專利名稱：Ubc13蛋白質(zhì)作為植物內(nèi)參蛋白的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地涉及Ubcl3蛋白質(zhì)作為植物內(nèi)參蛋白的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)泛素化是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾過程，這一過程參與調(diào)控蛋白質(zhì)的功能及命運。泛素是一種76個氨基酸組成的小的修飾蛋白，它可以以個體形式或者以泛素聚合物的形式被連接到另一個泛素或者目標(biāo)蛋白的賴氨酸殘基上，前一種修飾形式稱為單泛素化而后一種稱為多聚泛素化。泛素表面含有幾個可以用來連接其它泛素從而形成多聚泛素鏈的賴氨酸殘基。不同的多聚泛素連接模式修飾的目的蛋白被賦以不同的功能，這些功能涉及的很廣，從調(diào)控被修飾蛋白質(zhì)的降解到改變它們參與的生物學(xué)途徑。Ubcl3 (又稱作UBE2N)是一種泛素連接酶(E2)，并且是迄今為止唯一已知的催化泛素第63位賴氨酸連接多聚泛素化鏈形成的泛素連接酶。Ubcl3通常需要與Mms2或者UevlA形成一個異源二聚體來行使其多聚泛素連接酶的功能。在動物細(xì)胞中，Ubcl3/Mms2和Ubcl3/UevlA兩種異源二聚體分別以不同的模式催化目標(biāo)蛋白的泛素化從而介導(dǎo)多種不同的信號通路，這些通路包括DNA損傷修復(fù)，p53和細(xì)胞周期檢驗點調(diào)控，細(xì)胞周期，炎癥反應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，骨髓生成， 免疫受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及細(xì)胞內(nèi)吞。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是Ubcl3蛋白質(zhì)作為植物內(nèi)參蛋白的應(yīng)用。
進(jìn)而,本發(fā)明的再一目的是提供人類Ubcl3蛋白質(zhì)單克隆抗體4E11在western雜交檢測中識別植物中的Ubc 13蛋白質(zhì)的應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案，所述植物Ubcl3蛋白可以為申請日之前所有已知的植物源Ubcl3蛋白質(zhì)，例如其氨基酸序列如SEQ ID No. I所示。MANSNLPRRI IKETQRLLSE PAPGISASPS EDNMRYFNVM ILGPTQSPYE GRGVFKLELF 60LPEEYPMAAP KVRFLTKIYH PNIDKLGRIC LDILKDKffSP ALQIRTVLLS IQALLSAPNP 120DDPLSENIAK HffKSNEAEAV DTAKEffTRLY ASGA 154
本發(fā)明使用的人類Ubcl3蛋白質(zhì)單克隆抗體4E11可以購自英俊(invitrogen)公司，商品名稱Mouse anti_Ubcl3,貨號37_1100。
根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式
，利用人類Ubcl3蛋白質(zhì)單克隆抗體(4E11)對擬南芥(哥倫比亞O型)組織全蛋白提取物以及水稻(日本晴)組織全蛋白提取物中的Ubcl3蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測。首先提取擬南芥(哥倫比亞O型)和水稻(日本晴)全組織總蛋白，然后通過 SDS-PAGE電泳對兩種全蛋白進(jìn)行分離并且通過western雜交技術(shù)利用人類Ubc 13蛋白質(zhì)單克隆抗體對兩種蛋白樣本中的Ubcl3蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測。
人類Ubcl3蛋白質(zhì)單克隆抗體4E11是一種可以作為植物western雜交內(nèi)參的蛋白質(zhì)。擬南芥是一種被作為模式植物而廣泛地應(yīng)用到植物生物學(xué)研究中的小型的開花植物。擬南芥屬于雙子葉十字花科植物，同一科的成員還有卷心菜以及蘿卜等。擬南芥雖然不是農(nóng)作物，但是因為自身的重要優(yōu)勢為遺傳學(xué)以及分子生物學(xué)的領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究提供了重要幫助。同樣作為模式植物，水稻雖然生長周期較擬南芥要長，種植環(huán)境也比較復(fù)雜，但水稻的種子——大米，作為當(dāng)前世界主要的農(nóng)作物，在作物產(chǎn)量及品質(zhì)等方面的研究價值是擬南芥所不能比擬的。水稻屬于一年生單子葉草本植物，從生長特點到生理結(jié)構(gòu)等與擬南芥所代表的雙子葉植物也存在一定的區(qū)別。因此，水稻也成為了人們研究植物生理學(xué)以及分子細(xì)胞生物學(xué)的重要模式植物。
本發(fā)明通過對擬南芥以及水稻的表達(dá)芯片數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，發(fā)現(xiàn)Ubcl3基因在擬南芥和水稻中穩(wěn)定高表達(dá)。同時本發(fā)明還通過了 western雜交,在以考馬斯亮藍(lán)染色蛋白樣本為參照的情況下，利用人類Ubcl3蛋白質(zhì)單克隆抗體，對不同信號處理的水稻總蛋白樣本中Ubcl3表達(dá)量進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)Ubcl3的蛋白水平在不同處理的樣本間保持著很好的一致性。
本發(fā)明利用人類Ubcl3蛋白質(zhì)單克隆抗體(4E11)可以很好地在western雜交檢測中識別植物中的Ubcl3蛋白質(zhì)。并且由于Ubcl3蛋白質(zhì)在植物中具有看家基因的特點， 人類Ubcl3蛋白質(zhì)單克隆抗體(4E11)可以作為不同植物中通用的western雜交內(nèi)參識別抗體。這是第一個可以作為跨植物western雜交內(nèi)參蛋白識別的單克隆抗體。


圖I人類Ubcl3蛋白質(zhì)單克隆抗體4E11識別擬南芥(哥倫比亞O型)總蛋白以及水稻(日本晴)總蛋白中的Ubcl3蛋白，圖中I和2泳道標(biāo)注的分別為擬南芥幼苗時期全組織和成年植株葉片組織總蛋白，3和4泳道標(biāo)注的分別為水稻萌發(fā)時期全組織和成年時期葉片組織的總蛋白，17kD位置是4E11識別的Ubc 13蛋白。
圖2人類Ubcl3蛋白質(zhì)單克隆抗體4E11識別水楊酸和甲基茉莉酸酯處理情況下擬南芥總蛋白中的Ubcl3蛋白。總蛋白上樣量均為20微克。
圖3人類Ubcl3蛋白質(zhì)單克隆抗體4E11識別水楊酸，甲基茉莉酸酯和脫落酸處理情況下水稻總蛋白中的Ubcl3蛋白?？偟鞍咨蠘恿烤鶠?0微克。
具體實施方式
實施例I利用人類Ubcl3蛋白質(zhì)單克隆抗體4E11識別植物中的Ubcl3蛋白質(zhì)的方法
(I)從擬南芥(哥倫比亞O型)以及水稻(日本晴)組織中提取總蛋白質(zhì)
在研缽中用液氮輔助將植物樣本磨成粉末，并將磨好的植物樣本轉(zhuǎn)到加有蛋白質(zhì)裂解液的I. 5ml EP管中混勻(每Iml蛋白質(zhì)裂解液中加入O. 5mg研磨好的植物樣本粉末)。蛋白質(zhì)裂解液的成分如下50mM Tris-HCl pH=8. 0,0. 3M NaCl,2mM EDTA, 10%甘油,O. l%TritonX-100, IOmM PMSF, 3mM DDT 以及蛋白酶抑制劑(羅氏)。
將混勻的蛋白質(zhì)樣本置于4攝氏度離心機(jī)中，14000轉(zhuǎn)每分鐘離心15分鐘。取上清轉(zhuǎn)入新的I. 5ml EP管中，再次4攝氏度14000轉(zhuǎn)每分鐘離心15分鐘。最后將上清轉(zhuǎn)到新的I. 5mlEP管中，至此植物樣本總蛋白提取完成。
(2)植物蛋白樣本SDS-PAGE電泳分離
取植物總蛋白樣本50ul，加入IOul 6X SDS上樣緩沖液(緩沖液配方 O. 75MTris-HCl pH=6. 5，60%[質(zhì)量體積比]甘油，24%[質(zhì)量體積比]SDS，0. 03%[質(zhì)量體積比]溴酚藍(lán))混勻，100攝氏度煮5分鐘。冷卻后將樣本14000轉(zhuǎn)每分鐘離心2分鐘(將蒸發(fā)到管蓋上的樣本收集到管底)。
濃度為12%SDS-PAGE 膠配置分離膠:12% 預(yù)制膠，O. 375M Tris-HCl pH=8. 8， O. 1%SDS, O. 1% 過硫酸銨以及 O. 04%TEMED ;濃縮膠5. 1% 預(yù)制膠，O. 1875MTris_HClpH=6. 8， O. 1%SDS, O. 1% 過硫酸銨以及 O. l%TEMEDo
蛋白質(zhì)濃度測定蛋白質(zhì)濃度測定使用Bio-Rad Dc Protein Assay Reagent,標(biāo)準(zhǔn)曲線用0mg/ml，2mg/ml, 4mg/ml, 6mg/ml, 8mg/ml, lOmg/ml BSA水溶液作為標(biāo)準(zhǔn)品測定并繪制。
每個樣本取20ug煮好的總蛋白樣本上樣，恒壓100V電泳90分鐘
(3) Western雜交詳細(xì)步驟
電轉(zhuǎn)液成分甘氨酸14. 41g/L, Tris 3. 03g/L, 800ml水，200ml甲醇，配好后4攝氏度預(yù)冷。PVDF膜使用前用甲醇浸泡10分鐘，濾紙用預(yù)冷的電轉(zhuǎn)液浸泡。按如下順序組裝轉(zhuǎn)膜裝置正極板，海綿，三張濾紙，PVDF膜，電泳完成的膠，三張濾紙，海綿，負(fù)極板。將裝好的轉(zhuǎn)膜裝置放入電轉(zhuǎn)槽，4攝氏度100V轉(zhuǎn)90分鐘。
封閉將轉(zhuǎn)好的PVDF膜置于5%脫脂奶粉溶解到磷酸緩沖液(PBS)中，并置于滾動搖床上室溫封閉 I 小時。PBS 配方=KCl 0. 2g, KH2PO4O. 2g, NaCl 0. 8g, Na2HPO4 · 12H20 3g。
一抗雜交將人類Ubcl3蛋白質(zhì)單克隆抗體(4E11)以I :5000溶在含有5%脫脂牛奶的PBS溶液中。將封閉完成的PVDF膜轉(zhuǎn)入一抗溶液中，置于滾動搖床上室溫孵育一小時。
二抗雜交將一抗孵育完畢的PVDF膜放入PBST中(PBS緩沖液加入0. 1%吐溫 20)，在搖床上清洗10分鐘，重復(fù)3次。將羊抗鼠IgG-HRPCSanta Cruz，sc2005)以I :5000 溶在5%脫脂牛奶的PBS溶液中。將沖洗干凈的PVDF膜放入二抗溶液中，室溫孵育I小時。
顯影二抗雜交結(jié)束后，將PVDF膜按照3d中的方法清洗3遍。將SuperSignal (Thermo, 34080)中的兩種溶液I :1混合，均勻的灑在PVDF膜上，反應(yīng)2分鐘，之后置于 LAS-4000 (FUJIFILM)中顯影。
權(quán)利要求
1.Ubcl3蛋白作為植物內(nèi)參蛋白的應(yīng)用。
2.人類Ubcl3蛋白質(zhì)單克隆抗體4E11在western雜交檢測中識別植物中的Ubcl3蛋白質(zhì)的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地涉及Ubc13蛋白質(zhì)作為植物內(nèi)參蛋白的應(yīng)用。本發(fā)明利用人類Ubc13蛋白質(zhì)單克隆抗體(4E11)可以很好地在western雜交檢測中識別植物中的Ubc13蛋白質(zhì)。并且由于Ubc13蛋白質(zhì)在植物中具有看家基因的特點，人類Ubc13蛋白質(zhì)單克隆抗體(4E11)可以作為不同植物中通用的western雜交內(nèi)參識別抗體。這是第一個可以作為跨植物western雜交內(nèi)參蛋白識別的單克隆抗體。
文檔編號G01N33/68GK102977199SQ20121049918
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月14日
發(fā)明者蕭偉, 臧越鵬 申請人:首都師范大學(xué)