專利名稱：棕色固氮菌pcr檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種試劑盒，尤其是一種棕色固氮菌PCR檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
棕色固氮菌為有益微生物，被列入國內(nèi)外微生物肥料菌種目錄。1990年以來，國內(nèi)外眾多學(xué)者對(duì)棕色固氮菌藻酸鹽基因和固氮酶基因進(jìn)行了分析研究。由棕色固氮菌產(chǎn)生的藻聚糖(又稱藻酸鹽)與從天然海洋褐藻中提取的藻聚糖具有相似的功能和作用(Rehm，B.
H.A. , and S. Valla. 1997; Uwe Remminghorst and Bernd H. A. Rehm, 2006),可作外科敷料、牙模、食品及藥物緩釋劑等用途，或是用作固定化酶和細(xì)胞工程方面。目前，通過引物設(shè)計(jì)和模板制備建立針對(duì)棕色固氮菌固氮酶基因和藻酸鹽algE，algj, algC等基因的PCR方法具有較高的適用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種棕色固氮菌PCR檢測試劑盒，它可以提高棕色固氮菌地方株的檢出率。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的棕色固氮菌PCR檢測試劑盒，它包括4.5ul質(zhì)量百分比濃度為50%的甘油、1. Oul 二甲基亞砜、2ul dNTP, dNTP中的ATP, GTP, TTP及CTP均為
2.5mol/ L、2. Oul 濃度為 25 mmol/ L Tris_HCl、2ul 濃度為 25mmol/ L 的 MgCl2、0. 5ul濃度為2U/ul的Taq酶、引物兩條，均為1.0ul、11.0ul超純水、2ul DL2000 DNA Marker、2ul陽性對(duì)照及2ul陰性對(duì)照；每次PCR反應(yīng)加入DNA模板O. 5 1. 5ul ;其中引物包括上游引物及下游引物，上 游引物的序列為5 ’ -GACCTTGCCGCTGGTGTTG-3 ’，下游引物的序列為5’ -CGCCGAGCAGTTCGTTTT-3’。陰性對(duì)照為超純水。陽性對(duì)照為棕色固氮菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA模板或重組質(zhì)粒pGEMT Easy: algE的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。為了驗(yàn)證本發(fā)明的效果進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)
I材料與方法1.1材料1.1.1菌株
大腸埃希氏桿菌，沙門氏菌、土壤放線桿菌等均由本實(shí)驗(yàn)室從環(huán)境中分離保存。棕色固氮菌地方株由非豆科作物根際土壤中分離；棕色固氮菌標(biāo)準(zhǔn)菌株購于上海富眾(亞平寧)生物科技發(fā)展有限公司。1.1.2酶及試劑
TaqDNA 聚合酶、dNTP (mix) > Marker2000> ProteinaseK、RNaseA、生化微量鑒定管、pGEMTEasy等由New England Biolab公司、Pomega公司、大連寶生生物有限公司和恒因生物公司提供。乙酸鈉、冰乙酸、乙醇、結(jié)晶紫等常用試劑均為國產(chǎn)分析純，由北京三藥科技開發(fā)公司購入。無氮源培養(yǎng)基由上海富眾(亞平寧)生物科技發(fā)展有限公司購入或自配。DNA提取試劑盒由恒因生物技術(shù)公司購入；革蘭氏染色液自配。1.1.3儀器設(shè)備
梯度PCR擴(kuò)增儀(德國)；紫外光分光光度計(jì)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國)；凝膠成像分析系統(tǒng)；核酸電泳系統(tǒng)；酸度計(jì)(德國);超純水器(10L);控溫、控濕全自動(dòng)生化培養(yǎng)箱；臥式高壓消毒柜；歐林巴氏顯微鏡系列(攝影顯微鏡、光學(xué)顯微鏡、瑩光顯微鏡、倒置顯微鏡)；超凈工作臺(tái)(單人雙面)以及其它常規(guī)儀器設(shè)備。1. 2 方法1.2.1固氮菌分離培養(yǎng)
分別從土壤的表層(如大田和園田的表層土壤、花盆中的表層土)中采集土樣3 5g，用50mL水制成混濁液，吸取5mL懸浮液裝入盛有30mL富集培養(yǎng)液的250mL三角瓶中，100rpm，28°C，培養(yǎng)3 5天。取富集培養(yǎng)后的培養(yǎng)液，稀釋涂布平板分離培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)2天。之后生長較大的菌落移入斜面。1.2. 2 鏡檢
取滅菌過的載玻片，在載玻片中央滴一滴無菌水。然后在火焰旁，用滅過菌的接種環(huán)從培養(yǎng)基上挑取少許黏液涂在載玻片的水滴中，革蘭氏染色，涂片自然干燥；依次在低倍鏡和高倍鏡觀察，仔細(xì)觀察各種自 生固氮菌的形態(tài)和大小。1. 2. 3棕色固氮菌生化鑒定
取2只淀粉，甘露醇，鼠李糖，乳糖，硝酸鹽，過氧化氫酶，鑰酸鹽生化微量鑒定管接種培養(yǎng)物，恒溫箱培養(yǎng)24— 36h。1. 2. 4固氮酶活性測定
微量凱氏定氮法，用以下公式計(jì)算含氮量
E42=((n~F2) X14X1000)/K(mg/L)
Vl :樣品滴定時(shí)用去的O. OlN標(biāo)準(zhǔn)硫酸溶液毫升數(shù)；
V2 :空白滴定時(shí)用去的O. OlN標(biāo)準(zhǔn)硫酸溶液毫升數(shù)；
14 :是I個(gè)毫克當(dāng)量氮的毫克數(shù)；
K:發(fā)酵液樣品毫升數(shù)。1. 2. 5 PCR引物的選擇
1.2. 5.1 PCR引物的選擇，設(shè)計(jì)與合成
按菌株 Azotobacter vinelandii DJ chromosome algE 基因(GenBank 登錄號(hào)CP001157,菌株)自行設(shè)計(jì)的一對(duì)引物為上游引物5’ -GACCTTGCCGCTGGTGTTG-3’，下游引物5’-CGCCGAGCAGTTCGTTTT-3’。由上海生物技術(shù)公司合成，其預(yù)期擴(kuò)增片段長度為850bp。并用DNAstar軟件和BLAST分析比較引物的各個(gè)參數(shù)和同源性。1. 2. 5. 2 DNA 的提取
挑取少許菌落于1. 5ml離心管中加入TE緩沖液稀釋至微濁，取Iml裝入離心管中9000r/min離心10秒，棄上清，在細(xì)菌沉淀管中加入20ulDB液,160ulIysozyme和20ulRNaseA，徹底振蕩懸浮，3 7 °C溫浴45分鐘，期間來回顛倒離心管數(shù)次。加入400ulDL和25ul蛋白消化酶K (ProteinaseK)迅速溫和地來回顛倒離心管徹底混勻。置65°C溫浴45分鐘，離心I分鐘，取上清液。加入200ul異丙醇，劇烈顛倒離心管使溶液混合后，移取600ul至吸附柱中，離心30秒。棄去收集管中的液體，將吸附柱放入同一個(gè)收集管中。將剩余的全部移至吸附柱中，離心30秒。棄去收集管中的液體，將吸附柱放入同一個(gè)收集管中。加入500ulWl液，靜置一分鐘后，離心30秒。將吸附柱放入另外一個(gè)收集管中。加入500ulWl液，離心15秒。棄掉收集管中的液體，再將吸附柱放入同一個(gè)收集管中。離心I分鐘。將吸附柱移入一個(gè)干凈的1.5ml離心管中。在吸附膜中央加入100 UlTl液，65°C靜置5分鐘后，離心I分鐘。將1. 5ml離心管(DNA) 4°C保存?zhèn)溆??；騾⒄誃irnboim and Doly (1979)提供的方法提取樣品DNA。挑取數(shù)個(gè)菌落懸浮于含100 μ L超純水的小試管中，震蕩混勻，用PCR儀95°C加熱10 min或煮沸10 min后置于冰上冷卻15 min, 12 000 r / min離心2 min，取上清作為PCR反應(yīng)的粗制DNA模板，
置-20 °C保存?zhèn)溆谩?.2.5.3棕色固氮菌algE基因的PCR擴(kuò)増
4. 5ul質(zhì)量百分比濃度為50%的Glycerol (甘油)、L0ul DMSO (二甲基亞砜)、2uldNTP (脫氧核糖核苷三磷酸)(各2.5mol/ L)、2. Oul濃度為25 mmol/ L Tris_HCl、2ul濃度為25mmol/ L的MgCl2、0. 5ul濃度為2U/ul的Taq酶、引物兩條，均為1. Oul、11. Oul超純水、2ul DL2000 DNA Marker,2uI陽性對(duì)照及2ul陰性對(duì)照；每次PCR反應(yīng)加入DNA模板O. 5 1.5ul。按下列參數(shù)進(jìn)行PCR反應(yīng)95 °C預(yù)變性3 min，然后94 °C變性30 s，58 V退火40s，72 °C延伸2 min30s，33個(gè)循環(huán)，最后72 °C終延伸4 min。產(chǎn)物于-20 °C保存。1. 2. 5. 4 PCR 產(chǎn)物的檢測
取5 μ L擴(kuò)增產(chǎn)物加2 μ L載樣緩沖液(Stopmix)在150 V電壓，10 g/L瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳(含1%溴化乙錠2 μ L，后改為Goldview)。電泳液用I X TBE緩沖液。紫外燈下觀察擴(kuò)增結(jié)果，并一次成像拍照。1. 2. 6試劑盒組 裝
1.2. 6.1棕色固氮菌PCR檢測試劑盒成分的確立
按照棕色固氮菌PCR檢測方法，確定試劑盒必備內(nèi)容。1. 2. 6. 2棕色固氮菌PCR檢測試劑保存期檢驗(yàn)
將試劑保存在_20°C，分別于I月、3月、6月、12個(gè)月期間對(duì)陽性樣品DNA進(jìn)行檢測，確定試劑盒的保存時(shí)間。1. 2. 6. 3棕色固氮菌PCR檢測方法重復(fù)性試驗(yàn)
應(yīng)用建立的PCR方法，重復(fù)檢查3次，檢驗(yàn)副豬嗜血桿菌DNA的可靠性。結(jié)果
2.1通過調(diào)查、土壤樣品收集、細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化鑒定，已分離出棕色固氮菌貴州地方株。該菌經(jīng)過3-4d后，取出培養(yǎng)皿，觀察發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基上長出菌落及其培養(yǎng)物黏液。黏液初為無色透明，以后為乳白色，最后變成褐色，里面就含有棕色固氮菌。2.2顯微鏡下其形態(tài)結(jié)構(gòu)為短桿狀，周身鞭毛，革蘭氏染色陰性。大小O. 8-1. 0X2. 0-3. Oum0最適溫度25_30°C，最適PH6. 5 7. 5。營養(yǎng)瓊脂平板上形成白色扁平，邊緣不整齊，生長良好的菌落。無氮平板培養(yǎng)基上菌落平滑，有光澤或粘稠，透明，無色，菌落較小。2. 3生化試驗(yàn)結(jié)果表明棕色固氮菌分離株淀粉試驗(yàn)陰性，甘露醇發(fā)酵陽性，鼠李糖發(fā)酵試驗(yàn)陰性，乳糖發(fā)酵試驗(yàn)陰性，硝酸鹽還原陽性，過氧化氫酶試驗(yàn)陽性，鑰酸鹽試驗(yàn)陽性，明膠穿刺液化，石蕊牛奶變清。2. 4從非豆科作物根際土壤中分離得到棕色固氮菌地方菌株，用微量凱氏定氮法測定它們的固氮酶活性。獲得固氮能力(含氮量I 10mg/mL)和較強(qiáng)固氮能力(含氮量>10mg/mL)的菌株。2. 5棕色固氮菌PCR檢測
2.5.1棕色固氮菌的優(yōu)化試驗(yàn) 結(jié)果如

圖1所不。2. 5. 2 PCR方法的敏感性試驗(yàn)
通過DNA的提取，紫外分光光度計(jì)測定，實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)DNA模板的平均0D260值為O. 01046nm,以DNA模板含量為O. 05412ug/ul按10倍稀釋法進(jìn)行稀釋后，取2UL進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖2所示，可檢出的棕色固氮菌DNA模板最低含量為1.0228pg。2. 5. 3 PCR特異性檢測
采用大腸桿菌、沙門氏菌、 放線桿菌、葡萄菌、動(dòng)物綠膿桿菌、副豬嗜血桿菌DNA為模板做PCR，如圖3所示，僅棕色固氮菌出現(xiàn)特異性DNA闊增帶，證明了該方法的特異性。2. 6 PCR檢測方法對(duì)棕色固氮菌貴州地方株的檢測結(jié)果如圖4所示。采用針對(duì)貴州省棕色固氮菌的PCR實(shí)驗(yàn)室檢測方法該方法對(duì)150份土壤樣品的培養(yǎng)菌株進(jìn)行PCR檢測，PCR檢出率為60% (見表I)。
權(quán)利要求
1.一種棕色固氮菌PCR檢測試劑盒，其特征在于它包括4. 5ul質(zhì)量百分比濃度為 50% 的甘油、1. Oul 二甲基亞砜、2ul dNTP, dNTP 中的 ATP, GTP, TTP 及 CTP 均為 2. 5mol/ L、2.0ul 濃度為 25 mmol/ L Tris_HCl、2ul 濃度為 25mmol/ L 的 MgCl2、0. 5ul 濃度為 2U/ul 的 Taq 酶、引物兩條，均為 L0ul、lL Oul 超純水、2ul DL2000 DNA Marker,2uI性對(duì)照及2ul陰性對(duì)照；每次PCR反應(yīng)加入DNA模板O. 5 1. 5ul ;其中引物包括上游引物及下游引物，上游引物的序列為5 ’ -GACCTTGCCGCTGGTGTTG-3 ’，下游引物的序列為 5’ -CGCCGAGCAGTTCGTTTT-3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的棕色固氮菌PCR檢測試劑盒，其特征在于陰性對(duì)照為超純水。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的棕色固氮菌PCR檢測試劑盒，其特征在于固氮菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA模板或重組質(zhì)粒pGEMT EasyialgE的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種棕色固氮菌PCR檢測試劑盒,它包括4.5ul質(zhì)量百分比濃度為50%的甘油、1.0ul二甲基亞砜、2uldNTP，dNTP中的ATP,GTP,TTP及CTP均為2.5mol/L、2.0ul濃度為25mmol/LTris-HCl、2ul濃度為25mmol/L的MgCl2、0.5ul濃度為2U/ul的Taq酶、引物兩條，均為1.0ul、11.0ul超純水、2ulDL2000DNAMarker、2ul陽性對(duì)照及2ul陰性對(duì)照；每次PCR反應(yīng)加入DNA模板0.5～1.5ul。本發(fā)明通過引物設(shè)計(jì)和模板制備建立針對(duì)棕色固氮菌固氮酶基因和藻酸鹽algE,algJ,algC等基因的PCR方法，能有效提高棕色固氮菌地方株的檢出率，使用效果好。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103045750SQ20131001688
公開日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2013年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月16日
發(fā)明者楊茂生, 史開志, 楊莉, 徐景峨, 吳位珩, 梁應(yīng)林 申請(qǐng)人:貴州省畜牧獸醫(yī)研究所