專利名稱：：多年生固氮植物生物固氮參數(shù)b值測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種農(nóng)學(xué)領(lǐng)域?qū)Χ嗄晟痰参飶拇髿庵泄痰膮?shù)B值進(jìn)行測定的方法，本發(fā)明所述的固氮植物特別指豆科植物，如苜蓿、紅豆草、沙打旺等。
背景技術(shù)：
：測定生物固氮的方法很多，如氮累積法、乙炔還原分析法、"N整合法、全N差值法、同位素稀釋法，等。這幾種方法各有優(yōu)點(diǎn)，也有或多或少的缺點(diǎn)。乙炔還原法缺點(diǎn)是不能直接而準(zhǔn)確的獲得生物固氮量，不適于長時期田間共生固氮的定量測定,只能短時間內(nèi)測定固氮酶活性動態(tài)，長時間測定時必須考慮到周圍環(huán)境的影響。同位素稀釋法缺點(diǎn)是需要選擇參考植物,它會影響固N(yùn)量的精確性,不會造成很大的測定偏差。選取同一土壤庫中吸收養(yǎng)分相似的根系類型,有相似的N素吸收類型和生長速率。15N價格昂貴，測定手段繁瑣,易受大氣和土壤中"N的干擾。非同位素法缺點(diǎn)是時間較長,需要測定全產(chǎn),不能估計(jì)因減產(chǎn)而造成的試驗(yàn)誤差,因氮肥的施用量不同,會影響測定結(jié)果。高氮施肥水平導(dǎo)致作物從根、作物吸收的氮減少。15N自然豐度法，又被稱為S"N法，是一種新型的測定豆科植物固氮的方法。它較氮累積法、乙炔還原分析法、"N整合法、全N差值法、同位素稀釋法有著更明顯的優(yōu)勢，在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以更精確的測定固氮植物的生物固氮量。"N自然豐度法的優(yōu)點(diǎn)有a.不干擾土壤生態(tài)系統(tǒng)或野外植物；b.不需要收集根瘤；c.僅需收集莖葉材料；d.能夠估計(jì)植株整個生長季內(nèi)的固氮總量。但其缺點(diǎn)在于固氮植物和非固氮參照植物間"N豐度的差異很小，通常低于10%。，這樣，測量誤差和非大氣氮源S15N的真實(shí)差異變顯得很重要。多年生固氮植物，特別是多年生豆科植物，基于其可多次利用的生物學(xué)特點(diǎn)，而"N自然豐度法中定量生物固氮所用B值呈季節(jié)動態(tài)，無可靠值可引用，對其B值動態(tài)的測定，可以量化不同年齡多年生豆科牧草的固氮能力，估算豆科牧草對系統(tǒng)氮素產(chǎn)出的貢獻(xiàn)量。所測數(shù)據(jù)對于指導(dǎo)此類植物單播種植，或與禾本科混播，或參加豆科-糧食作物輪作，減少化學(xué)氮肥利用，降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本，增加農(nóng)民收益，并利于環(huán)境可持續(xù)發(fā)展均有積極的意義。但現(xiàn)有技術(shù)中缺少對具有固氮特性的多年生植物生物固氮參數(shù)B值的測定方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是提供一種對具有固氮特性的多年生植物生物固氮參數(shù)B值的測定方法。本發(fā)明的方法是將經(jīng)處理去除其中的氮的砂土放置于培養(yǎng)容器中，將待測植物種子種植于砂土內(nèi)，加足量無氮溶液，以提供植物生長所需的除氮以外的營養(yǎng)，每日按設(shè)計(jì)量噴灑蒸餾水補(bǔ)充水分，為防止藻類等微生物生長給檢測帶來的不利影響，可在砂土表面采取防止藻類等微生物生長的措施，待植株開花期刈割取樣，樣品殺青處理后烘干至恒重，粉碎后測評定出植物樣中的"N的自然豐度值，得到B值。本發(fā)明的方法實(shí)施中，所采用的防止藻類等微生物生長的措施是在砂土表面鋪覆一層其表面裹有蠟的砂土層。本發(fā)明的方法特別適合于測定豆科植物的固氮參數(shù)B值，在對待測植株培養(yǎng)時應(yīng)當(dāng)對其進(jìn)行根瘤菌接種。在本發(fā)明中，所使用的砂土最好是石英砂。所用的石英砂粒徑最好不大于1毫米。對石英砂處理方法是先將砂土用自來水反復(fù)沖洗至水清澈，再用12%(V/V)濃鹽酸浸泡一天后，用自來水洗凈，再用蒸餾水沖洗三次。本發(fā)明所用的營養(yǎng)液是在每升蒸餾水中含有如下組份K2HP040.087gKH2P040.068gK2S040.349gMgS04'7H200.493gCaCl20.222gFeNa2EDTA0.421g。本發(fā)明中，對前述的每升種植營養(yǎng)液中還可添加如下微量元素H3B030.003gMnCl2'4H200.0004gNaMo04.2H200.00003gCoCl2'6H200.00005gZnCl20.00002gCuCl2.2H200.00005g。本發(fā)明的測定方法中，對豆科植物在種子出苗后，取根瘤菌2g左右，加1000ml蒸餾水?dāng)嚢?，用注射器從根部注射，再次進(jìn)行根瘤菌接種，每株注射量為10mlo本發(fā)明的B值測定方法中所使用的其表面裹有蠟的砂土的制備方法是，是將石英砂進(jìn)行消毒處理和去除氮處理，然后將石英砂加熱，放入適量石蠟，待石蠟融化后與石英砂充分?jǐn)嚢杈鶆颍灥募尤肓恳允⑸氨砻婀饬燎蚁嗷ゲ划a(chǎn)生粘結(jié)為準(zhǔn)，再將其攪拌冷卻。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1.可以精確測定豆科植物的生長期內(nèi)的生物固氮量。2.矯正固氮植物在無氮基質(zhì)中產(chǎn)生的分餾部分。3.為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中豆科植物的種植提供理論基礎(chǔ)，并能有效減少化學(xué)氮肥的使用量，降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本，增加農(nóng)業(yè)收入。4.進(jìn)一步提供禾豆科牧草輪牧及混播條件下的基礎(chǔ)理論數(shù)據(jù)，使其更具農(nóng)業(yè)生產(chǎn)優(yōu)勢。具體實(shí)施例方式以下提供本發(fā)明的一個實(shí)施例，這一實(shí)施例是以多年生植物紫花苜蓿為待檢測植物。選取顆粒飽滿的紫花苜蓿種子500粒，用0.5%NaClO消毒30分鐘后自來水沖洗再用蒸餾水洗凈，用根瘤菌對種子進(jìn)行浸泡接種24h處理，然后置室內(nèi)自然晾干待用。本實(shí)施例中所用的根瘤菌均為商業(yè)購買的苜蓿根瘤菌。選取石英砂兩桶，自來水洗至清澈見底即可，再用濃鹽酸將石英砂浸泡一天，然后用自來水洗凈，再用蒸餾水沖洗三次，以確保實(shí)驗(yàn)中無外源氮的進(jìn)入。取直徑15cm的小桶9個，各桶下鉆均勻分布的小孔，將洗凈砂子裝入小桶內(nèi)，砂子高度約20cm，濾去砂子中多余的水分，在小桶下置直徑約25cm小盆。將消毒過的苜蓿種子均勻播于桶內(nèi)砂子表面，用于無氮培養(yǎng)溶液的添加和補(bǔ)充，生長初期用無氮營養(yǎng)液澆透，并使無氮營養(yǎng)液從小桶中漏入桶下的小盆內(nèi)達(dá)適當(dāng)?shù)母叨?，使小桶底部的砂與液面相接觸。生長初期所用無氮營養(yǎng)液是用蒸餾水將全濃度營養(yǎng)液稀釋到1/10的液體，然后每日以蒸餾水補(bǔ)充蒸發(fā)的水分，在植株生長的3周間隔至12周逐漸過渡到完全濃度的營養(yǎng)液，每周更換營養(yǎng)液。為防止?fàn)I養(yǎng)元素富集對植物生長造成毒害等負(fù)面影響，需每月一次用蒸餾水淋洗桶內(nèi)石英砂一次。培養(yǎng)15周至植物花期，用噴壺在表層噴灑蒸餾水至表層砂子濕透，置于溫室培養(yǎng)一周。一周內(nèi)，每日噴灑蒸餾水兩次，早晚各一次。所用的全濃度營養(yǎng)液由每升蒸餾水含如下成分構(gòu)成0.087g，KH2P040.068g，0.349g，MgS04-7H200.493g，0.222g，F(xiàn)eNa2EDTA0.421g，0細(xì)g，MnCl2.4H200.0004g，K2HPQK2S04CaCl2H3B03NaMo04.2H200.00003g，CoCl2.6H200.00005g，ZnCl20.00002g，CuCl2'2H200.00005g。配制營養(yǎng)液組份時各組份誤差不大于所使用天平誤差即可。在植物生長過程中石英砂表層會生長藻類，藻類對養(yǎng)分需求會導(dǎo)致測定的不準(zhǔn)確性。為避免這種情況發(fā)生，在出苗后在砂表層撒一層約0.5cm其表面裹有蠟的砂進(jìn)行覆蓋，通過石英砂裹蠟處理后鋪于表面，既可防水又可遮光，可杜絕藻類的生長。其表面裹有蠟的砂土的制備方法是先將石英砂進(jìn)行消毒處理和去除氮處理，然后將石英砂加熱，放入適量石蠟，待石蠟融化后與石英砂充分?jǐn)嚢杈鶆颍僭跀嚢柘聦⑵淅鋮s，石蠟加入的量以石英砂表面光亮且相互不產(chǎn)生粘結(jié)為準(zhǔn)。在苜蓿種子出苗后，可再次進(jìn)行根瘤菌接種，其做法是取根瘤菌2g左右，加1000ml蒸餾水?dāng)嚢?，用注射器向植株的根部注射，注射量約為10ml/株。在植株初生長的兩月以內(nèi)，共進(jìn)行8次接種，以確保接種成功。在整個的實(shí)驗(yàn)過程中，溫室控制在溫度25。C士5i:，光照晝夜16h/8h，光照為10120LX，并保持實(shí)驗(yàn)室良好通風(fēng)。待測植株培養(yǎng)15周至植物花期，刈割地上部分植物，烘干粉碎，置4。C冰箱保存，同位素質(zhì)譜儀測定15N自然豐度固氮百分率，即B值，對已割植株繼續(xù)按以上方法進(jìn)行培養(yǎng)，可獲長期B值動態(tài)。實(shí)測值見下表。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>以上方法用于對紅豆草、沙打旺等其他的多年生豆科植物B值測定，可分別測出這些植物不同生長時間的B值。權(quán)利要求1.具有固氮特性的多年生植物生物固氮參數(shù)B值測定方法，其特征將經(jīng)處理去除其中的氮的砂土放置于培養(yǎng)容器，將待測植物種子種植于砂土內(nèi)，并在砂土表面采取防止藻類等微生物生長的措施，加足量無氮溶液，以提供植物生長所需的除氮以外的營養(yǎng)，每日按設(shè)計(jì)量噴灑蒸餾水補(bǔ)充水分，待植株成熟后刈割取樣，樣品殺青處理后烘干至衡重，粉碎后測評定出植物樣中的15N的自然豐度值，得到B值。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有固氮特性的多年生植物生物固氮參數(shù)B值測定方法，其特征是在砂土表面采取的防止藻類等微生物生長的措施是在砂土表面鋪覆一層其表面裹有蠟的砂土層。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的具有固氮特性的多年生植物生物固氮參數(shù)B值測定方法，其特征是測定的植物為豆科植物，在對待測植株培養(yǎng)時對其進(jìn)行根瘤菌接種。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的具有固氮特性的多年生植物生物固氮參數(shù)B值測定方法，其特征是所用的砂土是粒徑小于1毫米的石英砂，處理方法是先將砂用自來水反復(fù)沖洗至水清澈，再用體積比為12%的鹽酸浸泡一天后，用自來水洗凈，再用蒸餾水沖洗三次，所用的營養(yǎng)液是在每升蒸餾水中含有K2HP040.087g/KH2P040.068gK2S040.349gMgS04.7H200.493gCaCl20.222gFeNa2EDTA0.42lg。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的具有固氮特性的多年生植物生物固氮參數(shù)B值測定方法，其特征是所用的每升營養(yǎng)液中還有H3B030.003gMnCl2-4H200.0004gNaMo04.2H200.00003gCoCl2.6H200.00005gZnCl20.00002gCuCl2.2H2000005g。6.根據(jù)權(quán)利要求3或4或5所述的具有固氮特性的多年生植物生物固氮參數(shù)B值測定方法，其特征是根瘤菌接種是在種子出苗后，取根瘤菌2g左右，加1000ml蒸餾水?dāng)嚢?，用注射器從近根部注射接種，每植株注射量為10ml。7.權(quán)利要求2至6所述的任一具有固氮特性的多年生植物生物固氮參數(shù)B值測定方法中所使用的其表面裹有蠟的砂土的制備方法，其特征是將石英砂進(jìn)行消毒處理和去除氮處理，然后將石英砂加熱，放入適量石蠟，待石蠟融化后與石英砂充分?jǐn)嚢杈鶆?，再在攪拌下將其冷卻，石蠟加入的量以石英砂表面光亮且相互不產(chǎn)生粘結(jié)為準(zhǔn)。全文摘要本發(fā)明公開一種農(nóng)學(xué)領(lǐng)域?qū)Χ嗄晟痰参飶拇髿庵泄痰膮?shù)B值進(jìn)行測定的方法，本發(fā)明所述的固氮植物特別指豆科植物，如苜蓿、紅豆草、沙打旺等。本發(fā)明的方法是將經(jīng)處理去除其中的氮的砂土放置于培養(yǎng)容器內(nèi)，將待測植物種子種植于砂土內(nèi)，并可在砂土表面采取防止藻類等微生物生長的措施，加足量無氮溶液，以提供植物生長所需的除氮以外的營養(yǎng)，每日按設(shè)計(jì)量噴灑蒸餾水補(bǔ)充水分，待植株開花期刈割取樣，經(jīng)殺青處理后烘干至恒重，粉碎后測評定植物樣中的¹⁵N的自然豐度值，得到B值。文檔編號G01N33/00GK101285810SQ20081009879公開日2008年10月15日申請日期2008年5月29日優(yōu)先權(quán)日2008年5月29日發(fā)明者楊子文,沈禹穎,王先之,妮陸申請人:蘭州大學(xué)