專利名稱：在植物中表達蛋白質(zhì)的制作方法
在植物中表達蛋白質(zhì)本發(fā)明是國際申請?zhí)朠CT/ZA2006/000063，國際申請日為2006年5月2日，進入中國國家階段日期為2007年10月26日，中國國家申請?zhí)枮?00680014202. 5，發(fā)明名稱為“在植物中表達蛋白質(zhì)”的分案申請。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及在植物中表達蛋白。特別地，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因蛋白表達和高產(chǎn)量蛋白生產(chǎn)的細胞內(nèi)定位的方法。本發(fā)明還涉及在植物中生產(chǎn)人乳頭瘤病毒(HPV)蛋白和/或流感病毒H5蛋白。本發(fā)明還涉及評估蛋白在植物內(nèi)表達的快速機制。應(yīng)用轉(zhuǎn)基因植物進行異源蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)正逐漸獲得廣泛的接受，并且可能成為疫苗蛋白節(jié)約成本生產(chǎn)的平臺。產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物研究一大類蛋白和/或表達載體的表達特征并不總是可行的，原因在于這一程序費時的本質(zhì)。相反，瞬時表達系統(tǒng)能夠快速評估各種不同的蛋白在各種植物物種中的蛋白表達。關(guān)于應(yīng)用轉(zhuǎn)基因植物進行大規(guī)模蛋白生產(chǎn)的另一個問題通常是生產(chǎn)的異源蛋白的令人失望的低水平。植物質(zhì)體，特別是葉綠體，已經(jīng)成功地被表達異源蛋白的重組載體轉(zhuǎn)化，以顯著地增加植物中由每份總可溶蛋白所產(chǎn)生的蛋白水平(參見，例如，W02005/011367和W02004/005467A2)。質(zhì)體還能夠輸入各種分子，包括蛋白。存在不同的方法，通過這些方法發(fā)生分子輸入，一個這樣的方法涉及與質(zhì)體的類囊體膜相互作用。異源蛋白靶向質(zhì)體是一種顯著增加蛋白在植物細胞內(nèi)的積聚的機制。許多年來一直應(yīng)用農(nóng)桿菌(Agrobacterium)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移來產(chǎn)生穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化植物。這種方法包括將T-復(fù)合物(一種由農(nóng)桿菌T-DNA和毒力基因產(chǎn)物形成的復(fù)合物)從農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)移到植物細胞(Zupan等.，2000)。將位于限定單鏈T-DNA的25bp同向重復(fù)序列(左和右邊界)之間的任何DNA轉(zhuǎn)運到植物細胞核中(Zupan等.，2000)，在這里它通過不正常重組而整合到植物染色體上(Somers和Makarevitch, 2004)。在所述核內(nèi)存在的許多T-DNA拷貝沒有結(jié)合，但是得到轉(zhuǎn)錄，這引起瞬時表達。瞬時表達不受位置效應(yīng)的影響，并且可以產(chǎn)生比穩(wěn)定轉(zhuǎn)化顯著更高的外源蛋白水平(Kapila等.，1997)。通常應(yīng)用兩種農(nóng)桿菌侵入(農(nóng)桿菌侵入法)方法注射和真空侵入。農(nóng)桿菌注射包括直接注射到葉片的遠軸氣室，而葉片仍然附著在植物上(Voinnet等.，2003)。在真空侵入過程中，對農(nóng)桿菌混懸液應(yīng)用真空，葉片浸沒在所述混懸液中(Kapila等.，1997)。盡管通常只在少數(shù)葉片上進行，但是這一技術(shù)可以規(guī)模化Medicago Inc. (Quebec, Canada)的研究者每周能夠進行農(nóng)桿菌侵入多達7500片苜蓿葉片，并且Stefan Schillberg及同事(Institute for Molecular Biotechnology,RffTH Aachen,Germany)已經(jīng)進行了農(nóng)桿菌侵入了多達100kg的煙草葉片(Twyman 2004)。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達在侵入后60到72小時達到最大,然后由于轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)而迅速下降(Voinnet等.，2003)。PTGS或RNA干擾是一種適應(yīng)性抗病毒抵御反應(yīng)，其限制病毒在植物中 的復(fù)制和傳播。這一過程包括在胞質(zhì)中識別靶點RNA和起始序列-特異性RNA降解途徑(Voinnet，2001)。某些植物病毒編碼具有抑制PTGS能力的沉默阻抑制子。這些沉默抑制蛋白中的一些，諸如番茄斑萎病毒(TSWV)的NSs (Takeda等，2002)，和番爺叢矮病毒的pl9 (Voinnet等.，2003)已經(jīng)用來延長和擴增農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達，其通過包含沉默抑制基因的農(nóng)桿菌的共同侵入而進行。對于將商購蛋白在植物中的表達優(yōu)化以達到使植物成為可行平臺的水平存在需求。具體地，存在對于在植物中生產(chǎn)HPV蛋白和/或流感病毒H5蛋白的方法的需求。還存在對載體、轉(zhuǎn)基因植物或其部分和這樣的植物的子代的需求以實現(xiàn)如前文所述的需要。發(fā)明概述按照本發(fā)明的第一方面，提供一種在植物中生產(chǎn)HPV多肽和/或流感病毒H5多肽的方法，其包括步驟1.將HPV基因和/或流感病毒H5基因或編碼它們的功能等價物的核酸克隆到適于靶向植物中存在的成分的載體中；2.用所述載體侵入至少植物的部分，或者用所述載體轉(zhuǎn)化植物組織，以瞬時表達HPV多肽和/或流感病毒H5多肽，和/或產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物；和3.回收由植 物表達的HPV多肽和/或流感病毒H5多肽。術(shù)語‘植物’意欲包括缺少專門的感覺器官和自主運動能力的所有生命有機體。同樣地，所述定義包括單子葉植物和雙子葉植物以及所有的光合生物。術(shù)語‘HPV多肽’意欲包括HPV LI蛋白；與另一 HPV抗原肽融合的嵌合HPV LI肽；與衍生于任何抗原表位、B細胞或T細胞特異性的異源肽融合的嵌合HPV LI肽以及HPVL2蛋白或它們的功能等價物。已作必要的修正，同樣的意思適用于術(shù)語‘HPV基因’。術(shù)語‘植物成分’意欲包括質(zhì)體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細胞質(zhì)和質(zhì)外體。優(yōu)選地所述植物成分是質(zhì)體。靶向意指載體中可以包含靶向序列。這樣的靶向序列可被翻譯成肽，所述肽將載體或其產(chǎn)物導(dǎo)向植物中需要的成分，諸如質(zhì)體。按照本發(fā)明的載體優(yōu)選地包括可操作性地連接到編碼序列上的啟動子和其它必需調(diào)節(jié)子，諸如終止子等。應(yīng)該理解用載體侵入植物的至少一部分可以引起蛋白的瞬時表達，并且用載體轉(zhuǎn)化植物組織以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物可以引起蛋白的轉(zhuǎn)基因表達，意欲這兩種形式的表達都屬于本申請的范圍。在本說明書中，提及蛋白、肽或基因或它們的功能等價物包括提及其變體，所述變體能夠很大程度上行使與蛋白、肽、多肽或基因相同的功能。優(yōu)選地，本發(fā)明涉及HPV-16L1蛋白的生產(chǎn)；與另一 HPV抗原肽融合的嵌合HPV LI肽；與衍生于任何抗原表位、B細胞或T細胞特異性的異源肽融合的嵌合HPV LI肽；HPV L2蛋白；或流感病毒H5蛋白。優(yōu)選地，所述載體是二元載體，更優(yōu)選地為根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens) 二兀載體。所述載體可以適于靶向質(zhì)體，其通過使得所表達的多肽包括能夠與質(zhì)體的類囊體膜特別是類囊體膜的轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)相互作用的部分而進行。這一相互作用可以使得多肽從其所表達的細胞質(zhì)輸入到質(zhì)體中。輸入到細胞質(zhì)的機制對于蛋白的正確折疊可能是重要的。然而，應(yīng)該理解所述載體可以適于靶向要轉(zhuǎn)化的質(zhì)體本身，并且多肽的表達可以完全在質(zhì)體內(nèi)發(fā)生。
不希望受到理論局限，本申請人認為進入到質(zhì)體的多肽以其一級結(jié)構(gòu)進入，并且在質(zhì)體內(nèi)進行折疊成其二級和三級結(jié)構(gòu)，即，遠離細胞的細胞質(zhì)。同樣地，本申請人認為通過載體表達多肽可以發(fā)生在質(zhì)體內(nèi)，然后在其中它采用其二級和三級結(jié)構(gòu)是發(fā)明原理的合理外延。換句話說，本申請人認為發(fā)明原理延伸到質(zhì)體的轉(zhuǎn)化。在這樣的條件下，蛋白的表達完全發(fā)生在質(zhì)體內(nèi)，并且不與細胞的細胞質(zhì)接觸。優(yōu)選地，所述HPV LI基因；與另一 HPV抗原基因融合的嵌合的HPVLl基因；與衍生于任何抗原表位、B細胞或T細胞特異性的異源基因融合的嵌合HPV LI基因；HPV L2基因；或流感病毒H5基因是優(yōu)化的基因，例如，人密碼子優(yōu)化的，BCG密碼子優(yōu)化的或植物密碼子優(yōu)化的。HPV LI基因或HPV LI嵌合體的基因還可以以另一種方式修飾，例如，核定位信號缺失。按照本發(fā)明的方法還可以包括用抑制蛋白共同侵入植物的步驟，所述抑制蛋白適于抑制植物中的轉(zhuǎn)錄后基因沉默。優(yōu)選地所述抑制蛋白是番茄斑萎病毒的NSs蛋白或番茄叢矮病毒的pl9。最優(yōu)選地所述抑制蛋白是NSs。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所述質(zhì)體選自葉綠體、色質(zhì)體和白色體。所述質(zhì)體優(yōu)選地是葉綠體。侵入可以通過直接注射或通過真空進行。按照本發(fā)明的一個方面，完整植物可以進行真空侵入。在本說明書中，‘完整植物’應(yīng)該認為包括這樣的植物，即，去除根的植物以及部分落葉的植物和很大程度上完整的植物。提及植物應(yīng)該包括提及植物部分，其包括但不限于種子、葉片、根、莖、花、果實、胚、分生組織、下胚軸、上胚軸、子葉、花粉和組織。在按照本發(fā)明的方法中，植物的侵入和轉(zhuǎn)化可以用被轉(zhuǎn)化接受了所述載體的根癌農(nóng)桿囷來完成。植物還可以選自Nicotiana benthamiana和煙草(N. tabacum)。然而，應(yīng)該理解支持瞬時蛋白表達或者被轉(zhuǎn)基因的任何植物應(yīng)該都適用于本發(fā)明的目的。侵入優(yōu)選地在植物葉片上進行。直接注射侵入優(yōu)選地在葉片的遠軸區(qū)域進行。按照本發(fā)明的第二方面，提供在植物中生產(chǎn)HPV多肽和/或流感病毒H5多肽的方法，其中基本上通過真空侵入方法用適當?shù)妮d體侵入完整的植物。按照本發(fā)明的第三方面，提供HPV多肽和/或流感病毒H5多肽，其按照上述方法隨時產(chǎn)生。按照本發(fā)明的第四方面，提供其中已經(jīng)克隆了 HPV基因和/或流感病毒H5基因的載體的應(yīng)用，所述載體適于靶向植物中存在的成分，以產(chǎn)生能夠表達HPV多肽和/或流感病毒H5多肽的轉(zhuǎn)基因植物。按照本發(fā)明的第五方面，提供其中已經(jīng)克隆了 HPV基因和/或流感病毒H5基因的載體，所述載體適于靶向植物中存在的成分，以產(chǎn)生能夠表達HPV多肽和/或流感病毒H5多肽的轉(zhuǎn)基因植物。按照本發(fā)明的第六方面，提供預(yù)防性或治療性疫苗，其由能夠在適當宿主內(nèi)誘導(dǎo)免疫原性反應(yīng)的由上文所述的方法隨時產(chǎn)生的HPV多肽或流感病毒H5多肽組成。按照本發(fā)明的第七方面，提供一種轉(zhuǎn)基因植物，其部分或其子代，其包含能夠表達HPV多肽和/或流感病毒H5多肽的細胞。在本發(fā)明的這些后續(xù)方面中，已經(jīng)做了必要的修正，應(yīng)用第一方面的選擇和優(yōu)選。
對于將商購蛋白在植物中的表達優(yōu)化以達到使植物成為可行平臺的水平存在需求。一個實例是生產(chǎn)HPV LI主要衣殼蛋白，作為用于人疫苗或試劑目的的病毒殼粒和/或作為病毒樣顆粒(VLPs)。通過按照本發(fā)明的教導(dǎo)，通過農(nóng)桿菌侵入法進行瞬時表達可以比較許多抗原性蛋白的表達，以及植物細胞區(qū)室靶向蛋白的效果。所述方法包括通過直接注射或者通過在浸沒或浸泡在農(nóng)桿菌培養(yǎng)物中的葉片上產(chǎn)生真空，而將攜帶表達載體的根癌農(nóng)桿菌重組子侵入到植物中。人密碼子優(yōu)化的或BCG密碼子優(yōu)化的HPV LI以比其它LI序列顯著更高的水平進行表達，并且人密碼子優(yōu)化作用還導(dǎo)致流感H5蛋白的高表達。葉綠體靶向?qū)е卤燃毎|(zhì)或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)-靶向顯著更高的積聚。HPV LI完整植物提取物的電子顯微鏡檢揭示LI在植物中組裝成病毒樣顆粒(VLPs)。產(chǎn)生的蛋白還與適當?shù)腍PV L1-特異性單克隆抗體(MAbs)反應(yīng)，所述單克隆抗體識別構(gòu)象-特異的表位。通過在植物中瞬時表達獲得的LI在小鼠中誘導(dǎo)了高水平的L1-特異性抗體，并且發(fā)現(xiàn)在體外中和檢測中這些抗體被中和。在植物葉綠體中促進高瞬時LI表達的表達載體用來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，所示轉(zhuǎn)基因植物還表達如上文所述的高水平的其它多肽。農(nóng)桿菌真空侵入典型地包括從莖上去除的葉片的侵入。本發(fā)明描述了完整植物或完整的無根植物的新型真空侵入。具有小根系的完整植物可以從土壤中移出，被侵入并且重新植入，而不喪失活力。大根系可以移出，植物被侵入，然后重新植入種植泡沫中培養(yǎng)至少3天而不喪失活力。具有復(fù)雜根系的植物還可以水栽生長，這允許不移出根進行侵入。侵入方法之后，完整植物比松散葉片更容易培育，并且它們存活更長，因此增加外源基因的表達。侵入完整植物的優(yōu)點在于可能通過瞬時表達將外源蛋白生產(chǎn)規(guī)?；缴虡I(yè)可行的水平。
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本發(fā)明還教導(dǎo)了通過農(nóng)桿菌侵入法或者在轉(zhuǎn)基因植物中HPV LI蛋白靶向特定的植物細胞亞區(qū)室(ER和葉綠體)。與ER-靶向和細胞質(zhì)積聚相比，葉綠體靶向顯著增加了LI的積聚。葉綠體積聚可以通過細胞質(zhì)中存在的蛋白酶而防止LI蛋白降解，和/或允許其積聚到更高的濃度，而并不影響植物細胞的功能。如上文所述，同樣的考慮也適用于其它多肽。
實施例現(xiàn)在將參考下述非限制性實施例對本發(fā)明進行描述。實施例1高水平表汰HPV LI蛋白表汰構(gòu)津體3 個農(nóng)桿菌載體pTRAc, pTRAkc-rbcsl-cTP 和 pTRAkc_ERH(


圖1)從 RainerFischer (Fraunhofer Institute, Aachen,德國)獲得。pTRAc載體由下列各項組成花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動子(P35SS)，重復(fù)轉(zhuǎn)錄增強子，查耳酮合酶5'未翻譯區(qū)(CHS)和CaMV 35S多腺苷酸化信號(pA35S)用于外源基因表達；用于煙草RB7基因的2個支架附著區(qū)(SAR);用于T-DNA整合的左和右邊界；用于大腸桿菌(E.coli)和根癌農(nóng)桿菌的復(fù)制起點；以及用于抗生素選擇的bla基因。pTRAkc-rbcsl-cTP是pTRAc的衍生物，具有附加的rbcs-cTP序列(來自爺屬(Solanum)核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亞基的葉綠體革巴向信號)，與外源基因形成3'融合。pTRAkc-ERH也是pTRAc的衍生物，并且包括KDEL和his6序列，與外源基因形成5'融合。pTRAkc-rbcsl-cTP和pTRAkc-ERH載體還包括nptll基因，用于在植物中的卡那霉素抗性。將4種HPV-16L1基因變體克隆到上文提及的農(nóng)桿菌載體中(I)南非分離體，SALl (GenBank登記號AY177679)；⑵人密碼子優(yōu)化的LI (HLl，圖2) ； (3)植物密碼子優(yōu)化的LI (SYNL1,圖3)，和(4)核定位信號缺陷，HLl的22個氨基酸平截物，HLl Δ C22。為了促進定向克隆，通過PCR擴增將限制酶位點添加到LI基因的終點。SALl用有義引物5 ' -GGACGCGTTAGGTACATGTCTCTTTGGCTGCCT (SEQ.1D NO.1)和反義引物5' -TCTAGACTCGAGTTACAGCTT ACGTTTTTTGCGTTT(SEQ.1D NO. 2)進行擴增，用 AfI III 和Xho I消化，并且克隆到pTRAc的相同位點，形成pTRA-SALl ;或者用Mlu I和Xho I消化，并且克隆到pTRAkc-rbcsl-cTP的相同位點，形成pTRACTP-SALl。SALl也用上述有義引物和反義引物5' -AGCGGCCGC CAGCTTACGTTTTTTGCG(SEQ.1D NO. 3)進行擴增，用 AfI III 和Not I消化，并且克隆到pTRAkc-ERH的Nco I和Not I位點，形成pTRAERH-SALl。SYNLl 用有義引物5' -GGACGCGTGA GATTCATGAGCCTTTGGCTC CCT(SEQ.1D NO. 4)和反義引物5' -ATCTAGACTCGAGTTAGAGCTTCCTCTTCTTCCTCTT(SEQ.1D NO. 5)進行擴增，用Bsp HI和Xho I消化，并且克隆到pTRAc的Afl III和Xho I位點，形成pTRA-SYNLl ;或者用Mlu I和Xho I消化，并且克隆到pTRAkc-rbcsl-cTP的相同位點，形成pTRACTP-SYNLl。SYNLl 還用上述有義引物和反義引物5' -AGCGGCCGCGAGCTTCCTCTTCTTCCTCTT(SEQ.1DNO. 6)進行擴增，用Bsp HI和Not I消化，并且克隆到pTRAkc-ERH的Nco I和Not I位點，形成 pTRAERH-SYNLl。HLl 用有義引物5' -GGACGCGTGAGGTTCATGAGCCTGTGGCTGCCC(SEQ.1D NO. 7)和反義引物5' -ATCTAGACTCGAGTCACAGCTTGCGCTTCT TCCG(SEQ.1D NO. 8)進行擴增，用 Bsp HI和Xho I消化，并且克隆到 pTRAc的Afl III和Xho I位點，形成pTRA_HLl ;或者用MluI和Xho I消化，并且克隆到pTRAkc-rbcsl-cTP的相同位點中，形成pTRACTP-HLUHLl還用上述有義引物和反義引物5' -AGCGGCCGCCAGCTTGCGCTTCTTCCGC(SEQ.1D NO. 9)進行擴增，用Bsp HI和Not I消化，并且克隆到pTRAkc-ERH的Nco I和Not I位點，形成pTRAERH-HLl。HLl Λ C22通過PCR擴增HLl形成，其使用上述有義引物和反義引物5' TCTAGACTCG AGTCAGCCCA GGGTGAACTT AGG(SEQ.1D NO. 10)進行，以促進在 NLS 之前終止(Zhou等· 1991)。將PCR產(chǎn)物用Mlu I和Xho I消化，并且克隆到pTRAkc-rbcsl-cTP的相同位點，形成pTRACTP-HLl Δ C22。使用有義引物5' GGACGCGTT A GGTCCATGGCTAGCAAAGGAGAAG(SEQ.1D NO. 11)和反義引物5 ' ATCTAGATTATTTGTAGAGCTCATCCATG(SEQ.1D NO. 12)從pBSG1057(BiosourceTechnologies Inc, Vacaville, USA)擴增 30B-GFPC3 突變體(GeneBank登記號U62637) gfp基因，用Nco I和XbaI消化，并且克隆到pTRAc的相同位點，形成 pTRA-GFP。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化按照(Shen和 Forde，1989)所述，將農(nóng)桿菌 GV3101: :pMP90RK(從 RainerFischer, fraunhofer Institute, Aachen 獲得)制成電感受:態(tài)。將 50-200ng 上述 HPV-16 LI/農(nóng)桿菌載體與100 μ I電感受態(tài)細胞混合在O.1cm電隙杯(BioRad)中。將所述細胞在 設(shè)定為1. 8kV, 25 μ F 和 200 Ω 的 GenePulser (BioRad)中進行轉(zhuǎn)化。

在涂布到含有50μ g · ml—1羧芐西林，50 μ g · ml-1利福平和30 · ml-1卡那霉素的 LB上之前，將電穿孔的細胞在Iml LB中培養(yǎng)2小時。通過從重組農(nóng)桿菌菌落分離質(zhì)粒DNA， 并且將質(zhì)粒DNA重新轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α細胞中，并且在100 μ g/ml氨芐青霉素上選擇 而驗證陽性克隆。表A.使用的農(nóng)桿菌重組子的總結(jié)

權(quán)利要求
1.在植物中生產(chǎn)流感病毒H5多肽的方法，所述方法包括下列步驟 i)將流感病毒H5基因或編碼其功能等價物的核酸克隆到適于靶向植物中存在的組分的載體中，其中所述植物組分選自由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和質(zhì)外體組成的組； )用所述載體侵入所述植物的至少一部分，或者用所述載體轉(zhuǎn)化植物組織，從而瞬時表達所述流感病毒H5多肽，和/或產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物；和 iii)回收由所述植物表達的流感病毒H5多肽。
2.權(quán)利要求1的方法，其中一個或多個靶向序列包含于所述載體中，所述靶向序列編碼將所述流感病毒H5多肽從細胞質(zhì)導(dǎo)向所述植物組分的多肽。
3.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的方法，其中所述載體包括可操作地與所述載體的編碼序列連接的啟動子和其它調(diào)節(jié)子等。
4.前述權(quán)利要求任一項的方法，其中所述載體是二元載體，優(yōu)選根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens) 二兀載體。
5.前述權(quán)利要求任一項的方法，其中所述流感病毒H5基因是密碼子使用優(yōu)化的基因，優(yōu)選人密碼子使用優(yōu)化的基因、BCG密碼子使用優(yōu)化的基因或植物密碼子使用優(yōu)化的基因。
6.前述權(quán)利要求任一項的方法，其還包括用在植物中適于抑制轉(zhuǎn)錄后基因沉默的抑制蛋白共同侵入所述植物的步驟，所述抑制蛋白如番茄斑萎病毒的NSs蛋白或番茄叢矮病毒的 P19。
7.前述權(quán)利要求任一項的方法，其中所述侵入通過直接注射或通過真空進行。
8.前述權(quán)利要求任一項的方法，其中所述植物的侵入和/或轉(zhuǎn)化用根癌農(nóng)桿菌完成，所述根癌農(nóng)桿菌已經(jīng)被轉(zhuǎn)化接受了所述載體。
9.前述權(quán)利要求任一項的方法,其中所述植物選自Nicotianabenthamiana和煙草(N. tabacum)。
10.前述權(quán)利要求任一項的方法，其中所述流感病毒H5基因或編碼其功能等價物的核酸選自
圖10和11所示的序列。
11.前述權(quán)利要求任一項的方法，其中所述侵入是在所述植物葉片上進行的，優(yōu)選其中所述侵入是通過在所述葉片的遠軸區(qū)上直接注射進行的。
12.權(quán)利要求1-10任一項的方法，其中基本上將完整的植物通過真空侵入方式用適當?shù)妮d體侵入。
13.已經(jīng)在其中克隆了流感病毒H5基因的載體的應(yīng)用，所述載體適于靶向植物中存在的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和質(zhì)外體組分，從而在細胞質(zhì)中瞬時表達所述流感病毒H5多肽，然后將所述流感病毒H5多肽輸入到所述植物組分中，和/或產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，在所述轉(zhuǎn)基因植物中，所述流感病毒H5多肽在細胞質(zhì)中表達，然后被輸入到所述植物組分中。
14.已經(jīng)在其中克隆了流感病毒H5基因的載體，所述載體適于靶向植物中存在的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和質(zhì)外體組分，從而在細胞質(zhì)中瞬時表達所述流感病毒H5多肽，然后將所述流感病毒H5多肽輸入到所述植物組分中，和/或產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，在所述轉(zhuǎn)基因植物中，所述流感病毒H5多肽在細胞質(zhì)中表達，然后被輸入到所述植物組分中。
15.權(quán)利要求1-13任一項的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物、其部分或其子代，其包含能夠表達流感病毒H5多肽的細胞。
全文摘要
在植物中表達蛋白質(zhì)本發(fā)明涉及在植物中生產(chǎn)流感病毒H5多肽的方法，所述方法包括下列步驟將流感H5基因或編碼其功能等價物的核酸克隆到適于靶向植物中存在的組分的載體中，用所述載體侵入植物的至少一部分，或者用所述載體轉(zhuǎn)化植物組織，以瞬時表達所述流感病毒H5多肽和/或產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物；和回收由所述植物表達的流感病毒H5多肽。本發(fā)明還涉及在所述方法中使用的或者作為所述方法的結(jié)果產(chǎn)生的載體、轉(zhuǎn)基因植物或其部分和這樣的植物的子代。
文檔編號A01H5/00GK103031310SQ20121048832
公開日2013年4月10日 申請日期2006年5月2日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月29日
發(fā)明者安娜-莉澤·威廉森, 愛德華·彼德·雷比茨基, 詹姆斯·馬爾科姆·麥克萊恩, 因加·伊莎貝爾·貝克爾-希策爾奧特 申請人:開普敦大學(xué)