專利名稱：雜交鵝掌楸體細(xì)胞胚胎發(fā)生與植株再生技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬林業(yè)行業(yè)中的細(xì)胞工程種苗繁育技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
鵝掌楸，又稱馬褂木、鴨腳木、九層皮、楓荷樹等，是木蘭科(Magnoliaceae)鵝掌楸屬(Liriondendron)的植物。該屬現(xiàn)在僅存兩種，一種是分布于我國(guó)中、北亞熱帶地區(qū)(從東部的浙江、福建延伸到西南部的云南、中越邊界)的中國(guó)鵝掌楸(L.chinense[Hemsl.]Sarg.)，另一種是分布于美國(guó)東部的北美鵝掌楸(L.tulipifera L.)。鵝掌楸屬植物在被子植物分類地位中處于較原始的位置。雖然分布區(qū)廣，但目前多呈小群體分布。其中分布于中國(guó)境內(nèi)的鵝掌楸已被列為國(guó)家二級(jí)珍稀瀕危保護(hù)樹種。
中國(guó)鵝掌楸干形通直、樹形美觀；葉形奇特，葉片寬大，微凹，兩側(cè)有一裂片，先端截形，葉形儼然如中國(guó)古裝馬褂一般，故俗稱馬褂木；春天枝條頂端開淡黃色大型花朵，其狀如杯似碗，光燦悅目，觀賞價(jià)值高；果實(shí)圓錐形，亦極美觀。該樹種對(duì)二氧化硫和氯氣有較強(qiáng)的抗性，廣泛用于園林綠化。另外，鵝掌楸屬植物木材淡紅褐色，紋理通直，色澤美觀，結(jié)構(gòu)細(xì)密，材質(zhì)輕軟，刨面光潔，適合于用作膠合板、紙漿、家具以及室內(nèi)裝飾用材，以及用于建筑、造船等，經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高，因此也是重要的用材樹種。
作為世界珍稀名貴觀賞風(fēng)景樹的北美鵝掌楸，同樣樹姿挺秀，葉形美麗，樹形端正，樹序整齊，花大而美。老齡樹枝條平展，或微向下垂。每屆花期，瓊英壓樹，翠帷覆地，綺麗優(yōu)雅。
葉培忠教授于1963年首次選用中國(guó)鵝掌楸和北美鵝掌楸為親本進(jìn)行正、反交組合人工雜交，育成種間雜種雜交鵝掌楸(L.chinense[Hemsl.]Sarg.×L.tulipifera L.和L.tulipifera L.×L.chinense[Hemsl.]Sarg)；1970年開始進(jìn)行雜交鵝掌楸正、反交組合苗木栽培對(duì)比。試驗(yàn)表明，種間雜交后代具有明顯的雜交優(yōu)勢(shì)，不僅樹形比親本更加通直，花葉更加幽麗，媲美眾芳，俯視眾卉，而且生長(zhǎng)也更加迅速。如栽植于浙江富陽(yáng)中國(guó)林科院亞林所的雜交鵝掌楸，12年生時(shí)樹高達(dá)14米，胸徑達(dá)37厘米；另?yè)?jù)北京市園林局將雜交鵝掌楸作城市行道樹試種，在北京地區(qū)表現(xiàn)出耐寒性強(qiáng)，生長(zhǎng)迅速的特點(diǎn)；同時(shí)該樹種無(wú)其他樹種果毛、花絮飛散造成的空氣污染之弊。因此，林業(yè)上對(duì)優(yōu)質(zhì)雜交鵝掌楸苗木的需求相當(dāng)迫切。
但鵝掌楸的天然結(jié)實(shí)率很低，親本和雜交新種均僅有1％左右，有性繁殖能力差；鵝掌楸的扦插技術(shù)要求很高，成活率低，無(wú)性繁殖困難。因此，目前的種苗繁殖技術(shù)無(wú)法滿足大面積植樹造林的需要。
體細(xì)胞胚胎發(fā)生及其植株再生技術(shù)是20世紀(jì)90年代形成的高新林業(yè)生物技術(shù)的重要內(nèi)容之一，可用于優(yōu)良品種的大規(guī)模繁殖和用于遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立。體細(xì)胞胚，是指二倍體或單倍體細(xì)胞在未經(jīng)性細(xì)胞融合的過(guò)程，模擬合子胚發(fā)生的各個(gè)階段而發(fā)育形成一個(gè)新的個(gè)體的形態(tài)發(fā)生和重建過(guò)程。在正常情況下有些植物的珠心組織或助細(xì)胞也可自發(fā)產(chǎn)生體細(xì)胞胚。在大量的組織培養(yǎng)過(guò)程中，許多離體培養(yǎng)的細(xì)胞、組織和器官，形成類似胚的結(jié)構(gòu)。這種經(jīng)體細(xì)胞胚發(fā)生而形成的在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能上類似于有性胚的結(jié)構(gòu)被稱之為體細(xì)胞胚或胚狀體。無(wú)性胚狀體可以像有性胚那樣在一定的條件下發(fā)育成完整的植株。胚狀體按其來(lái)源可分為兩類一類是由普通植物孢子體的各種器官的二倍體體細(xì)胞產(chǎn)生而來(lái)，通常稱為體細(xì)胞胚；另一類是由小孢子或其分裂產(chǎn)物等單倍體細(xì)胞產(chǎn)生的胚狀體，通常簡(jiǎn)稱為花粉胚，可發(fā)育成單倍體植株，但一般必須進(jìn)行染色體加倍才能正常開花結(jié)實(shí)。另外，在一些植物中也可從胚乳培養(yǎng)得到胚狀體，但未能成功地由胚狀體發(fā)育成植株。朱微認(rèn)為胚狀體的定義包括三點(diǎn)含義(1)胚狀體是組織培養(yǎng)的產(chǎn)物，只限于在組織培養(yǎng)范圍內(nèi)使用，區(qū)別于無(wú)融合生殖的胚；(2)胚狀體起源于非合子細(xì)胞，區(qū)別于合子胚；(3)胚狀體的形成經(jīng)歷胚胎發(fā)育的過(guò)程，區(qū)別于與組織培養(yǎng)中分化的芽體。
1902年Haberlandt提出植物細(xì)胞的全能性觀點(diǎn)，即每一個(gè)細(xì)胞都能不斷分裂，進(jìn)而形成完整的植株。Steward(1958)和Reinert(1959)差不多同時(shí)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)的胡蘿卜根細(xì)胞產(chǎn)生一種與胚相似的結(jié)構(gòu)，并觀察到由這種結(jié)構(gòu)長(zhǎng)成完整的植株。從而證明Haberlandt關(guān)于細(xì)胞全能性概念的正確性。此后，植物學(xué)家對(duì)此進(jìn)行了廣泛的研究，并已在許多植物中利用不同的器官、組織、細(xì)胞和原生質(zhì)體進(jìn)行培養(yǎng)得到了體細(xì)胞胚。成功獲得體細(xì)胞胚的有裸子植物、雙子葉植物和單子葉植物。林木體細(xì)胞胚胎發(fā)生研究始于20世紀(jì)七十年代后期，八十年代后期得到迅速發(fā)展，并獲得極大成功。全世界目前已有40多種木本植物獲得了體細(xì)胞胚，尤其是用常規(guī)無(wú)性繁殖技術(shù)很難生根的針葉樹的體胚發(fā)生取得了令人矚目的進(jìn)展。據(jù)初步統(tǒng)計(jì)，已從冷杉屬、落葉松屬、云杉屬、松屬、黃杉屬和北美紅杉屬的至少20種不同的針葉樹的外植體誘導(dǎo)成功了體細(xì)胞胚。在闊葉樹種上，柳屬、楊屬、栗屬、檀香屬、楓香屬、鵝掌楸屬、榛屬、櫟屬、板栗屬、山茶屬、桉樹屬、七葉樹屬、柑橘屬、柚木、可可、油橄欖、橡膠、泡桐等20多個(gè)樹種的組織培養(yǎng)中觀察到體細(xì)胞胚胎發(fā)生或獲得再生植株。其中，美國(guó)的惠豪公司、國(guó)際紙業(yè)公司、維斯瓦庫(kù)公司和加拿大的一些公司、新西蘭林業(yè)研究中心等已分別將火炬松、挪威云杉、花旗松和輻射松等樹種的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)和植株再生應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐。僅新西蘭一家公司就形成了年產(chǎn)200萬(wàn)株輻射松體細(xì)胞胚再生植株的能力。中國(guó)科學(xué)院于1988年以華北云杉為實(shí)驗(yàn)材料，將幼胚產(chǎn)生的愈傷組織誘導(dǎo)出的體細(xì)胞胚胎發(fā)育成小苗。黑龍江農(nóng)大(1993)進(jìn)行黑穗醋栗末受精胚珠培養(yǎng)，成功誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎和植株。四川農(nóng)大王米力等(1996)用尾葉桉種子下胚軸誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生，獲得根苗齊全的再生植株。在幾十年的研究工作中，研究人員積累了大量的可貴資料，主要如下1.植物體的各種器官，如根、莖、葉、花、果實(shí)、種子、子房中的胚珠、雄蕊的花絲、花藥及花粉都可以產(chǎn)生體細(xì)胞胚胎。但S.Merkle(1996)認(rèn)為，樹木的胚性培養(yǎng)只能來(lái)源于種子或幼苗，合子胚或種子的發(fā)育程度是很重要的，在許多樹種的研究中表明，未成熟種子比成熟種子或幼苗有更高的誘導(dǎo)潛能。
2.外植體在接種前必須在低溫條件下(4～8℃)冷藏一段時(shí)間，如裸子植物要冷藏1～2個(gè)月，沒(méi)有低溫處理不能啟動(dòng)。但低溫冷藏時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，體胚發(fā)生能力會(huì)下降。
3.誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎，第一階段需要高濃度的生長(zhǎng)素，如2，4-D、NAA，此時(shí)外植體脫分化形成愈傷組織，即而誘導(dǎo)形成胚性細(xì)胞；第二階段體細(xì)胞胚胎的形成和發(fā)育，必須降低生長(zhǎng)素的濃度或完全除去生長(zhǎng)素。
4.培養(yǎng)基中氮源的含量及形式是誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎的一個(gè)重要條件。還原態(tài)氮(NH4+)對(duì)體細(xì)胞胚胎的誘導(dǎo)有利，而且高氮含量的MS培養(yǎng)基已經(jīng)誘導(dǎo)出多種植物的體細(xì)胞胚胎。Reinert(1972)認(rèn)為，體細(xì)胞胚胎的形成不是與培養(yǎng)基中氮的絕對(duì)量有關(guān)，而是與氮和生長(zhǎng)素的比例有關(guān)。
5.一些天然復(fù)合物如水解酪蛋白(CH)、水解乳蛋白(LH)、大豆蛋白胨、麥芽汁、酵母提取物和椰子汁，它們既可以提供有機(jī)氮源、又對(duì)細(xì)胞分裂素和肌醇起作用，從而促進(jìn)體細(xì)胞胚的形成。但在體細(xì)胞胚胎形成以后，要除去這些物質(zhì)，否則會(huì)抑制體胚的發(fā)芽。
6.懸浮培養(yǎng)系的建立。在液體懸浮培養(yǎng)中，愈傷組織可以和培養(yǎng)基充分接觸，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在培養(yǎng)基的每個(gè)區(qū)域的濃度較均一，利于懸浮組織的同步生長(zhǎng)。另外，懸浮培養(yǎng)大大改善了培養(yǎng)物的生存環(huán)境，這里氣體交換順暢，光照條件優(yōu)越。
7.滲透壓可以影響胚性細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育，利用蔗糖、甘露醇、山梨醇和聚乙二醇(PEG)提高細(xì)胞的滲透壓，創(chuàng)造一個(gè)干旱的環(huán)境，可以抑制早期萌發(fā)，明顯提高胚成熟的概率而獲得同步成熟好、質(zhì)量高的體細(xì)胞胚胎，貯藏物的水平也會(huì)顯著增加。
8.在生理濃度ABA(10-6和10-7mol/L)的作用下，胚發(fā)育不正常的情況如子葉合生、早熟發(fā)芽等會(huì)受到抑制。
9.光照和溫度條件。組織培養(yǎng)中，除了某些材料需要在黑暗中生長(zhǎng)外，一般均需要光照。S.Merkle認(rèn)為，美國(guó)楓香的胚狀體在黑暗與光照條件下均能發(fā)育，但是黑暗條件下發(fā)育得更健康。光源以熒光燈、白熾燈為多。不同波長(zhǎng)的光源，對(duì)培養(yǎng)器官的增殖和器官分化有明顯影響。如紅豆杉的組培中，多采用紅光。一般情況下，培養(yǎng)在25±2℃的恒溫條件下進(jìn)行。
在大量的研究中發(fā)現(xiàn)，在體細(xì)胞胚胎形成的所有條件中，培養(yǎng)基中的激素種類及濃度，培養(yǎng)基的多種營(yíng)養(yǎng)成分均起著重要作用。而一些物理因素，如光照和溫度等也有明顯的影響。同時(shí)，也注意到組織的來(lái)源及其生理狀態(tài)，對(duì)后期培養(yǎng)時(shí)的生長(zhǎng)情況及分化有很大的影響。在培養(yǎng)基的各種成分之中，植物激素對(duì)于體胚形成，起著明顯而重要的調(diào)節(jié)作用。其中影響最顯著的是生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素。有時(shí)也是用赤霉素、脫落酸、乙烯以及其他人工合成的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)。使用激素要注意激素的種類和濃度，因?yàn)楦鞣N生長(zhǎng)物質(zhì)的穩(wěn)定性、效應(yīng)及其對(duì)體胚形成的影響有明顯的差別。同時(shí)，不同激素處理的順序也有明顯的影響。在組織培養(yǎng)中用于調(diào)節(jié)胚狀體形成的生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素，常用的種類如下生長(zhǎng)素類吲哚乙酸(IAA)、萘乙酸(NAA)、2，4-D，吲哚丁酸(IBA)；細(xì)胞分裂素類激動(dòng)素(KT)、6-芐胺基嘌呤(BA)、異戊基腺嘌呤(2iP)、玉米素(ZT)。
為了誘導(dǎo)胚性愈傷組織或懸浮培養(yǎng)細(xì)胞形成胚狀體，連續(xù)改變培養(yǎng)基特別是激素成分十分重要。2，4-D在胚性愈傷組織的誘導(dǎo)中起著重要作用，多種植物組織培養(yǎng)誘導(dǎo)脫分化都必須有2，4-D存在，而誘導(dǎo)脫分化后必須降低或去掉2，4-D，胚性細(xì)胞才能正常發(fā)育。Halperin(1970)取胡羅卜的葉柄切段，培養(yǎng)于加有不同激素成分的瓊脂培養(yǎng)基上，然后移至不加任何激素的基本培養(yǎng)基上(僅有無(wú)機(jī)鹽、蔗糖及維生素B1)，以檢查對(duì)胚狀體形成的影響。結(jié)果表明④促進(jìn)胚性愈傷組織增殖的培養(yǎng)及其激素成分并不促進(jìn)胚狀體的分化；去除培養(yǎng)基中的2，4-D，則使胚狀體形成；加入BA，組織增殖速度增加，但抑制了轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基上后胚狀體的形成，并且一旦胚狀體原始細(xì)胞形成后，BA對(duì)其發(fā)育成胚狀體毫無(wú)影響。②加入赤霉素，完全抑制其后胚狀體的分化。③細(xì)胞增殖過(guò)程中的激素環(huán)境對(duì)下一步器官分化有著明顯的影響。
有實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，2，4-D通過(guò)改變細(xì)胞內(nèi)源IAA代謝而起作用，在水稻的早期胚性愈傷組織中，用ELISA酶聯(lián)免疫分析證明胚性細(xì)胞出現(xiàn)時(shí)伴有較高的內(nèi)源IAA水平，并且在胚性細(xì)胞轉(zhuǎn)換時(shí)期添加外源IAA對(duì)胚性細(xì)胞出現(xiàn)有一定誘導(dǎo)效果。
ABA是體細(xì)胞胚發(fā)生中另外一種重要的激素，早在1974年，Ammirato報(bào)道了ABA可促進(jìn)葛縷子體細(xì)胞胚胎發(fā)育。水稻愈傷組織浸ABA處理后，游離氨基酸含量明顯提高，蛋白質(zhì)含量與胚性對(duì)照相近，SDS-PAGE表明，出現(xiàn)胚性多肽譜帶。用ELISA酶聯(lián)免疫方法測(cè)定了黨參胚性細(xì)胞形成球形胚的過(guò)程中，內(nèi)源ABA的含量變化，結(jié)果表明，在這一過(guò)程中內(nèi)源ABA含量持續(xù)增加。Kamada等在胡蘿卜細(xì)胞培養(yǎng)中，發(fā)現(xiàn)內(nèi)源ABA含量一直保持比較低的水平，但從非胚性細(xì)胞轉(zhuǎn)化為胚性細(xì)胞，由胚性細(xì)胞團(tuán)發(fā)育形成有形態(tài)結(jié)構(gòu)的球形胚，在這兩個(gè)體細(xì)胞胚發(fā)生的質(zhì)變階段中，均伴隨著內(nèi)源ABA的增加。在香菜體胚發(fā)生研究中，Ammirato(1973)發(fā)現(xiàn)在ABA的影響下，通常出現(xiàn)的不正常胚發(fā)育(如在下胚軸上形成不定胚，子葉合生，苗提前發(fā)育等)受到抑制；與不加ABA時(shí)所產(chǎn)生的胚狀體相比更接近于合子胚的發(fā)育情況。
至于培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)及有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的影響，相對(duì)來(lái)說(shuō)沒(méi)有激素的作用那么明顯。同時(shí)，在培養(yǎng)基中通常已經(jīng)包含植物生長(zhǎng)所必需的無(wú)機(jī)元素和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，不同的培養(yǎng)基配方盡管千差萬(wàn)別，但基本上都含有這些物質(zhì)。雖然如此，在胡羅卜的細(xì)胞培養(yǎng)中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中的氮素含量與胚狀體的形成有密切關(guān)系。組織培養(yǎng)中常用的兩種培養(yǎng)基White培養(yǎng)基和MS培養(yǎng)基，其含氮量有很大的差異，前者在3.2mM，后者在60mM。通常認(rèn)為White培養(yǎng)基不適于胚狀體的分化。事實(shí)上，當(dāng)把White培養(yǎng)基的含氮量用硝酸鉀(KNO3)提高到40～60mM時(shí)，即可使之全部形成胚狀體。Ammirato(1969)用NH4NO3提高White培養(yǎng)基的含氮量，也可達(dá)到MS培養(yǎng)基的效果。Reinert(1967)證實(shí)了NH4+對(duì)于誘導(dǎo)胡羅卜培養(yǎng)中胚狀體的形成，比其他氮源更為有效。Halperin(1971)亦發(fā)現(xiàn)不同氮源中對(duì)于胚狀體的形成，NH4+和水解酪蛋白的促進(jìn)作用明顯優(yōu)于NO3-或谷氨酰胺。
在所有的有機(jī)化合物中間，常用的有維生素、氨基酸、核酸堿基(嘌呤、嘧啶類化合物)、糖類等。維生素中常用的是硫胺素、肌醇、煙酸、吡哆素等，其中硫胺素的作用最為明顯，而在組織培養(yǎng)中加入肌醇也一直認(rèn)為是有好處的。為了促進(jìn)胚狀體的形成，在很多情況下也常用一些天然復(fù)合物，如水解酪蛋白或水解乳蛋白、大豆蛋白胨、麥芽汁、酵母提取物和椰子汁等，其中椰子汁使用特別多?，F(xiàn)經(jīng)大量的研究，已知其影響生長(zhǎng)和分化的有效成分是細(xì)胞激動(dòng)素類物質(zhì)和肌醇等。
滲透劑在林木體胚發(fā)生的各個(gè)階段都發(fā)揮著重要作用?？偟恼f(shuō)來(lái)，滲透劑都是高度水合性的多羥基分子，包括單糖、多糖、己糖醇和環(huán)多醇。環(huán)多醇是六碳環(huán)的羥基復(fù)合物，較常用的環(huán)多醇有肌醇及其立體異構(gòu)體鯊肌醇等。蔗糖和葡萄糖是常用的兩種糖類滲透劑，山梨醇、D-甘露醇和半乳糖醇的直鏈醇形式、及乙二醇如聚乙二醇和聚丙二醇也可用作滲透劑。唐巍(1998)在火炬松的胚性愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生的研究中，加入9000mg/L肌醇提高滲透壓，以促進(jìn)后期胚的發(fā)育。黃健秋(1995)將馬尾松的早期原胚轉(zhuǎn)至含9000mg/L肌醇的DCR培養(yǎng)基上，形成后期原胚。可見，體胚形成過(guò)程中適當(dāng)提高滲透壓可促進(jìn)體胚形成。
在植物組織培養(yǎng)中，誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生和誘導(dǎo)器官發(fā)生相比具有顯著的特點(diǎn)①具有兩極性在體細(xì)胞胚發(fā)生早期就具有胚根和胚芽?jī)蓸O，胚性細(xì)胞分裂多為不均等分裂，形成頂細(xì)胞和基細(xì)胞，其后有較小的頂細(xì)胞繼續(xù)分裂形成多細(xì)胞原胚，而較大的基細(xì)胞進(jìn)行少數(shù)幾次分裂成為胚柄部分，在形態(tài)上具有明顯的極性。②存在生理隔離體細(xì)胞胚形成后與母體植物或外植體的維管束系統(tǒng)聯(lián)系較少，即出現(xiàn)所謂生理上的隔離現(xiàn)象。胚性細(xì)胞細(xì)胞壁加厚，與其它細(xì)胞分開，周圍細(xì)胞處于解體狀態(tài)，表明體細(xì)胞胚與合子胚相似，從一開始就是完整的植物體的雛形。③遺傳相對(duì)穩(wěn)定通過(guò)體細(xì)胞胚形成的再生植株的變異性小于器官發(fā)生途徑形成的再生植株，因?yàn)橹挥心切┪唇?jīng)過(guò)畸變的細(xì)胞或變異較少的細(xì)胞團(tuán)才能形成體細(xì)胞胚，實(shí)現(xiàn)全能型表達(dá)。④重演受精卵形態(tài)發(fā)生的特征植物組織培養(yǎng)中形態(tài)發(fā)生的幾種方式，雖然都是植物細(xì)胞全能性的具體表現(xiàn)，但體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑是細(xì)胞全能型表達(dá)最完全的一種方式，它不僅表明植物體細(xì)胞具有全套遺傳信息，而且重演了合子胚形態(tài)發(fā)生的進(jìn)程。
植物組織培養(yǎng)中誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)生途徑可歸納為兩種直接途徑與間接途徑。直接途徑就是從外植體某些部位直接誘導(dǎo)分化出體細(xì)胞胚，如槐樹子葉在切口處產(chǎn)生愈傷組織的同時(shí)，在子葉組織中分化產(chǎn)生體細(xì)胞胚?；睒渥尤~離體培養(yǎng)既可以直接途徑形成體細(xì)胞胚，也可以通過(guò)脫分化形成愈傷組織后，再?gòu)挠鷤M織的某些細(xì)胞分化出體細(xì)胞胚，即稱為間接途徑。大多數(shù)植物的體細(xì)胞胚胎發(fā)生多通過(guò)間接途徑進(jìn)行，在愈傷組織中某些體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為胚性細(xì)胞、胚性細(xì)胞繼續(xù)分裂形成多細(xì)胞原胚以及不同發(fā)育時(shí)期的體細(xì)胞胚，如經(jīng)過(guò)球形胚、心形胚、魚雷胚和子葉胚而發(fā)育成小苗。
體細(xì)胞胚胎發(fā)生由于能在更短的時(shí)間內(nèi)得到更多的營(yíng)養(yǎng)繁殖體，以及獲得更大的遺傳增益，并且由于體胚發(fā)生培養(yǎng)物也是分離原生質(zhì)體的重要來(lái)源，可用于林木的遺傳轉(zhuǎn)化以及體細(xì)胞雜交研究，在理論與應(yīng)用研究中具有重要的作用。體細(xì)胞胚胎具有數(shù)量多、速度快、結(jié)構(gòu)完整等顯著特點(diǎn)，而且體細(xì)胞再生植株的優(yōu)點(diǎn)是分化效率高、繁殖系數(shù)大、根系發(fā)達(dá)、繁殖速率比其它途徑快，因而特別適合植物的大量繁殖；由于易在體外培養(yǎng)，并且可以比較體外非合子胚與種子的合子胚的異同，所以廣泛用于研究植物體的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程；在基因工程研究中，將分離到的基因?qū)雴蝹€(gè)胚性細(xì)胞中，由這個(gè)胚性細(xì)胞長(zhǎng)成植株的組織中，就含有整合進(jìn)去的基因。
目前有關(guān)植物組織培養(yǎng)技術(shù)的各類文獻(xiàn)中，除美國(guó)有北美鵝掌楸(Liriondendron tulipifera L.)組培相關(guān)專利技術(shù)的報(bào)導(dǎo)外，尚未見有雜交鵝掌楸(Liriondendron hybrid)體細(xì)胞胚胎發(fā)生的成套技術(shù)發(fā)表。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是針對(duì)鵝掌楸天然結(jié)實(shí)率低，扦插困難，種苗繁殖技術(shù)無(wú)法滿足大面積植樹造林需要的現(xiàn)狀，尋找一種雜交鵝掌楸細(xì)胞胚胎發(fā)生與植株再生的技術(shù)，為雜交鵝掌楸的大規(guī)模無(wú)性繁殖育苗提供一種周期短、繁殖率高、成本低廉的方法。
本發(fā)明的主要技術(shù)特征在于，在鵝掌楸雜交親本選擇的基礎(chǔ)上進(jìn)行雜交，分別將正交、反交和回交制種所獲得的雜交幼胚，植于專用配方的培養(yǎng)基上，實(shí)現(xiàn)雜交鵝掌楸規(guī)模細(xì)胞胚胎的發(fā)生和植株再生。具體方法如下一、未成熟胚的制取選定父、母本優(yōu)良植株。四月底到五月初，在盛花期的母本植株上選擇花冠頂端微微松動(dòng)、雌蕊柱頭布滿粘液和晶瑩亮點(diǎn)而即將開放的花蕾、剝開花瓣去雄，然后用鑷子從父本花朵上夾下雄蕊，從上到下輕輕觸動(dòng)雌蕊柱頭，直到柱頭上涂滿一層金黃色的花粉為止，最后將花瓣合攏。七月份收集聚合翅果，制取獲得未成熟合子胚，二、不同發(fā)育階段需要的不同基本培養(yǎng)基配方1.胚性愈傷誘導(dǎo)階段采用1/2MS基本培養(yǎng)基，即將MS(Murashing andSkoog medium)培養(yǎng)基大量元素減半，其余成分保持不變。附加濃度為0.5～5.0mg/L的2，4-D，0～0.5mg/L的6-芐胺基嘌呤(BA)，500～1000mg/L的天然復(fù)合物水解酪蛋白和1～5mg/L的維生素C。
2.胚性愈傷組織的增殖階段，繼續(xù)使用1/2MS基本培養(yǎng)基。附加濃度為0～0.5mg/L的2，4-D，0～0.25mg/L的6-芐胺基嘌呤(BA)，500～1000mg/L的天然復(fù)合物水解酪蛋白和1～5mg/L的維生素C。
3.胚性愈傷組織的狀態(tài)調(diào)整階段，改用MS基本培養(yǎng)基，并提高蔗糖濃度，附加濃度為0～0.5mg/L的2，4-D，0～0.25mg/L的6-芐胺基嘌呤(BA)，500～1000mg/L的天然復(fù)合物水解酪蛋白和1～5mg/L的維生素C。
4.胚狀體的發(fā)生階段，采用MS基本培養(yǎng)基，適當(dāng)提高細(xì)胞分裂素、特別是玉米素ZT的濃度。即附加濃度為0.5～5.0mg/L的ZT，0～1.0mg/L的IAA。
5.球形胚形成以后階段，采用MS改良培養(yǎng)基，調(diào)整MS培養(yǎng)基中的含氮量，直至胚狀體發(fā)育成苗。
6.幼苗發(fā)育階段，采用White培養(yǎng)基。
以上所涉及的各類培養(yǎng)基具體配方如下1.MS基本培養(yǎng)基(Murashing and Skoog medium，1962)標(biāo)準(zhǔn)配方NH4NO31650 mg/LKNO31900 mg/LCaCl2·2H2O 440 mg/LMgSO4·7H2O 370 mg/LKH2PO4170 mg/LKI 0.83 mg/LH3BO36.2 mg/LMnSO4·H2O 16.9 mg/LZnSO4·7H2O 8.6 mg/LNa2MoO4·2H2O 0.25 mg/LCuSO4·5H2O 0.025 mg/L
CoCl2·6H2O 0.025 mg/LFeSO4·7H2O27.8 mg/LNa2-EDTA37.3 mg/L肌醇 100 mg/L煙酸 0.5 mg/L鹽酸硫胺素0.1 mg/L鹽酸吡哆醇0.5 mg/L甘氨酸 2 mg/L2.1/2MS培養(yǎng)基，即大量元素減半的MS培養(yǎng)基(Murashing and Skoogmedium，1962)標(biāo)準(zhǔn)配方NH4NO3825 mg/LKNO3950 mg/LCaCl2·2H2O 220 mg/LMgSO4·7H2O 185 mg/LKH2PO485 mg/LKI 0.83 mg/LH3BO36.2 mg/LMnSO4·H2O 16.9 mg/LZnSO4·7H2O 8.6 mg/LNa2MoO4·2H20.25 mg/LCuSO4·5H2O 0.025 mg/LCoCl2·6H2O 0.025 mg/LFeSO4·7H2O27.8 mg/LNa2-EDTA37.3 mg/L肌醇 100 mg/L煙酸 0.5 mg/L鹽酸硫胺素0.1 mg/L鹽酸吡哆醇0.5 mg/L甘氨酸 2 mg/L3.MS改良培養(yǎng)基配方NH4NO31200 mg/LKNO31000 mg/LCaCl2·2H2O 440 mg/LMgSO4·7H2O 370 mg/LKH2PO4170 mg/LKI 0.83 mg/LH3BO36.2 mg/LMnSO4·H2O 16.9 mg/LZnSO4·7H2O 8.6 mg/LNa2MoO4·2H2O 0.25 mg/LCuSO4·5H2O 0.025 mg/LCoCl2·6H2O 0.025 mg/LFeSO4·7H2O27.8 mg/LNa2-EDTA37.3 mg/L肌醇 100 mg/L煙酸 0.5 mg/L
鹽酸硫胺素0.1 mg/L鹽酸吡哆醇0.5 mg/L甘氨酸 2 mg/L4.White培養(yǎng)基(1964)標(biāo)準(zhǔn)配方Ca(NO3)2·4H2O 300 mg/LKNO380 mg/LMgSO4·7H2O 740 mg/LNaH2PO4·H2O 16.5 mg/LKI0.75 mg/LKCl 65 mg/LNa2SO4200 mg/LH3BO31.5 mg/LMnSO4·4H2O7 mg/LZnSO4·7H2O3 mg/LMoO30.001 mg/LFeSO4·7H2O 27.8 mg/LNa2-EDTA 37.3 mg/L肌醇 10.0 mg/L煙酸 0.1 mg/L鹽酸硫胺素 1.0 mg/L鹽酸吡哆醇 0.1 mg/L四

圖1為2，4-D濃度與胚性愈傷誘導(dǎo)率的關(guān)系曲線。圖中的橫坐標(biāo)軸表示2，4-D的濃度，單位為mg/L，縱坐標(biāo)為誘導(dǎo)率(％)。
圖2為細(xì)胞分裂素ZT與胚狀體誘導(dǎo)效率之間的關(guān)系曲線。圖中的橫坐標(biāo)軸表示細(xì)胞分裂素ZT的濃度，單位為mg/L，縱坐標(biāo)為誘導(dǎo)率(％)。
五具體實(shí)施例方式
以下是采用本發(fā)明的典型實(shí)施例1.采用未成熟合子胚進(jìn)行胚性愈傷組織的誘導(dǎo)。春季人工授粉，盛夏收集聚合翅果，將采下的聚合翅果于4℃條件下低溫冷藏4～6天，剖開且剪去翅膀。用洗潔精清洗種子，以除去其表面的油污，自來(lái)水沖洗30分鐘，蒸餾水沖洗3次，75％的乙醇處理20秒，0.1％的氯化汞4分30秒，無(wú)菌水沖洗4次。無(wú)菌狀態(tài)下，剝?nèi)シN皮，將未成熟胚接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基。
胚性愈傷誘導(dǎo)階段采用1/2MS培養(yǎng)基，附加激素是濃度分別為2，4-D 0.5，1.0，1.5，2.0，3.0，4.0，5.0mg/L，6-BA 0，0.1，0.2，0.4，0.5mg/L。添加500～1000mg/L的天然復(fù)合物水解酪蛋白。維生素C 5mg/L，培養(yǎng)基中含蔗糖4％，瓊脂0.65％，滅菌前將pH調(diào)至pH 5.7，121℃高溫、高壓滅菌16分鐘，培養(yǎng)溫度24～26℃，黑暗條件下培養(yǎng)，每二十天繼代培養(yǎng)一次。
幼胚接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基后約15天開始啟動(dòng)，長(zhǎng)出的愈傷組織色淡，晶瑩，透明。25天左右，有些發(fā)生少許褐變，經(jīng)繼代后，褐變停止，并開始長(zhǎng)出白色快速增殖的胚性愈傷組織，10天左右的時(shí)間，即可長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)瓶。這種愈傷組織在解剖鏡下觀察，多為圓球狀，水分含量多，細(xì)胞質(zhì)稀薄的薄壁細(xì)胞。
各種濃度的2，4-D均能誘導(dǎo)胚性愈傷組織產(chǎn)生，但濃度過(guò)低，胚性細(xì)胞生長(zhǎng)太慢，濃度過(guò)高，長(zhǎng)勢(shì)過(guò)于迅猛，胚性細(xì)胞狀態(tài)不易調(diào)整。結(jié)果表明，2，4-D1.5，2.0，3.0三種濃度較為合適。
2，4-D對(duì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響參見附圖1。
同時(shí)，比較了合子胚發(fā)育階段(聚合翅果采集時(shí)間)對(duì)體胚發(fā)生的影響。表1說(shuō)明聚合翅果采集時(shí)間即幼胚發(fā)育階段，對(duì)體細(xì)胞胚胎的誘導(dǎo)起著至關(guān)重要的作用，球形期至子葉期的幼胚對(duì)體胚誘導(dǎo)都有效。但是采集時(shí)間過(guò)早幼胚發(fā)育不好，采集過(guò)遲胚胎已經(jīng)發(fā)育成熟，都不利于體胚的誘導(dǎo)。
幼胚發(fā)育階段對(duì)體細(xì)胞胚胎發(fā)生的影響參見表1。
表1幼胚發(fā)育階段對(duì)體細(xì)胞胚胎發(fā)生的影響

+表示能夠誘導(dǎo)體胚發(fā)生-表示不能誘導(dǎo)體胚發(fā)生2.胚性愈傷組織的增殖階段，繼續(xù)使用1/2MS基本培養(yǎng)基，及時(shí)降低生長(zhǎng)素2，4-D濃度為0，0.1，0.2，0.4，0.5mg/L，細(xì)胞分裂素BA的濃度為0，0.1，0.25mg/L，水解酪蛋白濃度保持不變。大量研究表明，誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎，第一階段需要高濃度的生長(zhǎng)素，如2，4-D、NAA，此時(shí)外植體脫分化形成愈傷組織，即而誘導(dǎo)形成胚性細(xì)胞；第二階段體細(xì)胞胚胎的形成和發(fā)育，必須降低2，4-D的濃度或完全除去。降低外源生長(zhǎng)素的含量，愈傷組織細(xì)胞生長(zhǎng)速度得到控制，有利于原始胚性細(xì)胞的形成。
3.胚性愈傷組織的狀態(tài)調(diào)整，基本培養(yǎng)基改用MS培養(yǎng)基，并提高蔗糖濃度至50～60g/L以提高滲透壓，激素濃度與增殖階段相同。試驗(yàn)證明，滲透壓對(duì)體細(xì)胞胚胎的形成起著重要的作用，在胚狀體形成階段，滲透壓可能達(dá)到200～400mM/kg左右。在試驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)，隨著滲透壓的提高愈傷組織含水量逐漸減少而變得干燥，緊密。培養(yǎng)一個(gè)月后，形成顆粒狀的愈傷組織，進(jìn)而發(fā)育成胚狀體。說(shuō)明隨著滲透壓的提高，體胚誘導(dǎo)能力增強(qiáng)。但是滲透壓過(guò)高，超出一定范圍，其誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎的能力反而下降，在本發(fā)明中，蔗糖濃度60g/L時(shí)的滲透壓為最適滲透壓。
蔗糖濃度對(duì)體胚發(fā)生的影響見表2。
表2蔗糖濃度對(duì)體胚發(fā)生的影響 4.胚狀體的發(fā)生，MS基本培養(yǎng)基，附加的激素組合分別是0.5，1.0，2.0，4.0，5.0 mg/L的ZT，0，0.1，0.5，1.0mg/L的IAA，這時(shí)培養(yǎng)基中的蔗糖濃度降低為30g/L。
細(xì)胞分裂素ZT，對(duì)體細(xì)胞胚胎的形成起著重要的作用。在高濃度的生長(zhǎng)素的作用下，細(xì)胞生長(zhǎng)速度很快，這樣形成大量的薄壁細(xì)胞并不有利于體細(xì)胞胚胎的形成，而細(xì)胞分裂素ZT，可以中和生長(zhǎng)素的后續(xù)效應(yīng)，調(diào)整細(xì)胞狀態(tài)，減慢細(xì)胞生長(zhǎng)速度，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間以后，愈傷組織逐漸由水浸狀變?yōu)轭w粒狀，發(fā)育形成胚狀體。胚性細(xì)胞呈卵圓形，細(xì)胞核大，核仁明顯，核中移，線粒體、質(zhì)體、核糖體、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器增多，淀粉粒、脂滴積累，有較活躍的自體吞噬現(xiàn)象，在細(xì)胞核、液泡膜、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等部位有較高的ATP酶活性。并且在含ZT的培養(yǎng)基中，隨著ZT濃度升高，誘導(dǎo)率也呈梯度上升，說(shuō)明ZT濃度與誘導(dǎo)效率存在正相關(guān)，但ZT濃度過(guò)高，也會(huì)有副作用。
ZT與胚狀體誘導(dǎo)效率之間的關(guān)系參見附圖2。
5.胚狀體的發(fā)育和成熟。球形胚形成以后，轉(zhuǎn)入MS改良培養(yǎng)基使其繼續(xù)發(fā)育，球形胚經(jīng)過(guò)近兩個(gè)月的發(fā)育，會(huì)依次經(jīng)過(guò)球形胚、心形胚、魚雷胚和子葉胚階段而發(fā)育成苗。
在本發(fā)明改良培養(yǎng)基上，成功地調(diào)整了胚性細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，使得體細(xì)胞胚胎發(fā)生中最難的關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題——畸形苗的發(fā)生得到有效控制，并且胚性愈傷組織上會(huì)不斷分化形成新的胚狀體，繁殖系數(shù)大，在直徑為1厘米的胚性愈傷組織上，通?？煽吹?0～20個(gè)子葉胚發(fā)育。
另外，由于體細(xì)胞胚胎發(fā)生具有兩極性的特點(diǎn)，所以，胚狀體同時(shí)形成芽和根，成為完整的幼苗，很好地解決了組織培養(yǎng)中生根難的問(wèn)題。
6.幼苗在White培養(yǎng)基上發(fā)育成小植株，繼續(xù)降低蔗糖濃度為20g/L。體細(xì)胞胚胎發(fā)生中另外一個(gè)難題是很難形成發(fā)達(dá)的根系，解決的辦法是降滲，即降低蔗糖濃度和無(wú)機(jī)鹽濃度，抑制主根過(guò)度延長(zhǎng)，必要時(shí)可加入0.1mg/L的IBA，這樣可以誘導(dǎo)根系發(fā)達(dá)的須根系統(tǒng)。
7.移苗定植階段。體胚發(fā)芽后，瓶苗長(zhǎng)至2厘米高，且根葉發(fā)達(dá)時(shí)，從瓶中取出洗去幼苗根部培養(yǎng)基，植入主要由珍珠巖構(gòu)成的基質(zhì)中。移苗后一周內(nèi)濕度保持在95～100％，一個(gè)月內(nèi)的管理要特別細(xì)致，注意濕度與溫度的協(xié)調(diào)。移苗后一個(gè)星期，可以開始葉面施肥，成活后就可以根部施肥，并按常規(guī)苗木栽培工藝進(jìn)行定植。
采用本發(fā)明提供的技術(shù)，可以為雜交鵝掌楸的工廠化無(wú)性繁殖育苗提供一種周期短、繁殖率高、成本低廉的方法。突破了鵝掌楸天然結(jié)實(shí)率低，扦插困難，種苗繁殖技術(shù)無(wú)法滿足大面積植樹造林需要的限制。
權(quán)利要求
1.雜交鵝掌楸體細(xì)胞胚胎發(fā)生與植株再生技術(shù)，其特征在于采集人工雜交授粉發(fā)育的雜交鵝掌楸聚合翅果，在無(wú)菌條件下，分離球形期至子葉期的未成熟合子胚進(jìn)行體胚發(fā)生培養(yǎng)。
2.如權(quán)利要求1所述的雜交鵝掌楸體細(xì)胞胚胎發(fā)生與植株再生技術(shù)，其特征在于體胚發(fā)生培養(yǎng)的不同發(fā)育階段使用不同的培養(yǎng)基配方，即a.胚性愈傷誘導(dǎo)階段采用1/2MS基本培養(yǎng)基，附加濃度為0.5～5.0mg/L的2，4-D，0～0.5mg/L的6-芐胺基嘌呤(BA)，500～1000mg/L的天然復(fù)合物水解酪蛋白和1～5mg/L的維生素C；b.胚性愈傷組織的增殖階段，繼續(xù)使用1/2MS基本培養(yǎng)基。附加濃度為0～0.5mg/L的2，4-D，0～0.25mg/L的6-芐胺基嘌呤(BA)，500～1000mg/L的天然復(fù)合物水解酪蛋白和1～5mg/L的維生素C；c.胚性愈傷組織的狀態(tài)調(diào)整階段，采用MS基本培養(yǎng)基，蔗糖濃度控制為50～60g/L，附加濃度為0～0.5mg/L的2，4-D，0～0.25mg/L的6-芐胺基嘌呤(BA)，500～1000mg/L的天然復(fù)合物水解酪蛋白和1～5mg/L的維生素C；d.胚狀體的發(fā)生階段，采用MS基本培養(yǎng)基，附加濃度為0.5～5.0mg/L的ZT，0～1.0mg/L的IAA；e.球形胚形成以后階段，采用MS改良培養(yǎng)基；f.體胚植株再生階段，采用White培養(yǎng)基。
3.如權(quán)利要求2所述的雜交鵝掌楸體細(xì)胞胚胎發(fā)生與植株再生技術(shù)，其特征在于a.胚性愈傷誘導(dǎo)階段，2，4-D的最佳值為1.5～3.0mg/L；b.胚性愈傷組織的狀態(tài)調(diào)整階段，蔗糖濃度的最佳值為60g/L；c.胚狀體的發(fā)生階段，玉米素ZT的最佳值為2～4mg/L。
全文摘要
鵝掌楸屬種間雜交在生長(zhǎng)、抗逆性和觀賞性方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)。但鵝掌楸天然結(jié)實(shí)率低,有性繁殖能力差;扦插技術(shù)要求高,成活率也很低,不能滿足生產(chǎn)應(yīng)用的需要。本發(fā)明的特征是在鵝掌楸屬雜交親本選擇和種間雜交育種的基礎(chǔ)上,分別將正交、反交和回交制種所得數(shù)量有限的未成熟胚進(jìn)行體細(xì)胞胚胎發(fā)生的誘導(dǎo)和培養(yǎng),形成大量同步發(fā)育的體細(xì)胞胚,進(jìn)而將體細(xì)胞胚培育成為完整的植株。利用本發(fā)明所提供的方法,可實(shí)現(xiàn)雜交鵝掌楸苗木的大規(guī)模、短周期、高繁殖率、低成本的工廠化生產(chǎn)和產(chǎn)業(yè)化開發(fā)。
文檔編號(hào)A01H4/00GK1375191SQ02112948
公開日2002年10月23日 申請(qǐng)日期2002年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月29日
發(fā)明者施季森, 陳金慧, 諸葛強(qiáng), 黃敏仁 申請(qǐng)人:南京林業(yè)大學(xué)