專利名稱：一株高效固氮的紫云英根瘤菌及其培養(yǎng)方法與它的用途的制作方法
一株高效固氮的紫云英根瘤菌及其培養(yǎng)方法與它的用途
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于根瘤菌技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一株高效固氮紫云英根瘤菌， 還涉及所述根瘤菌的培養(yǎng)方法以及它的用途。
背景技術(shù)：
紫云英是一種豆科黃芪屬越年生草本植物，其產(chǎn)青量高、肥質(zhì)好、養(yǎng)分高、易腐熟、 肥效大、持久性好，是一種優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的有機(jī)肥料。紫云英能大量增加土壤有機(jī)質(zhì)，增強(qiáng)土壤的保水、保肥、保溫性能。紫云英通常在秋季套播于晚稻田中，作早稻的基肥，可解決雙季稻的肥料問題，是我國稻田最主要的冬季綠肥作物。紫云英根瘤菌(lihizobium astragula)可侵入紫云英根部，與紫云英進(jìn)行共生固氮。紫云英生長的狀態(tài)，尤其是生地種植，關(guān)鍵取決于其接種劑-紫云英根瘤菌，紫云英根瘤菌與紫云英種子的接種組合，已成為紫云英種植一項必不可少的接種技術(shù)。我國紫云英根瘤菌的研究起步較早，早在上世紀(jì)40年代陳華癸先生就發(fā)現(xiàn)紫云英根瘤菌和紫云英是一個獨(dú)特的互接族群，但是目前，紫云英根瘤菌生產(chǎn)菌種普遍存在結(jié)瘤能力差、固氮能力弱等問題。培養(yǎng)根瘤菌的通用傳統(tǒng)培養(yǎng)基為YEM培養(yǎng)基，其組成成分為甘露醇10g/L，酵母膏1.0g/L，K2HPO4 0. 5g/L, MgSO4 0. 5g/L, NaCl 0. 2g/L。其中，主要成分甘露醇和酵母膏的價格較高，從而直接造成其發(fā)酵成本高，于是制約了根瘤菌的工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明人經(jīng)過大量實驗研究，分離選育出具有結(jié)瘤固氮能力強(qiáng)的紫云英根瘤菌菌株，并且從替換碳氮源入手，通過改良培養(yǎng)基，有效降低了生產(chǎn)成本，并提高了發(fā)酵水平，適合大規(guī)模生產(chǎn)，適應(yīng)我國紫云英根瘤菌生產(chǎn)以及發(fā)展紫云英種植的要求。

發(fā)明內(nèi)容[要解決的技術(shù)問題]本發(fā)明的目的是提供一株高效固氮的紫云英根瘤菌。本發(fā)明的另一個目的是提供所述高效固氮的紫云英根瘤菌的培養(yǎng)方法。本發(fā)明的另一個目的是提供所述高效固氮的紫云英根瘤菌制成的菌劑。本發(fā)明的另一個目的是提供所述高效固氮的紫云英根瘤菌劑的用途。[技術(shù)方案]本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)的。本發(fā)明涉及一株高效固氮的紫云英根瘤菌(lihizobium astragula) CGMCC No. 4；347。本發(fā)明還涉及所述紫云英根瘤菌CGMCC No. 4347的培養(yǎng)方法。該方法的步驟如下(1)菌種的活化接種紫云英根瘤菌(Rhizobium astragula) CGMCCNo. 4347至斜面培養(yǎng)基，在溫度下培養(yǎng)72小時；
所述的斜面培養(yǎng)基組成如下甘露醇10g/L、酵母膏1. Og/L、磷酸氫二鉀0. 5g/L、 硫酸鎂 0. 5g/L、氯化鈉 0. 2g/L、瓊脂 18g/L，ρΗ6· 8 7. 0 ；(2)種子培養(yǎng)將活化菌種轉(zhuǎn)接至滅菌液體培養(yǎng)基中，在溫度與160 180rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)48小時；所述的種子培養(yǎng)基組成如下甘露醇10g/L、酵母膏1. Og/L、磷酸氫二鉀0. 5g/L、 硫酸鎂 0. 5g/L、氯化鈉 0. 2g/L，ρΗ6· 8 7. 0 ；(3)發(fā)酵培養(yǎng)以體積計按照接種量將步驟幻得到的種子液轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度與150rpm的條件下培養(yǎng)48小時，得到所述液體紫云英根瘤菌CGMCC No. 4347 菌劑；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下大豆糖蜜9g/L、甘露醇lg/L、酵母膏0. 2g/L、谷氨酸鈉 0. 8g/L、磷酸氫二鉀 0. 5g/L、硫酸鎂 0. 5g/L、氯化鈉 0. 2g/L，ρΗ6· 8 7. 0。根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，采用本發(fā)明培養(yǎng)方法所得到的液體紫云英根瘤菌劑活菌數(shù)達(dá)到125ml以上。根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，根據(jù)權(quán)利要求2所述培養(yǎng)方法得到的液體紫云英根瘤菌CGMCC No. 4347菌劑與經(jīng)滅菌的pH值7.0 7. 2的草炭按照重量份比1 2 4混合，然后在溫度的條件下增殖培養(yǎng)12 36小時，得到活菌數(shù)大于5億/g的固體紫云英根瘤菌CGMCC No. 4347菌劑。根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，所述的草炭為80 150目。根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，所述的草炭在溫度121°C下滅菌0. 5 1. 5小時。根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，在溫度的條件下增殖培養(yǎng)20 觀小時。本發(fā)明還涉及所述紫云英根瘤菌菌劑在種植紫云英中的用途。根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，在種植紫云英時，按照每畝地為采用本發(fā)明方法制備的液體紫云英根瘤菌劑20 40ml與紫云英種子1. 5 2. 5kg的比例，將紫云英根瘤菌劑與紫云英種子混拌均勻，然后播種。根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，在種植紫云英時，按照每畝地為采用本發(fā)明方法制備的固體紫云英根瘤菌劑150 250g與紫云英種子1. 5 2. 5kg的比例，將紫云英根瘤菌劑與紫云英種子混拌均勻，然后播種。下面將更詳細(xì)地描述本發(fā)明。本發(fā)明涉及一株高效固氮的紫云英根瘤菌(lihizobium astragula) CGMCC No. 4347。該菌株已于2010年11月15日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，簡稱 CGMCC，保藏編號 CGMCC No. 4347 本發(fā)明的紫云英根瘤菌CGMCC No. 4347菌株是從浙江省采集野生紫云英根瘤，采用從根瘤中分離根瘤菌的常規(guī)方法分離篩選獲得的，具體方法參見聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織編寫的《共生固氮技術(shù)手冊》。紫云英根瘤菌CGMCC No. 4347，屬革蘭氏陰性桿菌，小的短桿狀，無芽孢，具有周生鞭毛，能運(yùn)動。紫云英根瘤菌CGMCC No. 4347在酵母膏甘露醇瓊脂培養(yǎng)基上生長3 5天，菌落呈圓形，邊緣整齊，稍突起，半透明，具有粘質(zhì)感。
紫云英根瘤菌CGMCC No. 4347需好氧發(fā)酵培養(yǎng)，最適生長溫度為，最適pH為 6. 8 7. 0，在菌體生長期會降低到5. 0 6. 5。本發(fā)明還涉及所述紫云英根瘤菌CGMCC No. 4347的培養(yǎng)方法。該方法的步驟如下(1)菌種的活化接種紫云英根瘤菌(Rhizobium astragula) CGMCCNo. 4347至斜面培養(yǎng)基，在溫度下培養(yǎng)72小時；所述的斜面培養(yǎng)基組成如下甘露醇10g/L、酵母膏1. Og/L、磷酸氫二鉀0. 5g/L、 硫酸鎂 0. 5g/L、氯化鈉 0. 2g/L、瓊脂 18g/L，ρΗ6· 8 7. 0。(2)種子培養(yǎng)將活化菌種轉(zhuǎn)接至滅菌液體培養(yǎng)基中，在溫度與160 180rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)48小時；所述的種子培養(yǎng)基組成如下甘露醇10g/L、酵母膏1. Og/L、磷酸氫二鉀0. 5g/L、 硫酸鎂 0. 5g/L、氯化鈉 0. 2g/L，ρΗ6· 8 7. 0。(3)發(fā)酵培養(yǎng)以體積計按照接種量將步驟幻得到的種子液轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度與150rpm的條件下培養(yǎng)48小時，得到所述液體紫云英根瘤菌CGMCC No. 4347 菌劑；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下大豆糖蜜9g/L、甘露醇lg/L、酵母膏0. 2g/L、谷氨酸鈉 0. 8g/L、磷酸氫二鉀 0. 5g/L、硫酸鎂 0. 5g/L、氯化鈉 0. 2g/L，ρΗ6· 8 7. 0。目前，培養(yǎng)根瘤菌的常規(guī)培養(yǎng)基為YEM培養(yǎng)基，其組成如下甘露醇10g/L，酵母膏 1. 0g/L，磷酸氫二鉀0. 5g/L，硫酸鎂0. 5g/L，氯化鈉0. 2g/L。本發(fā)明對該YEM培養(yǎng)基進(jìn)行了修改，增加了工業(yè)副產(chǎn)物大豆糖蜜碳源，廉價原料谷氨酸鈉氮源，通過選擇不同的配比，測定發(fā)酵液的最終活菌數(shù)，對發(fā)酵水平進(jìn)行評價，最后確定本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基。大豆糖蜜富含大豆低聚糖、大豆異黃酮、大豆皂苷。還含有少量蛋白質(zhì)、脂類物質(zhì)、 酚酸及果膠質(zhì)和其它糖類等。它富含雙歧桿菌因子和蔗糖等，可作為能量源和營養(yǎng)素添加在反芻動物和禽類飼料中，降低飼料生產(chǎn)成本，提高飼料適口性，增加動物采食量，例如山東普爾科技有限公司、秦皇島金海糧油工業(yè)有限公司、石家莊工大生物制品有限公司生產(chǎn)的大豆糖蜜。谷氨酸鈉是目前市場廣泛銷售的產(chǎn)品，例如上海嘉利知源實業(yè)有限公司、中化河北進(jìn)出口公司秦皇島公司銷售的谷氨酸鈉。所述的斜面培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基所使用的原料都是目前市場上銷售的在菌種培養(yǎng)中通常使用的原料。所述的斜面培養(yǎng)、種子培養(yǎng)與發(fā)酵培養(yǎng)所使用的設(shè)備與器具都是目前市場上銷售的在菌種培養(yǎng)中通常使用的設(shè)備與器具，這些設(shè)備與器具消毒處理都是常規(guī)的。運(yùn)用本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的稀釋平板計數(shù)法，測定了采用本發(fā)明培養(yǎng)方法得到的液體紫云英根瘤菌劑，確定液體紫云英根瘤菌劑活菌數(shù)是125億/ml以上。本發(fā)明還涉及利用所述紫云英根瘤菌CGMCC No. 4347制成的固體菌劑。所述固體菌劑中添加草炭，草炭細(xì)度為80 150目，所述紫云英根瘤菌CGMCC No. 4347菌液與草炭的重量份數(shù)比為1 2 4。所述固體菌劑的生產(chǎn)方法是將經(jīng)本發(fā)明培養(yǎng)方法發(fā)酵所得到的液體紫云英根瘤菌CGMCC No. 4347菌劑與滅菌的pH值7.0 7. 2的草炭按重量比1 2 4混勻，再在條件下增殖培養(yǎng)12 36小時。所述的草炭在使用前需要按照常規(guī)方法進(jìn)行干燥，使干燥草炭的水分含量達(dá)到 5.0重量％以下。所述草炭與液體紫云英根瘤菌CGMCC No. 4347菌劑混合前需要通過80 150目篩，優(yōu)選為100目篩。草炭與所述液體菌劑混合前需要進(jìn)行滅菌，其滅菌條件為在溫度121°C下滅菌 0. 5 1. 5小時。本發(fā)明還涉及采用本發(fā)明得到的紫云英根瘤菌劑在種植紫云英中的用途。在種植紫云英時，按照每畝地為按照本發(fā)明方法制備的液體紫云英根瘤菌劑 20 40ml與紫云英種子1. 5 2. 5kg的比例，將紫云英根瘤菌劑與紫云英種子混拌均勻， 然后播種。在種植紫云英時，按照每畝地為按照本發(fā)明方法制備的固體紫云英根瘤菌劑 150 250g與紫云英種子1. 5 2. 5kg的比例，將紫云英根瘤菌劑與紫云英種子混拌均勻， 然后播種。[有益效果]本發(fā)明具有下述有益效果采用本發(fā)明改進(jìn)的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)時，本發(fā)明高效固氮紫云英根瘤菌CGMCC No. 4347發(fā)酵液活菌數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于現(xiàn)有技術(shù)。本發(fā)明高效固氮紫云英根瘤菌劑接種于紫云英， 與不接菌相比，可使紫云英植株鮮重增加241 %以上，植株含氮量增加86 %以上，產(chǎn)量增加 47%以上；與現(xiàn)有生產(chǎn)菌株相比，紫云英植株鮮重增加58%以上，植株含氮量增加18%以上，產(chǎn)量增加12%以上，是紫云英根瘤菌生產(chǎn)及紫云英接種的優(yōu)良菌株。本發(fā)明的紫云英根瘤菌CGMCC No. 4347的培養(yǎng)方法簡便易行，所用培養(yǎng)基原料來源廣泛，價格低廉，適合大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明所述的紫云英根瘤菌(Rhizobium astragula)已于2010年11月15日被保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 4347。
具體實施方式實施例1 紫云英根瘤菌CGMCC No. 4347的培養(yǎng)培養(yǎng)步驟如下制備斜面培養(yǎng)基按照甘露醇10g/L、酵母膏1. Og/L、磷酸氫二鉀0. 5g/L、硫酸鎂 0. 5g/L、氯化鈉0. 2g/L、瓊脂18g/L分別準(zhǔn)確稱取甘露醇、酵母膏、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鈉和瓊脂，然后用水溶解，溶解完全后用酸或堿調(diào)節(jié)達(dá)到PH6. 8 7. 0，再補(bǔ)充水達(dá)到上述濃度，待混合均勻后，分裝到試管中，在溫度121°C下高壓滅菌30分鐘后，趁熱將試管斜放，制成斜面培養(yǎng)基。制備種子培養(yǎng)基按照甘露醇10g/L、酵母膏1. Og/L、磷酸氫二鉀0. 5g/L、硫酸鎂 0. 5g/L、氯化鈉0. 2g/L分別準(zhǔn)確稱取甘露醇、酵母膏、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鈉，然后用水溶解，溶解完全后用酸或堿調(diào)節(jié)達(dá)到PH6. 8 7. 0，再補(bǔ)充水達(dá)到上述濃度，待混合均勻后，分裝到三角瓶中在溫度121°C下高壓滅菌30分鐘。制備發(fā)酵培養(yǎng)基按照大豆糖蜜9g/L、甘露醇lg/L、酵母膏0. 2g/L、谷氨酸鈉 0. 8g/L、磷酸氫二鉀0. 5g/L、硫酸鎂0. 5g/L、氯化鈉0. 2g/L分別準(zhǔn)確稱取大豆糖蜜、甘露醇、酵母膏、谷氨酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鈉，然后用水溶解，溶解完全后用酸或堿調(diào)節(jié)達(dá)到pH6. 8 7. 0，再補(bǔ)充水達(dá)到上述濃度待混合均勻后，分裝到發(fā)酵罐中在溫度121°C 下高壓滅菌30分鐘。首先，菌種的活化接種紫云英根瘤菌O^hizobium astragula) CGMCCNo. 4347至上述制備的斜面培養(yǎng)基，在溫度下培養(yǎng)72小時。然后，種子培養(yǎng)將活化菌種轉(zhuǎn)接至上述制備的種子液體培養(yǎng)基中，在溫度與160 180rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)48小時；發(fā)酵培養(yǎng)以體積計按照接種量將前面步驟得到的種子液轉(zhuǎn)接入上述制備的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度與150rpm的條件下培養(yǎng)48小時，得到活菌數(shù)為125. 6億/ml的液體紫云英根瘤菌CGMCC No. 4347菌劑。實施例2 優(yōu)化紫云英根瘤菌CGMCC No. 4347發(fā)酵培養(yǎng)基選擇價格低廉的工業(yè)副產(chǎn)物大豆糖蜜作為碳源，代替YEM培養(yǎng)基中的一部分碳源甘露醇；選擇谷氨酸鈉作為氮源，代替YEM培養(yǎng)基中的一部分氮源酵母膏。按照與實施例1 同樣的培養(yǎng)方法進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化。其中，大豆糖蜜需先進(jìn)行水解，。具體方法為將濃硫酸(18. 4mol/L)用水稀釋至 lmol/L，然后將固形物含量60%的大豆糖蜜與稀釋后的lmol/L硫酸等體積混合，在溫度 121°C下滅菌進(jìn)行水解。在現(xiàn)有YEM培養(yǎng)基中只是改變碳源而不改變其它成分時的試驗結(jié)果列于表1中。表1 紫云英根瘤菌CGMCC No. 4347培養(yǎng)基碳源替代試驗結(jié)果(按重量計，每升)

在現(xiàn)有YEM培養(yǎng)基中只是改變氮源而不改變其它成分時的試驗結(jié)果列于表2中。表2 紫云英根瘤菌CGMCC No. 4347培養(yǎng)基氮源的替代試驗結(jié)果(按重量計，每升)
權(quán)利要求
1.一株高效固氮的紫云英根瘤菌(Rhizobium astragula) CGMCCNo. 4347
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述紫云英根瘤菌CGMCCNo. 4347的培養(yǎng)方法，其特征在于該方法的步驟如下(1)菌種的活化接種紫云英根瘤菌(Rhizobiumastragula) CGMCC No. 4347至斜面培養(yǎng)基，在溫度下培養(yǎng)72小時；所述的斜面培養(yǎng)基組成如下甘露醇10g/L、酵母膏1. Og/L、磷酸氫二鉀0. 5g/L、硫酸鎂 0. 5g/L、氯化鈉 0. 2g/L、瓊脂 18g/L，ρΗ6· 8 7. 0 ；(2)種子培養(yǎng)將活化菌種轉(zhuǎn)接至滅菌液體培養(yǎng)基中，在溫度與160 ISOrpm條件下?lián)u床培養(yǎng)48小時；所述的種子培養(yǎng)基組成如下甘露醇10g/L、酵母膏1. 0g/L、磷酸氫二鉀0. 5g/L、硫酸鎂 0. 5g/L、氯化鈉 0. 2g/L，ρΗ6· 8 7. 0 ；(3)發(fā)酵培養(yǎng)以體積計按照接種量將步驟幻得到的種子液轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基中， 在溫度與150rpm的條件下培養(yǎng)48小時，得到所述液體紫云英根瘤菌劑；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下大豆糖蜜9g/L、甘露醇lg/L、酵母膏0. 2g/L、谷氨酸鈉 0. 8g/L、磷酸氫二鉀 0. 5g/L、硫酸鎂 0. 5g/L、氯化鈉 0. 2g/L，ρΗ6· 8 7. 0。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所得到的液體紫云英根瘤菌CGMCC No. 4347菌劑活菌數(shù)達(dá)到125億/ml以上。
4.一種固體紫云英根瘤菌CGMCC No. 4347菌劑的生產(chǎn)方法，其特征在于根據(jù)權(quán)利要求 2所述培養(yǎng)方法得到的液體紫云英根瘤菌CGMCC No. 4347菌劑與經(jīng)滅菌的pH值7. 0 7. 2 的草炭按照重量份比1 2 4混合，然后在溫度的條件下增殖培養(yǎng)12 36小時，得到活菌數(shù)大于5億/g的固體紫云英根瘤菌CGMCC No. 4347菌劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法所述的草炭為80 150目。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述的草炭在溫度1211下滅菌0.5-1.5 小時。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于在溫度的條件下增殖培養(yǎng)20 觀小時。
8.根據(jù)權(quán)利要求2-7中任一權(quán)利要求所述方法得到的紫云英根瘤菌菌劑在種植紫云英中的用途。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于在種植紫云英時，按照每畝地為根據(jù)權(quán)利要求2所述方法制備的液體紫云英根瘤菌劑20 40ml與紫云英種子1. 5 2. 5kg的比例， 將紫云英根瘤菌劑與紫云英種子混拌均勻，然后播種。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于在種植紫云英時，按照每畝地為根據(jù)權(quán)利要求4所述方法制備的固體紫云英根瘤菌劑150 250g與紫云英種子1. 5 2. 5kg的比例，將紫云英根瘤菌劑與紫云英種子混拌均勻，然后播種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株高效固氮紫云英根瘤菌及其培養(yǎng)方法與它的用途。本發(fā)明的紫云英根瘤菌CGMCC No.4347采用菌種的活化、種子培養(yǎng)與發(fā)酵培養(yǎng)等步驟進(jìn)行培養(yǎng)。采用本發(fā)明改進(jìn)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)時，發(fā)酵液活菌數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于現(xiàn)有技術(shù)。本發(fā)明高效固氮紫云英根瘤菌劑接種于紫云英，與不接菌相比，可使紫云英植株鮮重增加241％以上，植株含氮量增加86％以上，產(chǎn)量增加47％以上；與現(xiàn)有生產(chǎn)菌株相比，紫云英植株鮮重增加58％以上，植株含氮量增加18％以上，產(chǎn)量增加12％以上，是紫云英根瘤菌生產(chǎn)及紫云英接種的優(yōu)良菌株。本發(fā)明所述培養(yǎng)方法簡便易行，原料來源廣泛、價格低廉，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12N1/20GK102174429SQ20101061393
公開日2011年9月7日 申請日期2010年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月30日
發(fā)明者劉書君, 徐志文, 杜迎輝, 蘇海榆, 高玉爽 申請人:領(lǐng)先生物農(nóng)業(yè)股份有限公司