專利名稱：一種增強嫁接植物病毒抗性的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及植物轉基因技術及其應用，特別是一種使番茄接穗品種獲得病毒抗性的方法及RNA干擾載體與轉基因方法。
背景技術：
植物病毒是導致果樹、蔬菜、花卉等園藝植物產(chǎn)量下降和品質(zhì)變劣的重要原因， 在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中病毒病是僅次于真菌的第二大類病害，由于防治困難，素有“植物癌癥” 之稱。目前植物病毒常用的防治措施有消滅病毒源和傳統(tǒng)媒介、應用脫毒技術、藥劑防治與選育抗病品種等，其中選育抗病品種是防治病毒病害最有效、最經(jīng)濟的方法。RNA干擾技術為基礎的植物抗病技術因其高效性、特異性等特點，在植物抗病毒育種上展現(xiàn)了可觀的前旦-5^ O
基因沉默或稱RNA干擾(RNA interference ；RNAi)是指由于轉基因序列或外侵病毒與被沉默的內(nèi)源或外源基因序列具有高度的同源性，其轉錄產(chǎn)物形成雙鏈 RNA (double-stranded RNA, dsRNA)結構，從而特異性地降解同源祀基因mRNA,使之發(fā)生沉默(Fire A. , Xu S. , Montgomery Μ. Κ. , et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans [J]. Nature, 1998，391(6669) :806-811)。由于其干擾作用是發(fā)生在靶基因的轉錄后水平，因此，也成轉錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing ;PTGS)。植物RNAi 具有特異性、高效性、系統(tǒng)性以及可遺傳性等特點?？衫肦NAi技術進行基因功能研究；或直接利用RNAi 創(chuàng)造的特殊性狀變異體進行植物改良。其中RNAi技術在植物病毒抗性方面取得了很好的研究成果。RNAi是真核生物中普遍存在的外源核酸( 如病毒)入侵的防御機制，同時現(xiàn)有研究進一步表明病毒產(chǎn)生交叉保護是由于誘導病毒(弱株系)所產(chǎn)生的RNA沉默降解了具有致病性的同源病毒(強株系)的結果(Frank G. R. , Stuart A. M. and David C. B. Gene Silencing without DNA: RNA-Mediated Cross-Protection between Viruses[J]. Plant Cell, 1999，11: 1207-1216)。利用RNAi抵抗病毒的常用策略是選擇一段植物病毒基因的序列，以反向重復序列的方式構建成轉錄后含發(fā)夾結構的雙鏈RNA(hairpin RNA,hpRNA) 或含內(nèi)含子的ihpRNA (intron-hairpin RNA)表達載體,通過基因槍、病毒載體轉染或者農(nóng)桿菌介導轉化整合到植物基因上，體內(nèi)表達dsRNA，直接或間接誘導RNAi的產(chǎn)生，起到抵抗病毒的目的。而在發(fā)夾結構研究中，認為ihpRNA表達載體比hpRNA表達載體沉默效率高(Helliwell C， Waterhouse P. Constructs and methods for high-throughput gene silencing in plants [J]. Methods, 2003, 30 (4) :289-295)。
園藝植物種類與品種繁多，通過營養(yǎng)繁殖途徑繁衍的園藝植物后代普遍經(jīng)受著病毒的威脅。目前生產(chǎn)中栽培的眾多蔬菜，水果和花卉均有幾十到上百個品種，幾乎每個品種都有數(shù)種到數(shù)十種病毒病害，病毒病抑制了植物的生長、結果，降低了果品的產(chǎn)量、質(zhì)量，甚至引起死樹，植物一旦被病毒侵染，將終生帶毒持久受害。利用基因工程技術針對每一個品種進行改良，提高其抗病毒的能力，雖可行但需花費大量的人力與財力。嫁接是許多園藝植物繁殖的方法之一，絕大多數(shù)的果樹和部分蔬菜采用嫁接繁殖。嫁接既能保持接穗品種的優(yōu)良性狀，又能利用砧木的有利特性。在應用嫁接繁殖時，一般同一種類中的不同品種采用同一砧木，甚至有些同屬中的不同種類也采用同一砧木。這樣一砧多用的情況，使得改良砧木品種比單獨改良接穗品種要高效的多。
所謂植物系統(tǒng)性基因沉默是指dsRNA、aberrant RNA或siRNA等基因沉默信號既可以通過胞間連絲進行的短距離傳遞，也可以通過植物中的維管系統(tǒng)長距離傳遞(BiOsnan C. A. , Mitter N. , Christie M. , et al. Nuclear gene silencing directs reception of long-distance mRNA silencing in Arabidopsis[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2007，104(37):14741-14746)，(Kalantidis K. , Schumacher H. T. , Alexiadis T., et al. RNA silencing movement in plants[J]. Biol Cell, 2008, 100 (I):13-26), 并誘導整個植物產(chǎn)生系統(tǒng)沉默。Daniel H.等(Daniel H. C，F(xiàn)abio T. S. , Miya D. Η, et al. Pattern formation via small RNA mobility [J]. Genes & Dev, 2009, 23: 549-554)研究表明小分子RNA可以作為一種移動的信號分子參與植物發(fā)育的調(diào)控。關于沉默信號在植物中的傳遞方向存在著不同的報道。Palauqui等(Palauqui J. C.，Elmayan T. , Pollien J.M. , et al. Systemic acquired silencing: transgene-specific post-transcriptional silencing is transmitted by grafting from silenced stocks to non-silenced scions [J], EMBO J, 1997，16 (15) :4738-4745.)以煙草為試材，發(fā)現(xiàn) PTGS的傳導是單方向的，即只能從沉默的站木傳向非沉默的接穗；而Sonoda等(Sonoda S. and Nishiguchi M. Graft transmission of post-transcriptional gene silencing: target specificity for RNA degradation is transmissible between silenced and non-silenced plants, but not between silenced plants [J]. Plant J, 2000, 21(1) :1-8)研究表明，PTGS的傳導是雙方向的，從砧木到接穗或從接穗到砧木都可傳導， 但是PTGS從接穗到砧木的傳導效率明顯低于從砧木到接穗的傳導。李明等(李 明，姜世玲，王幼群，等.轉錄后沉默信號可以在擬南芥嫁接體內(nèi)快速雙向傳遞[J].科學通報，2006，51 (2) : 142-147)的結果表明，無論用RNAi型植株作為砧木或接穗，基因沉默信號均能導致相應野生型接穗或砧木中靶基因mRNA的減少，說明基因轉錄后沉默信號可以通過嫁接面在擬南芥體內(nèi)雙向傳遞。但miRNA(micro RNA)或amiRNA (artificial mi RNA) 還未發(fā)現(xiàn)能在嫁接體間傳遞，據(jù)此，本發(fā)明人推測系統(tǒng)性基因沉默方向可能與物種或檢測水平或方法有關，但可以肯定以轉基因方式獲得超表達的siRNA相關的沉默信號能從砧木向上傳遞給接穗。
植物中，關于系統(tǒng)性基因沉默的最初線索來自煙草嫁接試驗。1997年Palauqui 等(Palauqui J. C., Elmayan T. , Pollien J.M., et al. Systemic acquired silencing: transgene-specific post-transcriptional silencing is transmitted by grafting from silenced stocks to non-silenced scions [J]. EMBO J, 1997, 16(15) :4738-4745)把一個芽嫁接到另一植株上時，先將該植株的硝酸鹽還原酶基因沉默，嫁接的幼芽上該基因也沉默。在幼芽中被沉默的基因與砧木中被沉默的基因相同，具有序列特異性。Sonoda 等(Sonoda S. and Nishiguchi M. Graft transmission of post-transcriptional gene silencing: target specificity for RNA degradation is transmissible between silenced and non-silenced plants, but not between silenced plants [J]. Plant J, 2000, 21 (I) : 1-8)的研究也得出了相似的的結論,并同時證明經(jīng)嫁接后，接穗所獲得的PTGS即使在沉默的砧木不存在時也能保持。
近年來，圍繞轉基因生物育種，我國在轉基因生物安全管理和安全性評價研究方面實現(xiàn)了與國際接軌，并取得了令人矚目的進展。但有關基因工程中所涉及的抗性選擇性標記基因?qū)κ称钒踩缘挠绊?，部分人一直存有疑慮，而本項目研究巧妙的避開了這一議題，因為接穗所獲得的系統(tǒng)性抗性，來源于砧木中的小分子RNA的沉默效應，因此理論上， 嫁接轉基因沉默植株接穗品種中將不含抗性標記。為了提高接穗品種抗目標病毒的能力， 若只需通過改良砧木，嫁接后達到增強接穗品種抗該目標病毒的目的，這將為園藝嫁接植物的品種改良開辟一條嶄新的途徑。但到目前為止，通過嫁接方式使接穗品種獲得基因沉默效應的研究中，靶標基因都為植物自身的一些基因，未見到以致病菌或病毒基因為靶標的研究報道。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明根據(jù)上述領域的空白及需求，提供一種使番茄植株獲得抵御病毒能力的方法，以及該方法涉及到RNA干擾載體，改進的轉基因方法等，該方法獲得的抗病毒植株能夠有效規(guī)避轉基因食品的安全隱患，且能夠大大提高了獲得抗病毒轉基因品種的效率。
一種使接穗品種獲得病毒抗性的方法，其步驟如下(1)制備抗病毒的轉基因砧木；(2)使接穗嫁接到所述轉基因砧木上生長發(fā)育； 其特征在于所述抗病毒的轉基因砧木為轉入RNA干擾載體而獲得，所述RNA干擾載體的靶標序列為目標病毒基因組內(nèi)的基因片段。
所述目標病毒指黃瓜花葉病毒CMV，所述接穗品種和轉基因砧木都為番茄品種， 所述RNA干擾載體的靶標序列如Seq ID No.1, 2，3,4, 5或6所示。
所述RNA 干擾載體為 pCAMBIA2300-lA、pCAMBIA2300_2A、pCAMBIA2300_2B、 PCAMBIA2300-3A、pCAMBIA2300-CP 或 pCAMBIA2300_CMV5。
所述制備抗病毒的轉基因砧木，轉基因包括如下步驟(I).番茄播種，(2).切子葉預培養(yǎng)，(3).抑菌篩選培養(yǎng)根癌農(nóng)桿菌工程菌侵染后的子葉，(4).促分化培養(yǎng)，(5).生根培養(yǎng)，其特征在于所述番茄的種子播種前經(jīng)無菌水浸潤51小時；20%次氯酸鈉滅菌10 min,無菌水洗5 次，每次5min ； 30°C培養(yǎng)箱催芽兩天；所述切子葉預培養(yǎng)，是在真葉未出現(xiàn)前切取子葉進行預培養(yǎng)；所述抑菌篩選培養(yǎng)被根癌農(nóng)桿菌侵染并暗培養(yǎng)2天的子葉，培養(yǎng)基C中pH 6. O, MediumBase +2mg/L反式玉米素核苷+ 200mg/L特美汀+100mg/L卡那霉素，葉背朝上光照培養(yǎng)，IOd轉接一次，直至出現(xiàn)綠色愈傷或芽點；將帶芽點的外植體轉入培養(yǎng)基Cl中pH 6. O,Medium Base +1 mg/L反式玉米素核苷+80 mg/L卡那霉素+200 mg/L特美汀中培養(yǎng)l(Tl4d，待分化出芽；所述促分化培養(yǎng)抑菌培養(yǎng)中篩選到的抗性芽轉入到培養(yǎng)基C3中pH 6. O，Medium Base +0. 5 mg/L反式玉米素核苷+1. 5 mg/L 3-卩引哚乙酸+80 mg/L卡那霉素+ 200 mg/L 特美汀；所述生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基為pH 6. O, Medium Base +2mg/LIBA + 200mg/L特美汀。
一種以黃瓜花葉病毒基因為靶標的的RNA干擾載體，其特征在于，所述RNA干擾載體的革巴標序列如Seq ID No.1, 2，3，4，5或6所示。
所述RNA 干擾載體為 pCAMBIA2300-lA、pCAMBIA2300_2A、pCAMBIA2300_2B、 PCAMBIA2300-3A、pCAMBIA2300-CP 或 pCAMBIA2300_CMV5。
轉化有上述RNA干擾載體的菌株或植物細胞。
所述菌株指根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105。
所述植物細胞指轉基因番茄砧木的外植體前體細胞。
一種制備轉基因番茄砧木的方法，包括如下步驟(I).番茄播種，(2).切子葉預培養(yǎng)，(3).抑菌篩選培養(yǎng)根癌農(nóng)桿菌工程菌侵染后的子葉，(4).促分化培養(yǎng)，(5).生根培養(yǎng)，其特征在于所述番茄的種子播種前經(jīng)無菌水浸潤51小時；20%次氯酸鈉滅菌10 min,無菌水洗5 次，每次5min ;30°C培養(yǎng)箱催芽 兩天；所述切子葉預培養(yǎng)，是在真葉未出現(xiàn)前切取子葉進行預培養(yǎng)；所述抑菌篩選培養(yǎng)被根癌農(nóng)桿菌侵染并暗培養(yǎng)2天的子葉，培養(yǎng)基C中pH 6. O, MediumBase +2mg/L反式玉米素核苷+ 200mg/L特美汀+100mg/L卡那霉素，葉背朝上光照培養(yǎng)，IOd轉接一次，直至出現(xiàn)綠色愈傷或芽點；將帶芽點的外植體轉入培養(yǎng)基Cl中pH 6. O,Medium Base +1 mg/L反式玉米素核苷+80 mg/L卡那霉素+200 mg/L特美汀中培養(yǎng) l(Tl4d，待分化出芽；所述促分化培養(yǎng)抑菌培養(yǎng)中篩選到的抗性芽轉入到培養(yǎng)基C3中pH 6. 0，Medium Base +0. 5 mg/L反式玉米素核苷+1. 5 mg/L 3-卩引哚乙酸+80 mg/L卡那霉素+ 200 mg/L 特美??；所述生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基為pH 6. O, Medium Base +2mg/LIBA + 200mg/L特美汀。
本發(fā)明目的在于，通過系統(tǒng)性基因沉默與嫁接技術的結合，先使砧木獲得對入侵病毒的抗性，然后砧木將其病毒抗性轉導至接穗中使嫁接于該砧木上的接穗品種獲得病毒抗性。本發(fā)明區(qū)別于現(xiàn)有技術的思路是構建的用于轉化砧木的RNA干擾載體的基因沉默對象是入侵病毒的基因，而非植物本身的基因。
本發(fā)明中以番茄為砧木和接穗試材，以寄主較為廣泛的黃瓜花葉病毒CMV為靶標病毒進行具體試驗驗證，實驗數(shù)據(jù)顯示，接穗番茄獲得了良好的CMV病毒抗性?；诒景l(fā)明的構思，說明書中記載的實驗方法的指導以及本領域普通技術人員所具備的常規(guī)實驗技能，本領域技術人員可以將本發(fā)明的方法應用到很多種易于受病毒侵染的并且可以嫁接的植物中，這種應用都在本發(fā)明請求保護的范圍內(nèi)。即，本發(fā)明的方法不限于應用到具體實施例中記載的番茄上。
本發(fā)明以番爺為試材，以黃瓜花葉病毒(Cucumber Mosaic Virus; CMV)為祀標對象，驗證本發(fā)明的構思。即通過分別選擇CMV 5個基因OPF片段以及I個融合了 5個基因片段的共6個ihpRNA植物表達載體，采用農(nóng)桿菌介導轉化番茄，使轉化植株產(chǎn)生siRNA，接種CMV篩選出高抗病毒的轉基因植株。之后以抗性植株的TO或Tl代為砧木，嫁接未轉基因的番茄，砧木中的siRNA轉運到接穗中，以增強接穗對CMV的抗性。目前，在栽培番茄品種中還未發(fā)現(xiàn)有對CMV病毒的抗性基因，且栽培番茄品種也僅存在耐病性品種，利用常規(guī)雜交方法難以獲得CMV抗性番茄品種。因此通過RNA干擾轉基因的方法，是快速獲得CMV 抗性材料的有效途徑。近年來，圍繞轉基因生物育種，我國在轉基因生物安全管理和安全性評價研究方面實現(xiàn)了與國際接軌，并取得了令人矚目的進展。但有關基因工程中所涉及的抗性選擇性標記基因?qū)κ称钒踩缘挠绊懀糠秩艘恢贝嬗幸蓱]。而本發(fā)明巧妙的避開了這一議題，因為接穗所獲得的系統(tǒng)性抗性，來源于砧木中的小分子RNA的沉默效應。因此理論上，嫁接轉基因沉默植株接穗品種基因組以及所產(chǎn)生的雌/雄配子中將不含抗性標記基因，防止了抗生素抗性基因的漂移。
本發(fā)明包括以下步驟a.針對黃瓜花葉病毒(CMV)5個基因，通過比對番茄EST數(shù)據(jù)庫，選取CMV5個基因ORF 區(qū)間的片段，通過PCR和重疊PCR構建5個含CMV特異基因片段和I個融合了 5個基因片段的ihpRNA植物沉默表達載體；b.利用改良后的遺傳轉化體系，通過農(nóng)桿菌介導轉化番茄植株，檢測獲得轉基因陽性植株，扦插繁殖轉基因植株(T0代)；c.通過接種CMV病毒，比較不同載體轉基因株系的CMV抗性，篩選出高抗病毒的轉基因株系；d.利用抗性扦插苗(T0代)或Tl代植株為砧木，嫁接野生型植株(未轉基因植株)，接種 CMV病毒，檢測獲得病毒抗性的嫁接植株；e.提取砧木與接穗總RNA，反轉為cDNA，RT-PCR檢測抗生素抗性基因的表達。


圖1 :黃瓜花葉病毒(CMV)基因組結構特征圖2 :本發(fā)明采用的載體構建方案圖3 :5個含CMV基因特異片段載體的構建 M2K/15K=Marker 2K/15K ；A.:用Pstl/Sall酶切驗證克隆載體pUCCRNA1-lA CP，所切出小片段為構建入克隆載體的反向重復序列；B.將從pUCCRNA1-lA CP酶切后的反向重復序列，構建入表達載體得到 PCAMBIA2300-1A CP 載體；C.Γ3 PstI/SalI酶切驗證表達載體pCAMBIA2300_lA CP，所切出小片段為構建入克隆載體的反向重復序列。
圖4 :含5個CMV基因片段融合載體的構建A.1 =Marker為2K，分別利用R1AF/R1AR和R2AF/R2AR引物擴增片段IAF和2AF ；A.2 :利用RlAF/ R2AR引物，以IAF和2AF混合物為模板，擴增融合片段1A+2A ；B.1 :分別利用R2BF/R RCPF/R引物擴增片段2BF、3AF和CPF ；B.2 :利用R2BF/RCPR引物，以2BF、3AF和CPF混合物為模板，擴增融合片段2B+3A+CP ；C.:CMV5為利用RlA F/ RCP R引物，以1A+2A和2B+3A+CP混合物為模板，擴增融合片段CMV5 ；D.PstI, Pstl/Sall 酶切檢測 pCAMBIA2300-CMV5 載體。
圖5 :本發(fā)明采用的改進后的番茄轉基因步驟圖6 :轉基因番茄的PCR檢測(部分株系分批檢測)M =Marker 2K ；+ :質(zhì)粒 pCAMBIA2300_lA 為模板；CK :未轉基因番茄 MoneyMaker 為模 IA CMV5-1、表示以ActinlPF/IntornR為引物，不同靶標載體對應轉基因株系為模板擴增的條帶圖7 :轉基因番爺部分株系的Southern雜交檢測M =Marker 15K ;+ :質(zhì)粒pCAMBIA2300_lA為模板(未酶切完全);CK :未轉基因番茄 MoneyMaker為模板；T01A CMV5. Γ2 :表示不同靶標載體對應轉基因株系Southern雜交條帶圖8 :轉基因番茄植株的RT-PCR檢測M =Marker 2K ；+ :質(zhì)粒pCAMBIA2300_lA為模板；CK :未轉基因番茄MoneyMaker為模板； TOlA CMV5. Γ2 :表示分別以IAF CPF和RlAF (T0CMV5)為上游引物，IntronR為下游引物， 擴增不同靶標載體對應轉基因株系的條帶圖9 :轉基因番茄的扦插繁殖與CMV攻毒篩選抗病毒TO代株系 CK :為未轉基因番茄植株MoneyMaker ；TOIA^CP. Γ2和T0CMV5. Γ5 :表示不同轉基因株系扦插苗，接種CMV病毒后鑒定病毒抗性，圖中株系為篩選出的部分高抗株系圖10 :轉基因番茄Tl代的繁 殖與CMV攻毒篩選抗病毒Tl代株系 CK :為未轉基因番茄植株MoneyMaker ；T11A. 1 CMV5.1 :表示不同轉基因株系Tl代，接種CMV病毒后鑒定病毒抗性圖11 :本發(fā)明采用的嫁接技術圖12 :嫁接后抗生素抗性基因NptII的RT-PCR檢測M =Marker 2K ；+ :質(zhì)粒pCAMBIA2300_lA為模板；CK :未轉基因番茄MoneyMaker為模板； TOlA CMV5. Γ2 :表示以NptIIF/R為引物不同靶標載體對應轉基因株系為模板擴增的PCR 條帶上圖表明接穗中無NptII基因的表達具體實施方式
實施例1.針對黃瓜花葉病毒(CMV)基因，通過比對番茄EST數(shù)據(jù)庫，構建6個 ihpRNA植物沉默表達載體；黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)是雀麥花葉病毒科(Bromoviridae)黃瓜花葉病毒屬(Cucumovirs)成員。CMV為單鏈正義RNA病毒?；蚪M分為RNA1、RNA2和 RNA3，基因組大小分別為3389nt、3035nt和2197nt，分別包被于三顆病毒粒體之中，其中 RNA3含亞基因組RNA4，全長1000 nt。RNAl編碼核酸復制酶；RNA2編碼兩個蛋白RNA依賴的 RNA 聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRP)和 2b 蛋白，RdRP 與病毒的侵染有關，2b蛋白類似一種病毒運動蛋白，有實驗證明2b蛋白能夠減弱RNA介導的病毒基因的沉默；RNA3編碼一種運動蛋白3A蛋白，其具體功能不詳?shù)c病毒細胞間的傳遞有關；RNA4 編碼病毒外殼蛋白CP蛋白。CMV基因組的具體特征如圖1。
本發(fā)明針對黃瓜花葉病毒(CMV) 5個基因，通過比對番茄EST數(shù)據(jù)庫，選取CMV 5 個基因ORF區(qū)間的片段如(Seq ID No. 1、2、3、4、5所示)，通過PCR和重疊PCR構建5個含 CMV特異基因片段和I個融合了 5個基因片段的ihpRNA植物沉默表達載體，具體步驟如下擴增5個片段分別用到的引物，下劃線部分為引入的酶切位點IAF :5’-ATTGTCGACTGGATGCGTCCTGTGC-3’IAR :5’-ATCGGATCCTTGGGCGGACTTCTTG-3’ ；2AF :5’- AATGTCGACTGTCCAACGCCAACC-3’2AR :5’-AGGGGATCCTTCGTTGTACCTACTC-3’2BF :5’-ATTGTCGACTGGCTCGTATGGTGGA-3’2BR :5’-GAGGGATCCGCGAACCAATCTGTAT-3’ ；3AF :5’-ATAGTCGACAGCCCTGAAGCCATTA-3，3AR :5，-AGAGGATCCAAAGACCCTTCAGCAT-3，；CPF :5’- ATTGTCGACCTTTGTAGGGAGTGA -3’ CPR :5’- ATCGGATCCTTTACGGACTGTCA-3’ ；擴增融合片段用到的重疊PCR引物RlA F :5’-TATGTCGACTGTGCCCGAGGGTATTG-3’RlA R :5’-TCAGTAGCACGGTTTAAATTTACAGATCACGCATTCAC-3’R2A F :5’-GTGAATGCGTGATCTGTAAATTTAAACCGTGCTACTGA-3’R2A R :5’-TTCTTCGCCTCCACCATACGCTTGATGAAAAGAGTCGTCGT-3’R2B F :5’-ACGACGACTCTTTTCATCAAGCGTATGGTGGAGGCGAAGAA-3’R2B R :5’-TCCACTGATGCTGAAGGGTCTGATAGAACGGTAGGAAGCG-3’R3A F :5’-CGCTTCCTACCGTTCTATCAGACCCTTCAGCATCAGTGGA-3’R3A R :5’-CGAGTTAATCCTTTGCCGAACACGGTCGTATTGCTTCCTT-3’RCP F :5’-AAGGAAGCAATACGACCGTGTTCGGCAAAGGATTAACTCG-3，RCP R :5’-ATCGGATCCATCTATTACCCTAAAGCCAC-3’克隆載體檢測引物Ml3+ :5’- AGGGTTTTCCCAGTCACG-3’Ml3- :5’- GTGT GAAATTGTTA TCCGCTC-3’表達載體檢測引物ActinlPF :5’-CCTCAGCATTGTTCATCGGTAGTT-3’IntronR :5’-TGTGTCACTCAAAACCAGATAAAC-3’克隆載體pUCCRNAi，記載在(Luo, A. , Qian, Q. , Yin, H. et al. (2006) EUII, encoding a putative cytochrome P450 monooxygenase, regulates internode elongation by modulating gibberellin responses in rice. Plant Cell Physiol. 47， 181 - 191.)中，本實驗室亦有保存，自申請日起二十年內(nèi)可向公眾發(fā)放用于實驗研究。
植物表達載體pCAMBIA2300-Actinl_ocs，記載在(Fang，J.，ChaijC·，Qianj Q.，Li，C.，Tang, J.，Sun，L，Huang, Z.，Guoj X.，Sun, C. and Liuj M. 2008.Mutations of genes in synthesis of the carotenoid precursors of ABA lead to pre-harvest sprouting and photo-oxidation in rice. The Plant Journal. 2， 177-189)，本實驗室亦有保存，自申請日起二十年內(nèi)可向公眾發(fā)放用于實驗研究。
本發(fā)明中利用pUCCRNAi中兩組同尾酶切位點Xhol/Sall和Bglll/BamHI，將選取并經(jīng)PCR擴增得到的CMV 5個基因ORF區(qū)間的片段如Seq ID No. 1、2、3、4、5所示的片段的正、反向序列分別構建到pUCCRNAi的兩組酶切位點中，即每個片段的正反向序列分別構建到兩組酶切位點中得到具有反向重復序列的RNAi克隆載體pUCCRNA1-lA、2A、2B、3A、CP ;通過重疊PCR將Seq ID No. 1、2、3、4、5所示的5個片段內(nèi)的部分片段連在一起得到Seq ID No. 6所示的片段，將Seq ID No. 6所示的片段的正、反向序列構建到pUCCRNAi的兩組酶切位點中得到RNAi克隆載體pUCCRNA1-CMV5，引物為上面的重疊PCR引物。
將克隆載體pUCCRNA1-lA、2A、2B、3A、CP、CMV5的反向重復區(qū)，用內(nèi)切酶Sall/PstI 酶切后連接到植物表達載體pCAMBIA2300-ACtinl-OCS中，載體構建方案如圖2所示，得到具有ihpRNA的植物表達載體pCAMBIA2300-lA、2A、2B、3A、CP、CMV5酶切，酶切驗證如圖3，4 所示。測序結果也顯示所選的正反向序列的構建位置正確。
將構建得到的植物表達載體轉入到大 腸桿菌感受態(tài)細胞中，擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒用于農(nóng)桿菌轉化。操作如下步驟1. pUCCRNAi載體片段酶切與回收提取大腸桿菌中pUCCRNAi質(zhì)粒(質(zhì)粒DNA的小量提取試劑盒)。取5ul質(zhì)粒，利用XhoI 和BagII內(nèi)切酶，采用50ul酶切體系，37°C酶切過夜，回收酶切產(chǎn)物中3K左右長度的質(zhì)粒片段；采用DNA/RNA的紫外分光檢測瓊脂糖凝膠電泳分析判斷回收片段的濃度?；厥掌螛擞洖?XhoI/Bagll-pUCCRNAi。
步驟2. CMV基因PCR片段酶切與回收利用引物1AF/ITCPF/R，以含CMV全基因組的侵染性克隆載體上，通過如下PCR方法，分別獲得5個CMV基因片段，分別記錄為1A、2A、2B、3A和CP ;測序驗證其準確性；引物的稀釋將合成的引物直接加去離子水配制成終濃度為10umol/L。
PCR管中依次加以下成分 |50ul體系|25ul體系 10XPCRBufferwithMg2+' 5ul2. 5ul模板 DNA~2ul0.4-1ulIOmMdNTP (混合)_4ul2ulIOuM 引物 F/引物 R~2ulIulTaq 酶Iul0.5ulddH20補至 50ul 補至 25ul(2)混勻后,稍離心至管底,將PCR管放入PCR儀,蓋上熱蓋。擴增前先預熱熱蓋。
(3)以下擴增條件940C 3 min 預變性，94°C 30sec 變性；50_68°C 30sec 退火；72°C Imin 延伸(目的片段大于500 bp用I分鐘，小于500 bp用40秒)，35個循環(huán)，72°C 10 min，4°C保存分別純化回收PCR產(chǎn)物得5個CMV基因片段。各取20ul回收片段，利用SalI和BamHI 內(nèi)切酶，采用50ul酶切體系，37°C酶切6h，回收酶切產(chǎn)物中對應Seq ID No. Γ5所示序列長度的質(zhì)粒片段。取Iul回收片段，進行凝膠電泳判斷回收質(zhì)量。CMV回收片段標記為SalI/ BamH1-lA,SalI/BamHI_2A、SalI/BamHI_2B、SalI/BamHI_3A、Sall/BamH1-CP。
步驟3. pUCCRNA1-lA CPF的連接與轉化大腸桿菌取 4ul XhoI/Bagll-pUCCRNAi 和 8ul Sall/BamH1-lA、 SalI/BamHI_2A、 Sail/ BamH1-2B, SalI/BamHI_3A、Sall/BamH1-CP 分別進行接連
權利要求
1.一種制備轉基因番茄砧木的方法，包括如下步驟(O番爺播種，番爺?shù)姆N子播種前經(jīng)無菌水浸潤5、小時后于培養(yǎng)箱中催芽；(2)切子葉預培養(yǎng)，在真葉未出現(xiàn)前，子葉剛冒出種皮且未完全展開時，將子葉兩端切除l_2mm，再從中間橫切一刀，每個子葉切成兩塊，進行預培養(yǎng)；(3)將根癌農(nóng)桿菌侵染預培養(yǎng)過的葉盤外植體，進行共培養(yǎng)；其中根癌農(nóng)桿菌含有對卡那霉素抗性基因標記的載體；(4)將根癌農(nóng)桿菌侵染后的子葉轉入培養(yǎng)基C中，葉背朝上光照培養(yǎng)，待愈傷上芽點出現(xiàn)，將帶芽點外植體轉入Cl培養(yǎng)l(Tl4d，分化出芽；其中，培養(yǎng)基C中pH 6. O, MediumBase +2mg/L反式玉米素核苷+ 200mg/L特美汀+100mg/L卡那霉素；培養(yǎng)基Cl中pH 6. O, Medium Base +1 mg/L反式玉米素核苷+80 mg/L卡那霉素+200 mg/L特美??；(5)促分化培養(yǎng)，待再生芽長出后切去白化外植體部分將抗性芽轉入培養(yǎng)基C3中pH 6. O,Medium Base +0. 5 mg/L反式玉米素核苷+1. 5 mg/L 3-卩引哚乙酸+80 mg/L卡那霉素 + 200 mg/L特美汀；(6)生根培養(yǎng)，待抗性芽莖部長至Icm后，剔除愈傷組織，切下置入培養(yǎng)基D中生根培養(yǎng) 15 30d，培養(yǎng)基 D 為pH 6. O, Medium Base +2mg/L 吲哚丁酸 + 200mg/L 特美??；(7)田間培養(yǎng)移栽至大田。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(I)中，種子用無菌水浸潤后于30°C 培養(yǎng)箱催芽，待種子露白，點播于1/2MS培養(yǎng)基中，然后轉入26 28°C光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)；步驟(2)中，預培養(yǎng)為弱光預培養(yǎng)。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(3)中，共培養(yǎng)的溫度為26°C，且為暗培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種增強嫁接植物病毒抗性的方法，該方法包括(1)番茄播種，播種前經(jīng)無菌水浸潤5~8小時后于培養(yǎng)箱中催芽；(2)切子葉預培養(yǎng)；(3)將根癌農(nóng)桿菌侵染預培養(yǎng)過的葉盤外植體，進行共培養(yǎng)；(4)將根癌農(nóng)桿菌侵染后的子葉轉入培養(yǎng)基C中分化出芽；(5)促分化培養(yǎng)；(6)生根培養(yǎng)；(7)田間培養(yǎng)。本發(fā)明方法可縮短出芽1周左右，且出芽整齊，分化效率高，可有效防止假陽性，能有效促進正常芽的分化與生長。
文檔編號A01H5/00GK102994546SQ20121048703
公開日2013年3月27日 申請日期2011年10月17日 優(yōu)先權日2011年10月17日
發(fā)明者楊國順, 白描, 鐘曉紅, 熊興耀, 鄧子牛, 石雪暉, 陳文婷, 周敏 申請人:湖南農(nóng)業(yè)大學