專利名稱：拮抗菌核病菌的固氮芽孢菌及其用途的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及拮抗菌核病菌的固氮芽孢菌及其應用。
背景技術(shù)：
氮肥是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最重要的生產(chǎn)資料之一。生產(chǎn)化學氮肥消耗大量能源，占生產(chǎn)總成本的70% 80%。近年來能源日趨緊張，我國化肥生產(chǎn)用煤價格飚升導致化學氮肥價格上漲，農(nóng)民難以承受，反響強烈。此外，化學氮肥在提高作物產(chǎn)量、保障我國糧食安全方面發(fā)揮了巨大作用，但是不合理施氮已經(jīng)形成了嚴重的面源污染，造成一系列的嚴重危害，如太湖藍藻事件令人觸目驚心。城市地下水硝酸鹽污染已經(jīng)對飲用水安全造成了威脅。大氣中含有78%的氮素，但其存在形式是分子態(tài)氮氣，動植物不能直接利用，自然界只有某些原核微生物具有直接利用大氣中氮氣的能力，將其還原成氨，這就是生物固 氮作用。選用高效固氮微生物菌種工廠化生產(chǎn)制成菌劑，或進一步與其它富含植物營養(yǎng)的物料復合加工成生物制品，應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，可以提供作物氮素營養(yǎng)，改善作物根際生態(tài)環(huán)境，提高土壤生物肥力性狀，這就是通常所說的固氮微生物菌劑或固氮微生物肥料。生物氮肥具有多種優(yōu)勢①生物氮肥由可再生的生化制劑和活體微生物組成，可以再生，不存在資源枯竭問題，是可持續(xù)發(fā)展農(nóng)資產(chǎn)品。②生物氮肥是環(huán)境友好型肥料，其生產(chǎn)和使用過程均不產(chǎn)生三廢等污染性物質(zhì)，而且能改善土壤理化性質(zhì)，提高土壤肥力，是生態(tài)農(nóng)業(yè)農(nóng)資產(chǎn)品。③生物氮肥生產(chǎn)耗能少、成本低，其成本僅為等效化學氮肥的20% 40%，可以為國家節(jié)省大量的煤炭和石油等能源戰(zhàn)略物資。④使用生物氮肥可以顯著降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本，提高農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)，提升土壤肥力，使農(nóng)民受益，促進社會和諧發(fā)展。核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)的是作物菌核病的病原菌,形態(tài)特征表現(xiàn)為子囊盤小，呈小杯狀，淺肉色至褐色，單個或幾個從菌核上生出，直徑O. 5-lcm，柄褐色細長，彎曲，長3-5cm，向下漸細，與菌核相連。菌絲體可以形成菌核，長柄的褐色子囊盤產(chǎn)生在菌核上。菌核形狀多樣，長3-15 μ m。子囊圓柱形，120-140 μ mX 11 μ m，孢子通常8個，單行排列，橢圓形，8-14 μ mX 4-8 μ m，側(cè)絲細長，線形，無色，頂部較粗。該菌是一種危害作物和蔬菜的世界性的重要的植物病原菌，廣泛地侵染、危害十字花科、豆科、茄科、蕓香科等植物，如造成油菜、大豆、向日葵、黃瓜、辣椒等經(jīng)濟作物和蔬菜菌核病。目前對菌核病的防治主要依靠化學農(nóng)藥，然而化學防治不僅成本高、污染環(huán)境，而且防效也不理想，同時食品的安全性也受到嚴重影響。菌種是微生物肥料生產(chǎn)應用的基礎。目前，限制我國微生物肥料行業(yè)發(fā)展的瓶頸就是高效菌種的選育問題。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)迫切需求固氮效能高、拮抗病原真菌、抗逆性強、貨架期長的微生物肥料生產(chǎn)用菌種。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株可以在農(nóng)作物根際進行高效固氮，并且拮抗核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)的細菌。
本發(fā)明所提供的細菌是芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD212，該菌株已于2011年7月6日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號)，保藏編號為CGMCC No. 5035。本發(fā)明的另一個目的是提供一種菌劑，該菌劑的活性成分為所述的芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035。該菌劑除包含作為活性成分的芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035夕卜，還可包括輔料，如草炭、動物的糞便、各類作物的秸桿、松殼、稻草、花生皮等。該菌劑可用于抑制病原真菌、防治植物真菌病害、固氮、產(chǎn)生固氮酶等。
所述芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035在制備下述I)-4)中任一菌劑中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍I)用于抑制病原真菌的菌劑；2)用于防治植物真菌病害的菌劑；3)用于固氮的菌劑；4)產(chǎn)生固氮酶的菌劑。所述病原真菌為通過土壤、施入土壤中的肥料、和/或種子傳播的真菌，具體可為引起菌核病的真菌；所述植物真菌病害可為菌核病。所述引起菌核病的真菌可為核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)。所述的芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035或以芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035為活性成分的菌劑在生產(chǎn)固氮酶中的應用以及在制備生物有機肥中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明的再一個目的是提供一種含有芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD212CGMCCNo. 5035或以芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035為活性成分的菌劑的生物有機肥。本發(fā)明的又一目的是提供一種培養(yǎng)芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCCNo. 5035的方法，包括將芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035在用于培養(yǎng)芽孢桿菌的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的步驟。本發(fā)明的又一目的是提供一種制備所述菌劑的方法，該方法包括如下步驟將所述的芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035作為活性成分，得到所述菌劑。實驗證明，本發(fā)明是從土壤樣品中經(jīng)過層層篩選，最終篩選出了芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035，該菌株具有很高的固氮酶活性，能夠拮抗作物菌核病病原菌核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum),競爭適應能力強,接種效果好,在固氮微生物菌劑和生物有機肥生產(chǎn)中具有廣闊的應用前景。保藏說明菌種名稱芽孢桿菌拉丁名(Bacillussp.)菌株編號⑶SD212保藏機構(gòu)中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏機構(gòu)簡稱CGMCC地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號
保藏日期2011年7月6日保藏中心登記入冊編號CGMCC No. 503

圖I為芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035的固氮酶活性。圖2 為芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035 拮抗菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)。 左側(cè)菌落為病原真菌核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum),右側(cè)菌落為芽抱桿菌(Bacillus sp.)GDSD212 CGMCC No. 5035。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。固氮菌富集培養(yǎng)液ACCC55 成份蔗糖 10g、K2HPO4 · 3H20 0. 5g、NaCl 0. 2g、CaCO3Ig^MgSO4 · 7H20 0. 2g、蒸餾水 1000ml、pH 7. 0 7. 2。改良固氮培養(yǎng)基成份蔗糖10g、K2HPO4 · 3H20 0. 5g、NaCl 0. 2g、CaCO3 lg、MgSO4 · 7H20 0. 2g、酵母膏 0. 5g、蒸餾水 1000ml、瓊脂 I. 5% 2· 0%, pH7. 0 7· 2。無氮培養(yǎng)基蔗糖10g，NaCl 0. 12g，K2HPO4 · 3H20 0. 5g，CaCO3 lg,MgSO4 · 7H200. 2g，蒸餾水 IOOOmL, pH7. 2。圓褐固氮菌(Azotobacter chroococcum) ACCCl 1103 (參見“孫建光等.高效固氮芽孢桿菌篩選及其生物學特性.中國農(nóng)業(yè)科學，2009，42 ￠) :2043-2051”)。菌核病菌-核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)(中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，ACCC30046)。實施例I、固氮菌⑶SD212的分離與鑒定一、固氮菌⑶SD212的富集與分離取IOg土樣(中國黑龍江省氮素營養(yǎng)相對貧瘠的農(nóng)田土壤)放入90ml無菌水中搖床振蕩20min制成混濁液，吸取5ml放入30ml固氮菌富集培養(yǎng)液ACCC55中，lOOrpm，28°C進行搖床振蕩培養(yǎng)，72h后換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。重復培養(yǎng)3次后進行固氮芽孢菌分離。吸取Iml上述固氮菌富集培養(yǎng)物放到9ml無菌水中制成KT1稀釋度，繼續(xù)稀釋制成10_2、10_3、10_4、10_5稀釋度的菌懸液，在100°C沸水中加熱lOmin，冷卻后每個稀釋度取0. Iml涂布在固氮菌分離培養(yǎng)基平板上，29°C靜置培養(yǎng)。2 3d待菌落形成后，在改良的ACCC55固氮菌培養(yǎng)基平板上，用平板劃線法進行菌種純化。將分離并純化所得的其中一個菌株命名為固氮菌 GDSD212。二、固氮菌⑶SD212的鑒定從以下幾個方面鑒定步驟一分離并純化得到的固氮菌⑶SD212 I、形態(tài)學鑒定將處于對數(shù)生長期，且菌落大小穩(wěn)定，上述步驟一分離并純化得到的固氮菌GDSD212進行單菌落狀態(tài)描述，主要包括菌落的大小、顏色、透明度、濕潤度、菌落表面狀態(tài)(是否平坦、突起、褶皺、凹陷等)、菌落邊緣狀態(tài)(是否整齊、不規(guī)則、放射狀等)。對于處于對數(shù)生長期的所述固氮菌⑶SD212，經(jīng)涂片染色后采用光學顯微鏡觀察菌體的形態(tài)。結(jié)果表明，上述步驟一分離并純化得到的固氮菌⑶SD212菌落圓形凸起，淺乳白色，有光澤，表面光滑濕潤，邊緣整齊；菌體桿狀，O. 5 X 2. O 3. O μ m，有芽孢。2、生理生化特征分析參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》(東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊.北京科學出版社，2011.)和《微生物學實驗》(沈萍，范秀容，李廣武.微生物學實驗(第三版).北京高等教育出版社，1999.)測定上述固氮菌⑶SD212的生理生化特征。所述固氮菌⑶SD212的生理生化特征測定結(jié)果如表I所示表I固氮菌⑶SD212的生理生化特征·
生理生化特征實驗結(jié)果生理生化特征實驗結(jié)果
接觸酶反應__+ 糖D+葡萄糖__-
VP反應__- 醇D+蔗糖__+吲哚實驗__+ 類D+乳糖__-
明膠液化__+ 發(fā)D+半乳糖__-
淀粉水解__+ 酵D+核糖__+
卵磷脂酶__- 產(chǎn)L+阿拉伯糖一
硝酸鹽還原__+ 酸D+果糖__+
甲基紅__~__D+甘露酉早__—
石蕊牛奶反應__+D+山梨醇__+
梓檬酸鹽利用__—__D+麥芽糖__+ 苯丙氨酸脫氨酶__=__D+纖維二糖十
產(chǎn)二輕基丙酮__—__甘油glycerol__—
葡萄糖產(chǎn)氣__+ 2%NaCl__-
pH5.7生長測定__+___
0.001%溶菌酶__+___注“ + ”表示陽性，“”表示陰性。3、16s rDNA序列同源性分析常規(guī)方法培養(yǎng)上述步驟一分離純化得到的固氮菌GDSD212，提取菌株的總DNA作為基因擴增模板，以細菌16s rDNA通用引物，27f :5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '，1492r -TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'進行PCR反應。反應體系采用上海生物工程有限公司PCR擴增試劑盒。反應程序為95°C變性30s、55°C退火lmin、72°C延伸2min，共30個循環(huán)。DNA測序由北京三博遠志生物技術(shù)公司完成，序列拼接及相似性分析使用DNAStar軟件完成，序列比對通過美國國家生物技術(shù)信息中心NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www. ncbi. nlm.nih. gov)在線完成。固氮芽孢菌⑶SD212菌株16s rDNA的序列詳見序列表中序列I。
4、生長特性分析進行了菌株最適溫度和最適pH生長實驗。采用無氮培養(yǎng)基分別在4°C、28°C、37°C、60°C培養(yǎng)、觀察、記錄菌株的溫度適應性，每個處理3次重復。調(diào)整酸度分別為pH3、pH4、pH5、pH6、pH7、pH8、pH9、pHIO、pHll，每個處理3次重復，培養(yǎng)、觀察、記錄菌株生長的最適pH。結(jié)果表明，所述固氮菌⑶SD212的最適生長溫度為28°C，最適生長pH為pH7 8。鑒于上述形態(tài)、生理生化特征分析和16s rDNA序列同源性分析結(jié)果，將步驟一分離并純化得到的固氮菌GDSD212鑒定為變型細菌α亞群芽孢桿菌科芽孢桿菌屬(Bacillussp.)。該固氮菌⑶SD212已于2011年7月6日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號)，保藏編號為CGMCCNo.5035。實施例2、芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035固氮酶活性測定·對實施例I所得的芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035進行固氮酶活性測定，具體操作如下所述在15X 150mm螺口玻璃管中加入5ml改良固氮培養(yǎng)基制成斜面，接種芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035，28°C培養(yǎng)。以微生物肥料常用生產(chǎn)菌種圓褐固氮菌(Azotobacter chroococcum) ACCC11103為陽性對照,不接種空白斜面為陰性對照，設3個重復。培養(yǎng)72h后，換橡膠塞，注入乙炔氣體使終濃度為10%，用醫(yī)用膠布密封，繼續(xù)培養(yǎng)72h，取100 μ I反應氣體，用氣相色譜儀測定乙烯生成量，根據(jù)以下公式計算菌株的固氮酶活性。固氮酶活性(nmol/mg ·1ι) = C2H4nmol/[菌體蛋白量(mg) X反應時間(h)]，其中 C2H4nmol = IOOOXC2H4 體積(μ I) X 273XP/[22. 4X (273+t) X 760]，其中P為氣壓(mm汞柱)，t為反應溫度CC )。其中，菌體蛋白含量測定方法如下所述用5ml生理鹽水將試管斜面上的菌苔洗入離心管中，收集菌體，向沉淀中加入3ml 0. 5M的NaOH沸水煮沸5min,加入3ml 0. 5M的HCl混合，離心后取上清I. Oml，加入5ml考馬斯亮藍溶液，在漩渦混合器上混合，顯色3min，測定595nm處的吸光值A595，根據(jù)牛血清白蛋白標準曲線計算菌體蛋白含量。結(jié)果顯示，篩選到的芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035的固氮酶活性為68. 403nmol C2H4/h -mg蛋白，統(tǒng)計分析顯著高于微生物肥料常用生產(chǎn)菌種圓褐固氮菌ACCC11103的固氮酶活性25. IOOnmol C2H4/h · mg蛋白，如圖I所示。這一結(jié)果表明，本發(fā)明的芽孢桿菌(Bacillus sp. )GDSD212 CGMCC No. 5035能高效固氮。實施例3、芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035拮抗病原真菌抑菌率測定采用兩點對峙法對實施例I所得到的芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCCNo. 5035進行拮抗病原真菌抑菌率測定，具體操作如下所述在PDA平板上距離中心2cm的兩點上分別接種作物病原真菌核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)和芽孢桿菌(Bacillussp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035，每個篩選處理3個重復，以只接病原真菌不接固氮菌的平板為對照。28°C恒溫培養(yǎng)，15d后用毫米刻度尺測量對峙平板上病原真菌沿被測芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035方向的菌落半徑Γι、及對照平板上病原真菌的菌落半徑4。病原真菌生長抑制率(％)=(對照半徑對峙培養(yǎng)病原真菌菌落半徑r)/對照半徑rQX 100%。
結(jié)果顯不，菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)的 rQ 是 63. 0±2· Imm，I11 是 14.67±1. 13mm。將平均值代人上述公式計算得所述芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD212CGMCCNo. 5035對菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)的抑菌率為 76. 71 %，如圖 2所不。
權(quán)利要求
1.芽孢桿菌(Bacillussp.)⑶SD212，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC No. 5035。
2.一種菌劑，它的活性成分為權(quán)利要求I所述的芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD212CGMCC No. 5035。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的菌劑，其特征在于所述菌劑為下述I)-4)中任一的菌劑 1)用于抑制病原真菌的菌劑； 2)用于防治植物真菌病害的菌劑； 3)用于固氮的菌劑； 4)產(chǎn)生固氮酶的菌劑。
4.權(quán)利要求I所述的芽孢桿菌(Bacillussp. )GDSD212 CGMCC No. 5035在制備下述I)-4)中任一的菌劑中的應用 1)用于抑制病原真菌的菌劑； 2)用于防治植物真菌病害的菌劑； 3)用于固氮的菌劑； 4)產(chǎn)生固氮酶的菌劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的菌劑或權(quán)利要求4所述應用，其特征在于所述病原真菌為引起菌核病的真菌；所述植物真菌病害為菌核病。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的菌劑或應用，其特征在于所述引起菌核病的真菌為核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)。
7.權(quán)利要求1所述的芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035、或權(quán)利要求.2、3、5、或6所述菌劑在生產(chǎn)固氮酶中應用；或， 權(quán)利要求1所述的芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035、或權(quán)利要求2、.3、5、或6所述菌劑在生產(chǎn)生物有機肥中應用。
8.含有權(quán)利要求1所述的芽孢桿菌(Bacillussp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035、或權(quán)利要求2、3、5、或6所述菌劑的生物有機肥。
9.培養(yǎng)權(quán)利要求1所述的芽孢桿菌(Bacillussp. )GDSD212 CGMCC No. 5035的方法，包括將芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035在用于培養(yǎng)芽孢桿菌的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的步驟。
10.權(quán)利要求2、3、5或6所述菌劑的制備方法，包括如下步驟將權(quán)利要求I所述的芽孢桿菌(Bacillus sp.)⑶SD212 CGMCC No. 5035作為活性成分，得到所述菌劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了拮抗菌核病菌的固氮芽孢菌及其用途。該固氮芽孢菌是芽孢桿菌(Bacillus sp.)GDSD212，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCC No.5035。本發(fā)明所提供的芽孢桿菌(Bacillus sp.)GDSD212 CGMCC No.5035具有較高的固氮活性，可以有效拮抗菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)，在固氮微生物菌劑和生物有機肥生產(chǎn)中具有廣闊的應用前景。
文檔編號C05G3/00GK102876596SQ20111019758
公開日2013年1月16日 申請日期2011年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月15日
發(fā)明者周劍浩, 孫建光, 江峰, 徐晶, 張友恒 申請人:上海環(huán)墾生態(tài)科技有限公司, 中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所