專利名稱：雜交鵝掌楸體胚發(fā)生同步化控制方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及林業(yè)中的種苗繁殖生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種雜交鵝掌楸體胚發(fā)生 同步化控制方法。
背景技術(shù)：
木蘭科鵝掌楸屬(Liriodendron)樹(shù)種在自然界僅存兩個(gè)種，即北美鵝掌楸 (L. tulipifera Linn.)和鵝掌楸(L. chinense (Hemse.) Sarg)，現(xiàn)存資源十分稀少，是我國(guó) 二級(jí)珍惜瀕危保護(hù)樹(shù)種。鵝掌楸具有生長(zhǎng)迅速，干形直，木材用途廣，葉和花觀賞價(jià)值高等 特點(diǎn)，特別是南京林業(yè)大學(xué)葉培忠教授等人利用中國(guó)馬褂木與北美鵝掌楸雜交試驗(yàn)成功獲 得雜交鵝掌楸(Liriodendron chinense XL. tulipifera)，具有明顯的雜種優(yōu)勢(shì)，其生長(zhǎng)速 度快，抗性強(qiáng)，樹(shù)姿優(yōu)美，花色美麗，葉形獨(dú)特，病蟲(chóng)害少，材質(zhì)紋理細(xì)膩，易加工，是集荒山 造林、工業(yè)用材、園林觀賞、綠化等多種用途于一身的優(yōu)良樹(shù)種，市場(chǎng)前景廣闊。目前雜交鵝掌楸主要通過(guò)人工雜交的有性繁殖及扦插、嫁接等傳統(tǒng)方法進(jìn)行繁 殖。但雜交制種效率低、種子量少，F(xiàn)l代的種子發(fā)芽率很低，同時(shí)由于扦插生根難(季孔庶， 2005)，而嫁接繁殖系數(shù)又低，很大程度上限制了優(yōu)良雜種的快速繁殖和利用，因此以傳統(tǒng) 的繁殖方式育苗，速度緩慢，優(yōu)良種苗數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)供不應(yīng)求。有學(xué)者報(bào)導(dǎo)過(guò)雜交鵝掌楸植物組 織培養(yǎng)途徑進(jìn)行快速繁殖的一些研究(劉根林，2000 ；陳金慧等，2002 ；蔣澤平等，2004 ；蔡 桁等，2005 ；田敏等，2006)，但均未見(jiàn)生產(chǎn)性應(yīng)用。相對(duì)于傳統(tǒng)的育苗方式，體細(xì)胞胚胎發(fā)生 具有數(shù)量多、速度快、結(jié)構(gòu)完整、再生率高等優(yōu)點(diǎn)。陳金慧等于2003年利用固體培養(yǎng)基培養(yǎng) 雜交鵝掌楸未成熟胚，成功誘導(dǎo)了雜交鵝掌楸體細(xì)胞胚胎發(fā)生，使雜交鵝掌楸的快速繁育 體系取得了重大進(jìn)展，并成功進(jìn)入工廠化生產(chǎn)育苗，在很大程度上緩解了市場(chǎng)供需矛盾，但 雜交鵝掌楸種苗的供應(yīng)仍然不能滿足市場(chǎng)的需求。植株再生無(wú)疑為解決這種供需矛盾提供了一種有效方案，并且一個(gè)成熟的體胚發(fā) 生懸浮體系對(duì)進(jìn)行植物體細(xì)胞雜交、遺傳轉(zhuǎn)化、植物種質(zhì)資源的超低溫保存以及對(duì)植物體 胚發(fā)育等方面的研究提供了極大的便利。同時(shí)，懸浮培養(yǎng)中同步化的實(shí)現(xiàn)，是利用生物反應(yīng) 器建立規(guī)模化培養(yǎng)體系的基礎(chǔ)，同時(shí)也是研究體胚發(fā)生分子機(jī)理的理想平臺(tái)，因此實(shí)現(xiàn)懸 浮培養(yǎng)中體胚發(fā)生的同步化控制顯得尤為重要。培養(yǎng)同步分裂的細(xì)胞群，可以在人工的控制下獲得具有同樣代謝活性和功能的細(xì) 胞所組成的大群體，為獲得同步形態(tài)發(fā)生的胚狀體奠定基礎(chǔ)。體胚的同步化是指促使所有 培養(yǎng)的細(xì)胞或發(fā)育中的細(xì)胞團(tuán)塊進(jìn)入同一個(gè)分裂時(shí)期，只有同步化了細(xì)胞才可能成批地產(chǎn) 出成熟胚胎。因此控制體胚的同步發(fā)生要從控制細(xì)胞的同步分裂開(kāi)始，目前控制細(xì)胞同步 分裂的常用方法主要是化學(xué)誘導(dǎo)和物理選擇。大多時(shí)候單一的同步化控制方法并不能取得 最佳效果，這就需要將兩種或多種方法綜合應(yīng)用。根據(jù)所選外植體的生物性狀及生理生化 特點(diǎn)采用不同的方法組合或試劑組合達(dá)到最佳的同步誘導(dǎo)效果。關(guān)于鵝掌楸屬體胚發(fā)生的懸浮培養(yǎng)體系，僅有kott Merkle等(1991)報(bào)道過(guò)北 美鵝掌楸的體胚發(fā)生，但未見(jiàn)大規(guī)模生產(chǎn)的報(bào)道。目前，通過(guò)對(duì)雜交鵝掌楸的胚胎發(fā)生過(guò)程進(jìn)行的掃描電鏡觀察以及對(duì)這一過(guò)程中ATP酶活性進(jìn)行的超微細(xì)胞化學(xué)定位，對(duì)于非胚性 細(xì)胞向胚性細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，胚性細(xì)胞的進(jìn)一步發(fā)育分化，以及體細(xì)胞胚胎發(fā)生中胚性細(xì)胞的 起源及發(fā)育已有了初步的了解，同時(shí)對(duì)體胚系統(tǒng)的遺傳穩(wěn)定性的分析表明，雜交鵝掌楸體 細(xì)胞胚胎再生體系具有長(zhǎng)時(shí)間保持旺盛的體胚發(fā)生能力(陳金慧等，2006)。陳志等Q007) 也通過(guò)對(duì)影響懸浮培養(yǎng)的一些物理因素如搖床轉(zhuǎn)速、細(xì)胞起始密度，繼代周期，懸浮物的選 擇等的研究初步建立了雜交鵝掌楸胚性愈傷懸浮培養(yǎng)體系，但高頻、同步的雜交鵝掌楸體 胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)體系的建立還未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種雜交鵝掌楸體 胚發(fā)生同步化控制方法，為滿足雜交鵝掌楸的大規(guī)模生產(chǎn)提供有效的方法。技術(shù)方案為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下本發(fā)明的雜交鵝掌楸體胚發(fā)生同步化控制方法，以懸浮培養(yǎng)條件下的胚性細(xì)胞為 起始材料，在液體培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)并使細(xì)胞分散，采用物理過(guò)篩和密度梯度離心結(jié) 合的方法使植物細(xì)胞群大小均一，同時(shí)調(diào)節(jié)激素的種類和用量誘導(dǎo)植物細(xì)胞胚性，調(diào)整液 體培養(yǎng)物密度分級(jí)轉(zhuǎn)接到含有適量ABA的培養(yǎng)基上，加大滲透壓，促使體胚高頻同步發(fā)生， 最后獲得生長(zhǎng)狀態(tài)正常一致的再生植株。具體實(shí)施包括以下步驟(1)雜交鵝掌楸愈傷細(xì)胞懸浮系擴(kuò)大培養(yǎng)在無(wú)菌條件下，按接種量為2g/50ml將保存在固體培養(yǎng)基上的胚性愈傷組織接入 液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基I，控溫25 士 2°C，在轉(zhuǎn)速為95r ^irT1的搖床上暗培養(yǎng)2 3周，獲得初始 材料；其中，每周繼代一次，繼代按體積比為1 9將培養(yǎng)物接入液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基I，液體誘 導(dǎo)培養(yǎng)基 I 的配方為=MS 培養(yǎng)基，2mg · L、，4-D，0. 2mg · Γ^-ΒΑ, 500mg · L^1LH, 30g · Γ1 蔗 糖；(2)激素誘導(dǎo)和滲透壓調(diào)節(jié)提高轉(zhuǎn)化率按體積比為1 9將步驟(1)獲得的初始材料接入液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基II，控溫 25士2°C，在轉(zhuǎn)速為95r ^irT1的搖床上暗培養(yǎng)7 9d，獲得懸浮培養(yǎng)物；其中，液體誘導(dǎo)培 養(yǎng)基 II 的配方為=MS 培養(yǎng)基，0. 2mg · ^2,4-0,0. 5mg · L^1KT, 200mg · L^1CH, 50g · Γ1 蔗糖；(3)機(jī)械過(guò)篩和密度梯度離心物理篩選將步驟( 懸浮培養(yǎng)物經(jīng)孔徑為400 μ m、280 μ m、150 μ m、38 μ m各層網(wǎng)篩，收集各 層細(xì)胞，將各層細(xì)胞分別鋪于濾紙上，然后置于半固體成熟培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 5周后獲得同 步的成熟胚；其中，半固體成熟培養(yǎng)基的配方為MS培養(yǎng)基，2 IOmg · L^1ABA, 2g · L^1AC, IOOmg · L-1CH, 40g · L-1 蔗糖，5g · L-1 瓊脂；(4)植株再生將成熟胚轉(zhuǎn)移至生長(zhǎng)培養(yǎng)基上促進(jìn)萌發(fā)生長(zhǎng)，將萌發(fā)的小植株轉(zhuǎn)至植株生長(zhǎng)培養(yǎng) 基上培養(yǎng)2 7周，即獲得再生植株；其中，生長(zhǎng)培養(yǎng)基配方為MS培養(yǎng)基，Img · L-1ABA, 30g · L-1蔗糖，6. 5g · L-1瓊脂；植株生長(zhǎng)培養(yǎng)基配方為=MS培養(yǎng)基，30g · L-1蔗糖，6. 5g · L-1 瓊脂；培養(yǎng)條件均為25士2°C，16h(光照)/8h(黑暗)培養(yǎng)。步驟(3)中，對(duì)38 150 μ m的細(xì)胞團(tuán)還可繼續(xù)采用18% Ficoll密度梯度離心或 多次沖洗直接離心培養(yǎng)液的方法，去掉管狀空細(xì)胞和松散的細(xì)胞團(tuán)，取密實(shí)的細(xì)胞團(tuán)，調(diào)整密度至500 600細(xì)胞團(tuán)/mL轉(zhuǎn)移至覆濾紙的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，添加2 IOmg · L^1ABA 促進(jìn)體胚的成熟并抑制異常胚的產(chǎn)生。同時(shí)，經(jīng)過(guò)篩離心后的細(xì)胞團(tuán)也可以在液體成熟培 養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)兩周左右，再進(jìn)行二次過(guò)篩，取150 280 μ m的胚性細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)半固體成熟 培養(yǎng)基培養(yǎng)，其中，液體成熟培養(yǎng)基配方為MS培養(yǎng)基，2 IOmg · L^1ABA, IOOmg · L^1CH, 40g · L-1 蔗糖；步驟(3)中，150 400μπι的細(xì)胞團(tuán)多為胚狀體或連體多胚，其中150 280 μ m的細(xì)胞團(tuán)一般為較早期的球狀原胚，可直接轉(zhuǎn)移至覆濾紙的固體培養(yǎng)基上，并加 IOmg · L-1ABA,同時(shí)使用60 90mg · Γ1蔗糖提高滲透壓培養(yǎng)。280 400 μ m的細(xì)胞團(tuán)多 為較大的胚狀體或連體多胚，這兩層細(xì)胞均可如上直接轉(zhuǎn)至半固體成熟培養(yǎng)基培養(yǎng)，也可 以在液體環(huán)境下使用低濃度的2，4-D，誘導(dǎo)產(chǎn)生更多次生胚，即所謂的二次培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)半 固體成熟培養(yǎng)基培養(yǎng)；步驟(3)中，大于400 μ m的細(xì)胞團(tuán)體胚發(fā)生方式多由愈傷團(tuán)產(chǎn)生，在懸浮系中所 占比重較大，可以轉(zhuǎn)半固體成熟培養(yǎng)基，如(2)所述方法調(diào)節(jié)體胚后期同步化發(fā)育，也可以 轉(zhuǎn)回誘導(dǎo)培養(yǎng)基I繼續(xù)增殖，實(shí)現(xiàn)循環(huán)培養(yǎng)；對(duì)于38 150 μ m的細(xì)胞團(tuán)，從雜交鵝掌楸的胚性細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移至半固體成熟培養(yǎng) 基培養(yǎng)到形成再生植株僅需7 8周，中途不用更換培養(yǎng)基，成苗后用植株生長(zhǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行 壯苗；而對(duì)于150 400 μ m的細(xì)胞團(tuán)和大于400 μ m的細(xì)胞團(tuán)，各階段完成發(fā)育所需時(shí)間較 長(zhǎng)，約為11 13周，其間需更換新鮮培養(yǎng)基，且后期需采用滲透壓調(diào)節(jié)的方法，逐步降滲， 同時(shí)降低ABA含量至2mg ·廠1左右，促進(jìn)體胚正常萌發(fā)。以上雜交鵝掌楸體胚發(fā)育同步化控制的完整技術(shù)路線參見(jiàn)圖1。有益效果經(jīng)上述同步化調(diào)控后，在球形胚階段的經(jīng)分級(jí)篩選的雜交鵝掌楸體胚 發(fā)育同步率達(dá)90%左右；而在心形及魚(yú)雷形胚階段的分級(jí)處理同步化率在室溫條件下為 40%左右，經(jīng)過(guò)適當(dāng)時(shí)間的冷藏會(huì)使同步化的比率有所提高；由球形胚階段的材料發(fā)育而 來(lái)的成熟體胚向再生植株轉(zhuǎn)化率可達(dá)70% 80%。此外，由于該同步化調(diào)控方法將材料進(jìn) 行了分級(jí)處理，根據(jù)各層的狀態(tài)特點(diǎn)制定了不同的下游操作流程，在實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)實(shí)踐中可 因材而用，如38 150 μ m材料可直接成苗不需轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基，且能觀察到胚胎的早期發(fā)育狀 態(tài)，因此可主要用來(lái)進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)的材料觀察和迅速成苗用；150 400 μ m的材料經(jīng)過(guò)降 滲處理和二次培養(yǎng)可用于擴(kuò)大生產(chǎn)使用；大于400 μ m的細(xì)胞可用于循環(huán)培養(yǎng)增殖保種用 等。分級(jí)處理的同步化調(diào)控方法降低了細(xì)胞間的養(yǎng)分競(jìng)爭(zhēng)，刺激更多胚性細(xì)胞的生成，同時(shí) 也方便了人工針對(duì)不同狀態(tài)材料的統(tǒng)一調(diào)控，因此，不僅充分利用了植物材料，提高了同步 性，而且縮短了培養(yǎng)時(shí)間，提高了體胚發(fā)生的頻率和正常植株的轉(zhuǎn)化率，降低了人工操作的 難度，為實(shí)驗(yàn)研究和工廠的進(jìn)一步規(guī)模化生產(chǎn)打下了良好的基礎(chǔ)。


圖1為雜交鵝掌楸體胚發(fā)育同步化控制的完整技術(shù)路線。其中虛線框內(nèi)調(diào)控方法 為機(jī)動(dòng)選擇方法。圖2是本發(fā)明雜交鵝掌楸體胚發(fā)生同步化控制方法主要工藝示意圖。其中，A為液 體誘導(dǎo)培養(yǎng)基I培養(yǎng)的胚性懸浮細(xì)胞系；B為液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基II培養(yǎng)的胚性懸浮細(xì)胞系；C 為將懸浮培養(yǎng)物經(jīng)孔徑為400 μ m、280 μ m、150 μ m、38 μ m各層網(wǎng)篩，收集各層細(xì)胞；D為將5各層培養(yǎng)物鋪于直徑9cm的濾紙上，然后置于半固體成熟培養(yǎng)基上培養(yǎng)；Dl為細(xì)胞團(tuán)顆粒 直徑介于38 150 μ m、D2為細(xì)胞團(tuán)顆粒直徑介于150 280 μ m、D3為細(xì)胞團(tuán)顆粒直徑介 于觀0 400 μ m、D4為細(xì)胞團(tuán)顆粒直徑大于400 μ m ;E為不同層次經(jīng)2 5周后獲得同步 的成熟胚；F為將成熟胚轉(zhuǎn)移至不覆濾紙的生長(zhǎng)培養(yǎng)基上促進(jìn)萌發(fā)生長(zhǎng)；G為將萌發(fā)的小植 株轉(zhuǎn)至植株生長(zhǎng)培養(yǎng)基上，并換大容器培養(yǎng)；H為收集38 150 μ m的胚性細(xì)胞于液體誘導(dǎo) 培養(yǎng)基II中培養(yǎng)10 15d ；I為再次過(guò)篩，收集150 280 μ m的球形胚狀體J為將收集 到的球形胚狀體轉(zhuǎn)入液體成熟培養(yǎng)基中培養(yǎng)，兩周后得到同步的成熟胚；K為將大于150 400 μ m的各層重新置于液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基II中繼續(xù)培養(yǎng)；L為將大于400 μ m的細(xì)胞團(tuán)重新 置于液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基I中完成循環(huán)培養(yǎng)。圖3是分級(jí)培養(yǎng)前的材料預(yù)培養(yǎng)狀態(tài)照片。其中，A為液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基I培養(yǎng)七 天胚性細(xì)胞懸浮系；B為經(jīng)液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基II處理的懸浮細(xì)胞。圖4是38 150 μ m細(xì)胞層經(jīng)Ficoll密度梯度離心處理的體胚發(fā)育狀況顯微照 片。其中，A為通過(guò)篩選所得38 150 μ m的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞；B為經(jīng)18% Ficoll液密度梯 度離心分離后所得培養(yǎng)細(xì)胞；C為在液體成熟培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 IOd后發(fā)育為球形胚；D為 在液體成熟培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)7 IOd后發(fā)育為心形及魚(yú)雷形胚，圖中比例尺均為200 μ m。圖5是過(guò)篩分級(jí)培養(yǎng)各層培養(yǎng)物的生長(zhǎng)發(fā)育狀況照片和轉(zhuǎn)移至固體培養(yǎng)前液體 培養(yǎng)物的顯微照片。其中，第一橫排為顯微照片，第二橫排為照片；從左至右每列為對(duì)應(yīng)一 組，A組為> 400 μ m培養(yǎng)物的生長(zhǎng)發(fā)育狀況照片和轉(zhuǎn)移至固體培養(yǎng)前液體培養(yǎng)物的顯微照 片，B組為280 400 μ m培養(yǎng)物的生長(zhǎng)發(fā)育狀況照片和轉(zhuǎn)移至固體培養(yǎng)前液體培養(yǎng)物的顯 微照片；C組為150 280 μ m培養(yǎng)物的生長(zhǎng)發(fā)育狀況照片和轉(zhuǎn)移至固體培養(yǎng)前液體培養(yǎng)物 的顯微照片；D組為38 150 μ m培養(yǎng)物的生長(zhǎng)發(fā)育狀況照片和轉(zhuǎn)移至固體培養(yǎng)前液體培 養(yǎng)物的顯微照片。圖6是轉(zhuǎn)固體培養(yǎng)不同接種密度下體胚的生長(zhǎng)發(fā)育狀況照片。其中，第一橫排接 種量為300細(xì)胞團(tuán)/mL，第二橫排接種量為600細(xì)胞團(tuán)/mL ；從左至右每列為對(duì)應(yīng)一組，A組 為培養(yǎng)2周，B組為培養(yǎng)4周；C組為培養(yǎng)7周。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例來(lái)對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的解釋。實(shí)驗(yàn)材料據(jù)于施季森、陳金慧等發(fā)明專利(ZL 02 1 12947. 7)所描述的雜交鵝 掌楸體胚誘導(dǎo)方法，于2006-2009年重新雜交并取鵝掌楸雜交組合的未成熟胚誘導(dǎo)體胚， 并通過(guò)多次篩選獲得的具有穩(wěn)定發(fā)生能力的胚性細(xì)胞。誘導(dǎo)培養(yǎng)基I 配方為:MS, 2mg · L-12，4_D，0. 2mg · L-16_BA，500mg · L^1LH, 30g · L-1 蔗糖。誘導(dǎo)培養(yǎng)基II 配方為:MS,0. 2mg · L_12,4-D,0. 5mg · L^1KT, 200mg · L^1CH, 50g · L-1 蔗糖。半固體成熟培養(yǎng)基配方為MS，5mg· L^1ABA, 2mg · L^1AC, 200mg · L^1CH, 40g · L—1 蔗 糖，Sg.L—1瓊脂。植株生長(zhǎng)培養(yǎng)基配方為MS，30g · L—1蔗糖，6. 5g · L—1瓊脂。MS培養(yǎng)基成分單位mg · Γ1
NH4NO3 :1650KNO3 :1900CaCl2 · 2H20 :440MgSO4 · 7H20 370KH2PO4 170KI :0. 83H3BO3 :6. 2MnSO4 · 4H20 :22. 3ZnSO4 · 7H20 :8. 6Na2MnO4 · 2H20 :0. 25CuSO4 · 5H20 :0. 025CoCl2 · 6H20 :0. 025FeSO4 · 7H20 (27. 8) +Na2-EDTA · 2H20 (37. 3)肌醇100煙酸0.5鹽酸吡哆醇(維生素B6) :0. 5鹽酸硫胺素(維生素Bi) 0. 1甘氨酸2實(shí)施例1一種雜交鵝掌楸體胚發(fā)生同步化控制方法，如附圖2所示的操作路線，包括以下 步驟(1)取2g左右保存在固體培養(yǎng)基上的胚性愈傷組織接種于250ml三角瓶中，加 50ml誘導(dǎo)培養(yǎng)基I，放置于搖床上，95r ^mirT1,暗培養(yǎng)，隔周以體積比為1 9培養(yǎng)物與誘 導(dǎo)培養(yǎng)基I繼代，連續(xù)繼代2 3周，獲得初始材料，將初始材料充分搖散，呈均勻顆粒狀， 如圖3A所示。(2)將步驟(1)處理的初始材料倒于50ml量筒中，自動(dòng)沉降!Mins，倒去上清，以 體積比為1 9培養(yǎng)物與培養(yǎng)基比例加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基II，移入250ml三角瓶中，同步驟(1) 培養(yǎng)條件，繼續(xù)培養(yǎng)1周，此時(shí)得到的為分級(jí)處理前材料，如圖3B所示。(3)將步驟(2)培養(yǎng)的材料倒于從上至下網(wǎng)孔逐漸減小的疊垛網(wǎng)篩上，用MS培養(yǎng) 基沖洗2 3次；將各層網(wǎng)篩分別反扣于漏斗上，用少量MS將網(wǎng)層上的材料分別沖洗收集 起來(lái)。對(duì)38 150 μ m的材料用移液器取一滴在細(xì)胞計(jì)數(shù)器上，觀察密度，添加培養(yǎng)基，調(diào) 整材料密度至300 600細(xì)胞團(tuán)/mL ；對(duì)于精確實(shí)驗(yàn)要求的材料，可將該層多次沖洗或置于 用與培養(yǎng)液等滲的3%的蔗糖水溶液為溶劑，18%的Ficoll密度梯度離心液中，200g轉(zhuǎn)速 離心lOmin，收集位于Ficoll層的細(xì)胞，用液體培養(yǎng)基MS沖洗后重新在液體成熟培養(yǎng)基中 培養(yǎng)，如圖4所示；大于150 μ m的材料可視情況涂布于半固體成熟培養(yǎng)基上，各層生長(zhǎng)狀況 如圖5所示，也可以繼續(xù)分別置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基I和II中繼續(xù)培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)二次培養(yǎng)和循環(huán)培 養(yǎng)；(4)用移液器將步驟(3)中調(diào)整密度后的懸浮細(xì)胞均勻涂布在墊脫脂棉的濾紙 上，9cm濾紙，約加1 anl，待多余液體吸干后，將培養(yǎng)物連同濾紙一起轉(zhuǎn)至半固體成熟培養(yǎng)基上(IOcm培養(yǎng)皿每皿約50ml培養(yǎng)基)，封口，25士2°C，黑暗培養(yǎng)；約四周后，體胚長(zhǎng)成 子葉胚狀，轉(zhuǎn)25士2°C，1 (光照)/8h (黑暗)，繼續(xù)培養(yǎng)2 3周，長(zhǎng)成小植株，圖6為不同 接種密度情況下植株的生長(zhǎng)狀況；將生長(zhǎng)整齊的小植株轉(zhuǎn)至植株生長(zhǎng)培養(yǎng)基上，改用培養(yǎng)瓶，25士2°C，1 (光 照)/ (黑暗)培養(yǎng)4 5周，待長(zhǎng)出側(cè)根可轉(zhuǎn)入苗圃培養(yǎng)。實(shí)施例2按照實(shí)施例1的方法操作步驟⑴、(2)，步驟(3)還可以采用以下操作對(duì)38 150 μ m的細(xì)胞團(tuán)還可繼續(xù)采用18 % Ficoll密度梯度離心或多次沖洗 直接離心培養(yǎng)液的方法，去掉管狀空細(xì)胞和松散的細(xì)胞團(tuán)，取密實(shí)的細(xì)胞團(tuán)，調(diào)整密度至 500 600細(xì)胞團(tuán)/mL轉(zhuǎn)移至覆濾紙的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，添加2 IOmg -L^1ABA促進(jìn)體胚 的成熟并抑制異常胚的產(chǎn)生。同時(shí)，經(jīng)過(guò)篩離心后的細(xì)胞團(tuán)也可以在液體成熟培養(yǎng)基中繼 續(xù)培養(yǎng)兩周左右，再進(jìn)行二次過(guò)篩，取150 280 μ m的胚性細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)半固體成熟培養(yǎng)基培 養(yǎng)，其中，液體成熟培養(yǎng)基配方為=MS培養(yǎng)基，2 IOmg · L-1ABA, IOOmg · L^1CH, 40g · L-1蔗 糖；150 400 μ m的細(xì)胞團(tuán)多為胚狀體或連體多胚，其中150 280 μ m的細(xì)胞團(tuán)一般 為較早期的球狀原胚，可直接轉(zhuǎn)移至覆濾紙的固體培養(yǎng)基上，并加IOmg · L-1ABA,同時(shí)使用 60 90mg -L"1蔗糖提高滲透壓培養(yǎng)。280 400 μ m的細(xì)胞團(tuán)多為較大的胚狀體或連體多 胚，這兩層細(xì)胞均可如上直接轉(zhuǎn)至半固體成熟培養(yǎng)基培養(yǎng)，也可以在液體環(huán)境下使用低濃 度的2，4-D，誘導(dǎo)產(chǎn)生更多次生胚，即所謂的二次培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)半固體成熟培養(yǎng)基培養(yǎng)；大于400 μ m的細(xì)胞團(tuán)體胚發(fā)生方式多由愈傷團(tuán)產(chǎn)生，在懸浮系中所占比重較大， 可以轉(zhuǎn)半固體成熟培養(yǎng)基，如(2)所述方法調(diào)節(jié)體胚后期同步化發(fā)育，也可以轉(zhuǎn)回誘導(dǎo)培 養(yǎng)基I繼續(xù)增殖，實(shí)現(xiàn)循環(huán)培養(yǎng)；對(duì)于38 150 μ m的細(xì)胞團(tuán)，從雜交鵝掌楸的胚性細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移至半固體成熟培養(yǎng) 基培養(yǎng)到形成再生植株僅需7 8周，中途不用更換培養(yǎng)基，成苗后用植株生長(zhǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行 壯苗；而對(duì)于150 400 μ m的細(xì)胞團(tuán)和大于400 μ m的細(xì)胞團(tuán)，各階段完成發(fā)育所需時(shí)間較 長(zhǎng)，約為11 13周，其間需更換新鮮培養(yǎng)基，且后期需采用滲透壓調(diào)節(jié)的方法，逐步降滲， 同時(shí)降低ABA含量至2mg ·廠1左右，促進(jìn)體胚正常萌發(fā)。
權(quán)利要求
1.一種雜交鵝掌楸體胚發(fā)生同步化調(diào)控方法，其特征在于，包括以下步驟(1)在無(wú)菌條件下，按接種量為2g/50ml將保存在固體培養(yǎng)基上的胚性愈傷組織接入 液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基I，增殖培養(yǎng)，控溫25士2°C，在轉(zhuǎn)速為95r ^irT1的搖床上暗培養(yǎng)2 3周， 獲得初始材料；其中，每周繼代一次，繼代按體積比為1 9將培養(yǎng)物接入液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基 I，液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基I的配方為=MS培養(yǎng)基，2mg · ^2,4-0,0. 2mg · Γ^-ΒΑ, 500mg · L^1LH, 30g · L-1 蔗糖；(2)按體積比為1 9將步驟⑴獲得的初始材料接入液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基II，控溫 25士2°C，在轉(zhuǎn)速為95r ^irT1的搖床上暗培養(yǎng)7 9d，獲得懸浮培養(yǎng)物；其中，液體誘導(dǎo)培 養(yǎng)基 II 的配方為=MS 培養(yǎng)基，0. 2mg · ^2,4-0,0. 5mg · L^1KT, 200mg · L^1CH, 50g · Γ1 蔗糖；(3)將步驟( 懸浮培養(yǎng)物過(guò)孔徑40(^111、28(^111、15(^111、384 111網(wǎng)篩，并按不同孔 徑分層收集細(xì)胞，分別鋪于濾紙上，然后置于半固體成熟培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 5周后獲得同 步的成熟胚；其中，半固體成熟培養(yǎng)基的配方為MS培養(yǎng)基，2 IOmg · L^1ABA, 2g · L^1AC, IOOmg · L-1CH, 40g · L-1 蔗糖，5g · L-1 瓊脂；(4)將成熟胚轉(zhuǎn)移至生長(zhǎng)培養(yǎng)基上促進(jìn)萌發(fā)生長(zhǎng)，將萌發(fā)的小植株轉(zhuǎn)至植株生長(zhǎng)培養(yǎng) 基上培養(yǎng)，即獲得再生植株；其中，生長(zhǎng)培養(yǎng)基配方為MS培養(yǎng)基，Img · L1ABAdOg · Γ1蔗 糖，6. 5g · L-1瓊脂；植株生長(zhǎng)培養(yǎng)基配方為=MS培養(yǎng)基，30g · L-1蔗糖，6. 5g · L-1瓊脂；培養(yǎng) 條件均為25士2°C，l^i (光照)/ (黑暗)培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雜交鵝掌楸體胚發(fā)生同步化控制方法，其特征在于步驟 (3)中，收集38 150 μ m的胚性細(xì)胞于液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基II中培養(yǎng)10 15d，再次過(guò)篩， 收集150 280μπι的球形胚狀體，將收集到的球形胚狀體轉(zhuǎn)入液體成熟培養(yǎng)基中培養(yǎng)，兩 周后得到同步的成熟胚。其中，液體成熟培養(yǎng)基的配方為MS培養(yǎng)基，2 IOmg · L-1ABA, IOOmg · L-1CHJOg · L-1 蔗糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雜交鵝掌楸體胚發(fā)生同步化控制方法，其特征在于步驟(3) 中，收集150 280 μ m和280 400 μ m的細(xì)胞團(tuán)，分別將其轉(zhuǎn)至步驟3所述半固體成熟培 養(yǎng)基或進(jìn)行步驟( 培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雜交鵝掌楸體胚發(fā)生同步化控制方法，其特征在于步驟(3) 中，將大于400μπι的細(xì)胞團(tuán)按照步驟(1)繼續(xù)增殖，并依次按照步驟(2)、(3)和(4)操作， 實(shí)現(xiàn)循環(huán)培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種雜交鵝掌楸體胚發(fā)生同步化調(diào)控方法。該方法利用生長(zhǎng)激素調(diào)節(jié)機(jī)理，逐步降低2，4-D濃度，附加0.5mg·L-1KT誘導(dǎo)出較為均一的胚性細(xì)胞團(tuán)，然后采用機(jī)械過(guò)篩的方法將胚性細(xì)胞團(tuán)分級(jí)培養(yǎng)，并根據(jù)細(xì)胞團(tuán)大小和體胚發(fā)生方式的不同，選用不同的后續(xù)同步化控制方法。經(jīng)上述同步化調(diào)控后，在球形胚階段的經(jīng)分級(jí)篩選的雜交鵝掌楸體胚發(fā)育同步率達(dá)90％左右；而在心形及魚(yú)雷形胚階段的分級(jí)處理同步化率在室溫條件下為40％左右，經(jīng)過(guò)適當(dāng)時(shí)間的冷藏會(huì)使同步化的比率有所提高；由球形胚階段的材料發(fā)育而來(lái)的成熟體胚向再生植株轉(zhuǎn)化率可達(dá)70％～80％。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102037896SQ201010298850
公開(kāi)日2011年5月4日 申請(qǐng)日期2010年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月28日
發(fā)明者施季森, 李婷婷, 陳金慧, 龍偉 申請(qǐng)人:南京林業(yè)大學(xué)