn)硬紫草藥用天然產(chǎn)物。該高產(chǎn)株系將為利用硬紫草毛狀根工廠(chǎng)化生產(chǎn)硬紫草藥用天然產(chǎn)物提供材料支撐，具有廣闊的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一個(gè)高產(chǎn)藥用天然產(chǎn)物的硬紫草轉(zhuǎn)基因毛狀根株系

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，涉及將攜帶目的基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌，然后再侵染硬紫草無(wú)菌苗而誘導(dǎo)出轉(zhuǎn)基因的毛狀根株系。

【背景技術(shù)】
[0002]硬紫草(Lithospermumerythrorhizon sieb.et zucc)是我國(guó)一種重要的藥用植物，其根部可合成紫紅色的萘醌類(lèi)藥用天然產(chǎn)物一紫草寧及其衍生物(以下簡(jiǎn)稱(chēng)紫草寧)，這類(lèi)物質(zhì)具有抗菌、消炎、活血等功效，而且還是一種珍貴的天然色素，可以廣泛用于食品、高級(jí)化妝品、日化產(chǎn)品與塑料制品的著色等[1_3]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的研究還發(fā)現(xiàn)紫草寧通過(guò)活化Caspase-3和抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶活性來(lái)誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，被認(rèn)為是繼喜樹(shù)堿、紫杉醇之后又一類(lèi)極具潛力的天然抗菌消炎、抗腫瘤、抑制HIV病毒等多種藥理活性的藥物
[4-6]
O
[0003]我國(guó)紫草有新疆紫草、東北硬紫草、內(nèi)蒙紫草、滇紫草、廣西紫草等。近年來(lái)，隨著環(huán)境的變化及人類(lèi)的過(guò)度消耗，各種紫草資源正面臨枯竭。如野生于東北長(zhǎng)白山脈荒山坡地及內(nèi)蒙古草原地帶，因近十幾年對(duì)荒山宜林地的開(kāi)發(fā)利用及大量放牧，野生紫草資源日見(jiàn)減少，只有零星少量分布，目前東北野生紫草已無(wú)法大貨供應(yīng)市場(chǎng)。
[0004]隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，采用生物工程學(xué)手段生產(chǎn)人類(lèi)所需的紫草寧，成為一種非常重要的替代手段。上世紀(jì)70年代，日本即已成功利用兩階段培養(yǎng)法，即在光照條件下B5固體培養(yǎng)基上繁殖紫草細(xì)胞，然后在黑暗條件下利用M9液體生產(chǎn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)紫草細(xì)胞進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)紫草寧，紫草也從而成為世界上第一個(gè)采用細(xì)胞培養(yǎng)體系來(lái)商業(yè)化生產(chǎn)藥用天然產(chǎn)物的藥用植物[7]。但在實(shí)踐過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，用細(xì)胞生產(chǎn)紫草寧存在誘導(dǎo)愈傷細(xì)胞困難、細(xì)胞易于老化褐化、紫草寧產(chǎn)量不高、產(chǎn)量不穩(wěn)定、夏季不產(chǎn)紫草寧等諸多問(wèn)題。
[0005]發(fā)根農(nóng)桿菌是在植物基因工程中廣泛應(yīng)用的一種侵染性很強(qiáng)的根瘤菌科農(nóng)桿菌屬革蘭氏陰性菌，其攜帶的Ri質(zhì)粒能有效侵染絕大多數(shù)雙子葉植物，少數(shù)單子葉植物以及個(gè)別裸子植物，誘發(fā)植物產(chǎn)生形狀如根系的發(fā)根即毛狀根(hairy root)。由于發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的毛狀根具有生長(zhǎng)速度快、分支多，能夠持續(xù)合成次生代謝產(chǎn)物，獲得的次生代謝產(chǎn)物量高且穩(wěn)定、不需要添加外源植物激素等特點(diǎn)，因此可作為生產(chǎn)和研究植物次生代謝物質(zhì)的生物反應(yīng)器；同時(shí)，由于發(fā)根農(nóng)桿菌攜帶的Ri質(zhì)粒能將外源基因整合到寄主染色體、其誘導(dǎo)產(chǎn)生的毛狀根易獲得再生植株等優(yōu)點(diǎn)，因此，建立特定植物的轉(zhuǎn)基因毛狀根體系，在定向分子育種方面具有廣泛應(yīng)用前景。近年來(lái)利用發(fā)根農(nóng)桿菌已轉(zhuǎn)化大約160多種植物，在40多種植物建立了毛狀根培養(yǎng)體系，特別是一些藥用植物建立了毛狀根轉(zhuǎn)基因體系，極大地方便了藥用天然產(chǎn)物生產(chǎn)及遺傳育種研究。
[0006]紫草寧的合成受到多種物理和化學(xué)因素的影響，如無(wú)機(jī)鹽離子、光、乙烯和茉莉酸等[8_1(1]。乙烯是一種能調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育、抗逆境脅迫反應(yīng)等多個(gè)方面的氣態(tài)類(lèi)激素，通過(guò)改變乙烯濃度，或者改變植物乙烯信號(hào)傳導(dǎo)途徑中關(guān)鍵基因的表達(dá)，可以改變植物天然產(chǎn)物的合成量，如改變煙草ERF189及ERF163表達(dá)，可直接促進(jìn)煙草生物堿的合成[11];研究表明，乙烯同樣是調(diào)控紫草寧合成的一種重要的物質(zhì)[12]。
[0007]ACC合酶(ACC synthetase, ACS)能催化乙烯合成的前體1-氨基環(huán)丙燒_1_羧酸(1-aminocyclopropane-l-carboxylic acid, ACC),最終形成乙烯，是乙烯合成途徑的關(guān)鍵限速酶。通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將紫草本身的ACS基因轉(zhuǎn)入紫草中過(guò)表達(dá)，從而獲得高產(chǎn)藥用天然產(chǎn)物的硬紫草轉(zhuǎn)基因毛狀根株系，在理論上是完全可行的。
[0008]通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得高產(chǎn)藥用天然產(chǎn)物的紫草毛狀根株系，不僅在系統(tǒng)研究紫草藥用天然產(chǎn)物生物合成途徑及其分子調(diào)控機(jī)制方面具有重要的理論意義，并在商業(yè)化生產(chǎn)紫草藥用天然產(chǎn)物方面具有非常重要的應(yīng)用前景和價(jià)值。盡管目前國(guó)內(nèi)外有利用紫草毛狀根合成紫草寧的研究，但并無(wú)將紫草ACS基因轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌，誘導(dǎo)出能高效合成紫草藥用天然產(chǎn)物的紫草轉(zhuǎn)基因毛狀根并提高紫草寧合成的相關(guān)報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明需要解決的問(wèn)題是通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得一個(gè)高產(chǎn)藥用天然產(chǎn)物的硬紫草轉(zhuǎn)基因毛狀根株系，主要是通過(guò)將所選擇的目的基因(硬紫草ACC合酶基因LeACS-1)轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌，然后侵染硬紫草無(wú)菌苗，高效誘導(dǎo)出含目的基因的硬紫草毛狀根，對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因毛狀根擴(kuò)大培養(yǎng)并進(jìn)行分子鑒定和藥用天然產(chǎn)物含量檢測(cè)。
[0010]本發(fā)明的技術(shù)方案包括如下步驟:
[0011](I)硬紫草無(wú)菌苗培養(yǎng):選取飽滿(mǎn)的硬紫草種子，清洗后置于4°C環(huán)境中培養(yǎng)，直至種子發(fā)芽；挑取剛發(fā)芽的種子，用6%的次氯酸鈉消毒后，無(wú)菌水洗干凈；置于MS培養(yǎng)基培養(yǎng)一定數(shù)量的紫草無(wú)菌苗。一個(gè)月后，當(dāng)紫草無(wú)菌苗生長(zhǎng)到一定高度后作為誘導(dǎo)毛狀根的外植體。
[0012](2)轉(zhuǎn)基因侵染菌液制備:高保真酶擴(kuò)增目的基因ACC合成酶LeACS-1，將獲得的目的片段與真核表達(dá)載體PBI121連接，將連接產(chǎn)物用凍融法轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834感受態(tài)細(xì)胞；挑取陽(yáng)性克隆，用YEB液體培養(yǎng)基擴(kuò)增至0D600 = 0.5時(shí)，添加AS(乙酰丁香酮)，作為轉(zhuǎn)基因侵染菌液。
[0013](3)針刺莖節(jié)法誘導(dǎo)硬紫草轉(zhuǎn)基因毛狀根:用接種針蘸上述活化的具有侵染特性的轉(zhuǎn)基因菌液，用針尖穿刺紫草無(wú)菌苗的莖節(jié)處2-3次；將侵染的無(wú)菌苗轉(zhuǎn)移到MS固體培養(yǎng)基上于26°C黑暗培養(yǎng)。10-15天左右即可發(fā)現(xiàn)侵染部位出現(xiàn)白色突起，2天后在侵染部位的白色突起長(zhǎng)出絨毛狀根系，然后長(zhǎng)出一條或多條毛狀根。
[0014](4)硬紫草轉(zhuǎn)基因毛狀根的培養(yǎng):剪取長(zhǎng)度約Icm的毛狀根，轉(zhuǎn)入MS+500mg/L頭孢霉素的固體除菌培養(yǎng)基，再過(guò)一星期轉(zhuǎn)入MS+250mg/L頭孢霉素除菌培養(yǎng)基，直至除去殘留的發(fā)根農(nóng)桿菌；將徹底除菌的毛狀根轉(zhuǎn)入B5固體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)；將固體擴(kuò)大培養(yǎng)的毛狀根轉(zhuǎn)入B5液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)。
[0015](5)轉(zhuǎn)基因毛狀根分子鑒定:分為分子鑒定和熒光鑒定2個(gè)部分。取一定數(shù)量毛狀根，PCR方法檢測(cè)農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒中RolC基因，判斷是否為毛狀根，再檢測(cè)綠色熒光蛋白，驗(yàn)證是否是硬紫草轉(zhuǎn)基因毛狀根。
[0016](6)紫草寧合成及測(cè)定:將鑒定的轉(zhuǎn)基因紫草毛狀根轉(zhuǎn)入M9液體培養(yǎng)基，置于26°C黑暗培養(yǎng)，一周后紫草寧含量即可達(dá)到很高濃度；用石油醚浸泡紫草毛狀根及含有紫草寧的M9液體，提取紫草寧，紫外分光光度計(jì)測(cè)定紫草寧含量，以野生型紫草毛狀根(只用不含外源基因的ATCC15834侵染而獲得的硬紫草毛狀根)為對(duì)照，計(jì)算轉(zhuǎn)基因毛狀根中紫草寧含量變化。
[0017]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其有益效果是:
[0018]如前所述，野生紫草資源的日益匱乏及缺乏真正高效的人工合成紫草寧的培養(yǎng)體系，已經(jīng)成為紫草寧藥用研究及大量商業(yè)化應(yīng)用的一個(gè)制約因素。至今未見(jiàn)通過(guò)毛狀根體系轉(zhuǎn)入LeACS-1外源目的基因來(lái)提高紫草寧合成產(chǎn)量的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本發(fā)明首次將一個(gè)紫草乙烯合成的關(guān)鍵酶基因LeACS-1轉(zhuǎn)入植物表達(dá)載體，將該載體轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌后再轉(zhuǎn)入紫草無(wú)菌苗，高效誘導(dǎo)出紫草轉(zhuǎn)基因毛狀根；獲得的硬紫草轉(zhuǎn)基因毛狀根中紫草寧含量較野生型紫草毛狀根大大提高。該方法可克服紫草愈傷細(xì)胞誘導(dǎo)、培養(yǎng)困難，細(xì)胞易于老化褐化、紫草寧產(chǎn)量不高、產(chǎn)量不穩(wěn)定、夏季不產(chǎn)紫草寧等諸多問(wèn)題；解決了利用愈傷細(xì)胞進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化存在的周期長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化效率偏低等問(wèn)題，轉(zhuǎn)基因毛狀根誘導(dǎo)和繁殖不受外界環(huán)境、季節(jié)和紫草花性等因素制約，大大提高紫草轉(zhuǎn)基因效率；轉(zhuǎn)入的LeACS-1基因有助于紫草乙烯信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制及藥用天然產(chǎn)物合成的分子調(diào)控機(jī)制研究，對(duì)紫草功能基因鑒定和研究及分子育種具有重要指導(dǎo)意義，對(duì)其他轉(zhuǎn)基因困難的木本植物提供了可靠的借鑒方法；獲得的轉(zhuǎn)基因毛狀根紫草寧高產(chǎn)株系具有廣闊的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景和商業(yè)價(jià)值。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1針刺莖節(jié)法誘導(dǎo)出的轉(zhuǎn)LeACS-1基因的硬紫草毛狀根
[0020]圖2轉(zhuǎn)基因毛狀根在B5固體培養(yǎng)基培養(yǎng)
[0021]圖3轉(zhuǎn)基因毛狀根在B5液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)
[0022]圖4轉(zhuǎn)LeACS-1基因硬紫草毛狀根RolC基因檢測(cè)
[0023]圖5轉(zhuǎn)LeACS-1基因硬紫草毛狀根熒光檢測(cè)
[0024]圖6轉(zhuǎn)基因毛狀根在M9固體培養(yǎng)基培養(yǎng)
[0025]圖7轉(zhuǎn)基因毛狀根紫草寧及其衍生物含量測(cè)定及比較

【具體實(shí)施方式】
[0026]實(shí)施例1、轉(zhuǎn)硬紫草LeACS-1基因毛狀根的誘導(dǎo)
[0027](I)硬紫草無(wú)菌苗培養(yǎng):選取飽滿(mǎn)的硬紫草種子，無(wú)菌水清洗后置于4°C環(huán)境中黑暗培養(yǎng)1-2個(gè)月，直至種子發(fā)芽；挑取剛發(fā)芽的種子，清水洗干凈；用6%的次氯酸鈉浸泡5min，再用無(wú)菌水洗幾次；置于MS基本培養(yǎng)基，26°C _28°C光照培養(yǎng)，獲得一定數(shù)量的紫草無(wú)菌苗。一個(gè)月后，當(dāng)紫草無(wú)菌苗生長(zhǎng)到8-lOcm后，作為誘導(dǎo)毛狀根的外植體。
[0028](2)轉(zhuǎn)基因侵染菌液制備:利用將pBI121載體中的GUS基因片段用綠色熒光蛋白eGFP基因片段代替后的改造載體；根據(jù)GenBank公布的紫草LeACS-1序列(GQ246184.1)設(shè)計(jì)引物 ACS-OE-F:5 ' -CATTCTAGAATGGAACATAACAAGAAGCAACACCAACT-3 ' ;ACS-OE-R:5 ' -CATAGATCTTTGAACAAGTGGTGAAGACATTGGAGAAT-3 '，高保真酶擴(kuò)增目的片段；將獲得的目的片段切膠回收，并與pBI121-eGFP載體連接，構(gòu)建pBI121-LeACS-l-eGFP質(zhì)粒；將PBI121-LeACS-l-eGFP質(zhì)粒用凍融法轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834感受態(tài)細(xì)胞；挑取陽(yáng)性克隆，轉(zhuǎn)入YEB液體培養(yǎng)基，在26-28 °C，180rpm的搖床中擴(kuò)增至0D600 = 0.5時(shí)，添加200 μ L/L的AS，作為轉(zhuǎn)基因侵染菌液。
[0029](3)針刺莖節(jié)法誘導(dǎo)硬紫草轉(zhuǎn)基因毛狀根:用接種針蘸上述活化的具有侵染特性的轉(zhuǎn)基因菌液，用針尖穿刺紫草無(wú)菌苗的莖節(jié)處，針尖每浸蘸菌液一次，刺莖節(jié)處一下，每株共穿刺2-3次；將侵染的無(wú)菌苗轉(zhuǎn)移到MS固體培養(yǎng)基上于26°C黑暗培養(yǎng)。10-15天左右即可發(fā)現(xiàn)侵染部位出現(xiàn)白色突起，2天后在侵染部位的白色突起長(zhǎng)出絨毛狀根系，然后長(zhǎng)出一條或多條毛狀根(圖1);以不含外源基因的野生型ATCC15834菌液按照上述相同方法，誘導(dǎo)出紫草野生型毛狀根，作為對(duì)照材料。
[0030]實(shí)施例2、轉(zhuǎn)硬紫草LeACS-1基因毛狀根的培養(yǎng)
[0031](I)毛狀根除菌培養(yǎng):誘導(dǎo)出來(lái)的毛狀根經(jīng)過(guò)一星期的生長(zhǎng)，剪取長(zhǎng)度約Icm的毛狀根，轉(zhuǎn)入MS+500mg/L頭孢霉素的固體除菌培養(yǎng)基，再過(guò)一星期轉(zhuǎn)入MS+250mg/L頭孢霉素，直至除去殘留的發(fā)根農(nóng)桿菌；將徹底除菌的毛狀根轉(zhuǎn)入B5固體培養(yǎng)基培養(yǎng)(圖2);
[0032](2)毛狀根擴(kuò)大培養(yǎng):將固體擴(kuò)大培養(yǎng)的毛狀根轉(zhuǎn)入B5液體培養(yǎng)基，10rpm的搖床中光照擴(kuò)大培養(yǎng)(圖3)。
[0033]實(shí)施例3、轉(zhuǎn)硬紫草LeACS-1基因毛狀根的鑒定
[0034]分為分子檢測(cè)和熒光檢測(cè)2個(gè)部分。取一定數(shù)量毛狀根，CTAB法提取毛狀根 DNA 為模板，設(shè)計(jì)引物 rolc-F:5’ -ACAAGCCACTTCTGTTTCCC-3，；rolC-R:5’ -CAGCGACTGCAACCAGTTTA-3’，用PCR方法擴(kuò)增，以硬紫草基因組DNA為對(duì)照，擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序比對(duì)，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因毛狀根中農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒中RolC基因存在與否，隨機(jī)選取的3個(gè)擴(kuò)大培養(yǎng)硬紫草毛狀根株系，均檢測(cè)到RolC基因的存在(圖4)，說(shuō)明獲得的均為毛狀根；同時(shí)上述株系中長(zhǎng)度約2-3_的毛狀根，制作成切片，用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)熒光，結(jié)果顯示均檢測(cè)到熒光(圖5)，表明所擴(kuò)大培養(yǎng)的紫草毛狀根均為轉(zhuǎn)基因毛狀根。
[0035]實(shí)施例4、轉(zhuǎn)硬紫草LeACS-1基因毛狀根紫草寧含量測(cè)定
[0036](I)將驗(yàn)證為轉(zhuǎn)入目的基因的轉(zhuǎn)基因硬紫草毛狀根及野生型毛狀根轉(zhuǎn)入M9液體培養(yǎng)基，置于26°C、100rpm的搖床中黑暗培養(yǎng)，一周后紫草寧含量即可達(dá)到很高濃度(圖6)；
[0037](2)用石油醚浸泡紫草毛狀根及含有紫草寧的M9液體，提取紫草寧，紫外分光光度計(jì)測(cè)定紫草寧含量，以野生型紫草毛狀根為對(duì)照，計(jì)算轉(zhuǎn)基因毛狀根中紫草寧含量變化(圖7)。紫草寧含量總量包括紫草細(xì)胞或毛狀根和分泌到M9培養(yǎng)基中的紫草寧含量總和。具體方法如下:稱(chēng)取在M9培養(yǎng)體系中的毛狀根，并取一定量的含有分泌的紫草寧的M9培養(yǎng)基，用石油醚浸泡，反復(fù)提取紫草寧，直到提取液無(wú)色，合并提取液，紫外分光光度計(jì)測(cè)定0D520的吸光值，由下列方程得到紫草寧含量:紫草寧含量(mg/gFW) = 41.66X0D520X稀釋倍數(shù)。
[0038](3)紫草寧含量測(cè)定顯示，所得到的這一個(gè)轉(zhuǎn)LeACS-1基因的硬紫草毛狀根中紫草寧含量比野生型毛狀根中的含量提高2.73倍，而且該株系具有生長(zhǎng)速度快、繁殖容易的特點(diǎn)，適于商業(yè)化生產(chǎn)所用，命名為L(zhǎng)eACS-1-1ine-001。
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【權(quán)利要求】
1.一個(gè)高產(chǎn)藥用天然產(chǎn)物(紫草寧及其衍生物)的硬紫草轉(zhuǎn)LeACS-1基因毛狀根株系ο
2.權(quán)利要求1中所述的硬紫草轉(zhuǎn)基因高產(chǎn)株系的商業(yè)化應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK104278050SQ201310286872
【公開(kāi)日】2015年1月14日 申請(qǐng)日期:2013年7月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月10日
【發(fā)明者】戚金亮, 楊永華, 方榮俊, 劉靜, 趙胡, 趙華, 黃守程, 王小明, 楊榮武, 陸桂華 申請(qǐng)人:南京大學(xué)