一種制備絞股藍/絲瓜雜交細胞提取物的方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物美容領(lǐng)域，具體涉及具有美容功效的絞股藍/絲瓜雜交細胞提取 物在美容護膚中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 絞股藍又名七葉膽、五葉參、七葉參等，為萌蘆科絞股藍屬多年生草質(zhì)藤本植物。 絞股藍營養(yǎng)豐富，生理活性廣泛，對機體調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、抗腫瘤、降血脂、鎮(zhèn)痛、防衰老和延 年益壽均有良效，被譽為"南方人參"、"長壽保健品"。其細胞提取物中含多種活性成分，例 如：絞股藍皂苷，黃酮類化合物，多糖，維生素及多種微量元素，具有抗衰老，抗氧化等功效。
[0003] 絲瓜，是一種常見的食用蔬菜，其在美容上的功效自古由來，國內(nèi)民間很早已知收 集絲瓜莖汁，稱"天羅水"（絲瓜古亦稱"天羅"《事類臺壁》）用來搽面營養(yǎng)皮膚，作為美容 液。與絞股藍一樣，它也含有與人參相同的人參皂苷，除此以外，其細胞提取物還含有許多 三萜類化合物，多糖等，具有抗炎、殺蟲滅菌、曬后修復(fù)、美白保濕等功效。
[0004] 但絞股藍和絲瓜的植株生長需要多年時間，而且受到地域，氣候，季節(jié)以及病蟲害 等的影響與威脅，其植株提取物品質(zhì)不穩(wěn)定，因此效果難以控制。此外，單種類的絞股藍或 絲瓜的提取物美容護膚效果單一，難易滿足市場的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的提供了一種對絞股藍和絲 瓜進行雜交得到雜交細胞系的方法，不僅質(zhì)量可控，而且效果比單種植物來源的細胞系效 果更佳，且對生物體無毒。
[0006] 通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：
[0007] 一種制備絞股藍/絲瓜雜交細胞提取物的方法，包括以下步驟：
[0008] (1)獲取原生質(zhì)體：
[0009] 1)配制酶液：分別選取質(zhì)量分數(shù)為1.0-2. 0 %纖維素酶、0. 1-0. 2 %果膠酶、 6-12 %甘露醇及CPW洗液配制成酶液；
[0010] 2)分別選取絞股藍和絲瓜的愈傷組織細胞進行如下處理：按愈傷組織細胞與 酶液質(zhì)量比為（1-3) :10的比例將所述絞股藍或絲瓜的愈傷組織細胞中加入酶液中，在 23~30°C黑暗環(huán)境中，轉(zhuǎn)速為50~100r/min的條件下酶解8~12h,過濾并收集濾液 置于離心管中，100g_300g離心2-15min后棄去上清液；用CPW洗液懸浮沉淀，混合均勻后 取100g-300g離心2-15min，棄去上清液；然后用含0. 2-0. 4M甘露醇的MS液態(tài)培養(yǎng)基和 0. 2-0. 4M甘露醇的原生質(zhì)體培養(yǎng)基洗滌；接著用含0. 2M甘露醇的原生質(zhì)體培養(yǎng)基重懸沉 淀得到絞股藍原生質(zhì)體或絲瓜原生質(zhì)體；并分別對絞股藍原生質(zhì)體、絲瓜原生質(zhì)體進行標(biāo) 記；
[0011] (2)絞股藍原生質(zhì)體和絲瓜原生質(zhì)體融合及篩選：
[0012] 1)融合：將絞股藍原生質(zhì)體和絲瓜原生質(zhì)體等體積混合成混合液后靜置，采用細 胞融合儀進行融合，融合后靜置，并加入原生質(zhì)體培養(yǎng)基進行離心，離心后將沉淀重懸；[0013] 2)雜交原生質(zhì)體篩選：
[0014] 選出雜交原生質(zhì)體培養(yǎng)，待長出愈傷組織后進行繼代培養(yǎng)；
[0015] (3)雜交細胞提取物的制備：將繼代培養(yǎng)后的絞股藍/絲瓜雜交細胞超聲破碎，過 濾后，冷凍干燥。
[0016]所述CPW洗液由 101mg/LKN03、27mg/LKH2P04、246mg/LMgS04. 7H20、1480mg/ LCaCl2. 2H20配制而成。
[0017] 所述步驟⑴中過濾采用孔徑不大于70ym網(wǎng)篩過濾；重復(fù)所述CPW洗液懸浮沉 淀并離心除去上清液不少于2次；原生質(zhì)體培養(yǎng)基的用量為酶液體積的1/4~1/5。
[0018] 所述步驟（1)中對絞股藍原生質(zhì)體或絲瓜原生質(zhì)體采用不同顏色的熒光染料進 行標(biāo)記。
[0019] 所述步驟（2)中絞股藍原生質(zhì)體和絲瓜原生質(zhì)體混合液于融合池靜置；電融合液 為0. 6moL/L甘露醇和0.ImmoL/LCaCl2，將電融合液的pH為7. 0-7. 5
[0020] 所述步驟（2)中所述絞股藍原生質(zhì)體和絲瓜原生質(zhì)體融合后靜置20-30min，然后 轉(zhuǎn)入離心管，加10倍于混合液體積的原生質(zhì)體培養(yǎng)基，200g離心5min,離心后的沉淀用原 生質(zhì)體培養(yǎng)基重懸稀釋，采用淺層液態(tài)培養(yǎng)法培養(yǎng)；將所述雜交原生質(zhì)體篩選出來后，在黑 暗環(huán)境下于25°C±2°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；所述雜交原生質(zhì)體長出愈傷組織后每三周繼代培 養(yǎng)一次。
[0021] 步驟（3)中將所述繼代培養(yǎng)后的絞股藍/絲瓜雜交細胞超聲破碎，并采用不小于 0. 22ym過濾器過濾，于（_100°C)-(-60°C)環(huán)境下冷凍干燥。
[0022] 本發(fā)明所述的方法制得的絞股藍/絲瓜雜交細胞提取物在護膚品中應(yīng)用。
[0023] 優(yōu)選的，所述護膚品為面膜、爽膚水、面霜、乳液、眼霜、洗面乳。
[0024] 優(yōu)選的，所述絞股藍/絲瓜雜交細胞提取物在護膚品中的添加量為10-50 y g/ml。
[0025] 有益效果：
[0026] 1、質(zhì)量可控。采用細胞系提取物，比用植株提取物，生產(chǎn)質(zhì)量更加可控。因為不會 受地域，季節(jié)，氣候，病蟲害影響。
[0027] 2、效果更佳且無毒。采用電熔合法對絞股藍和絲瓜原生質(zhì)體融合得到雜交的細胞 系，實驗表明效果比單種植物來源的細胞系能綜合兩植物的功效其效果更佳且對生物體無 毒。
【附圖說明】
[0028] 圖1各細胞提取物的抗氧化效果圖
[0029] 圖2各細胞提取物對光老化人皮膚纖維細胞凋亡的影響圖
[0030] 圖3各細胞0D值示意圖
【具體實施方式】
[0031] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明 進行進一步詳細說明。
[0032] 實施例1
[0033] 制備絞股藍/絲瓜雜交細胞提取物、絞股藍細胞提取物、絲瓜細胞提取物的制備
[0034] 1、制備絞股藍/絲瓜雜交細胞提取物
[0035] (1)獲取絞股藍和絲瓜原生質(zhì)體
[0036] 1)配制酶液：分別選取質(zhì)量分數(shù)為1.0%纖維素酶、0.1%果膠酶、8%甘露醇及 CPW洗液（101mg/LKN03、27mg/LKH2P04、246mg/LMgS04.7H20、1480mg/LCaCl2.2H20)配制成酶 液，過濾除菌。
[0037] 2)分別選取絞股藍和絲瓜的愈傷組織細胞進行如下處理：在每lg所述絞股藍或 絲瓜的愈傷組織細胞中加入l〇ml酶液，在27°C和黑暗環(huán)境中，及轉(zhuǎn)速控制在50r/min的條 件下酶解8h，將酶解后的原生質(zhì)體通過70ym孔徑的一次性網(wǎng)篩過濾，以除去未酶解完全 的細胞團。收集濾液置于離心管中，200g離心5min后棄去的上清液；用CPW洗液懸浮沉淀， 混合均勻后取200g離心5min，棄去上清液，重復(fù)此步驟3次；然后用MS液體培養(yǎng)基洗滌1 次；接著用2mL原生質(zhì)體培養(yǎng)基懸浮沉淀得到絞股藍原生質(zhì)體或絲瓜原生質(zhì)體；
[0038] 往絞股藍原生質(zhì)體中標(biāo)記紅色熒光染料，絲瓜原生質(zhì)體中標(biāo)記綠色熒光染料。
[0039] (2)絞股藍原生質(zhì)體和絲瓜原生質(zhì)體融合及篩選：
[0040] 采用電融合法進行絞股藍及絲瓜原生質(zhì)體融合。電融合液為0. 6m〇L/L甘露醇 和0.lmm〇L/LCaCL2,pH為7. 0,并對電融合液進行高壓滅菌，原生質(zhì)體用電融合液重懸后， 200g離心5min，然后用電融合液懸浮備用。
[0041] 1)融合：將絞股藍原生質(zhì)體和絲瓜原生質(zhì)體等體積混合成混合液，將融合液至融 合池中靜置lOmin左右，待原生質(zhì)體沉淀穩(wěn)定后在交流電場強度100V/cm、交流電場作用時 間為35s、直流脈沖強度為lOOOV/cm、直流脈沖作用時間為50ys、直流脈沖次數(shù)為3次、直 流脈沖間隔時間為2s的條件下進行融合；融合后靜置30min，然后轉(zhuǎn)入15mL離心管，加原 生質(zhì)體培養(yǎng)基至8mL，800r/min離心6min。沉淀用原生質(zhì)體培養(yǎng)基稀釋至低密度（5xl04個 /mL)，吸取lmL于直徑3. 5cm的培養(yǎng)皿中。
[0042] 2)雜交原生質(zhì)體篩選：
[0043] 在熒光顯微鏡下，把紅綠相間或褐色的原生質(zhì)體標(biāo)記出來，放入溫度25°C的培養(yǎng) 箱中黑暗條件下進行培養(yǎng)。待長出愈傷組織后，每三周繼代一次。
[0044] (3)雜交細胞提取物的制備：取擴增后的絞股藍/絲瓜雜交細胞，加入適量超純水 后，超聲破碎，300g離心5min后，過0. 22ym濾膜，用BCA試劑盒測定蛋白濃度后，備用。
[0045] 2、制備絞股藍細胞提取物：制備方法同制備絞股藍/絲瓜雜交細胞提取物的方 法。
[0046] 3、絲瓜細胞提取物的制備：制備方法同制備絞股藍/絲瓜雜交細胞提取物的方 法。
[0047] 實施例2 :絞股藍/絲瓜雜交細胞提取物、絞股藍細胞提取物、絲瓜細胞提取物的 抗氧化實驗
[0048] 采用DPPH法測定實例一制備的絞股藍/絲瓜雜交細胞提取物、絞股藍細胞提取 物、絲瓜細胞提取物清除自由基的能力。
[0049] 將絞股藍/絲瓜雜交細胞提取物、絞股藍細胞提取物、絲瓜細胞提取物配制成濃 度為0. 2mg/mL溶液，分別作為實驗組。采用0. 2mg/ml的抗壞血酸（VC)作為陽性對照組。 將絞股藍/絲瓜雜交細胞提取物、絞股藍細胞提取物、絲瓜細胞提取物分別與0. 2mg/ml的 DPPH等體積反應(yīng)完全且30min后，記錄最終吸光度。
[0050] 其中，自由基清除率（％ ) =[1_(樣本加入DPPH的吸光度-樣本的吸光度）/ DPPH的吸光度]X100%
[0051] 由圖1可知，絞股藍/絲瓜雜交細胞提取物、絞股藍細胞提取物、絲瓜細胞提取物 三種樣品均有不同程度的對抗自由基作用，其中絞股藍/絲瓜雜交細胞提取物樣品的效果 最佳。
[0052] 實施例3 :絞股藍/絲瓜雜交細胞提取物、絞股藍細胞提取物、絲瓜細胞提取物對 光老化人皮膚纖維細胞凋亡的影響
[0053] 制備絞股藍/絲瓜雜交細胞提取物、絞股藍細胞提取物、絲瓜細胞提取物的制備
[0054] 1、制備絞股藍/絲瓜雜交細胞提取物
[0055] (1)獲取絞股藍和絲瓜原生質(zhì)體
[0056] 1)配制酶液：分別選取質(zhì)量分數(shù)為2. 0%纖維素酶、0. 2%果膠酶、12%甘露醇及 CPW洗液（101mg/LKN03、27mg/LKH2P04、246mg/LMgS04.7H20、1480mg/LCaCl2.2H20)配制成酶 液，過濾除菌。
[0057] 2)分別選取絞股藍和絲瓜的愈傷組織細胞進行如下處理：在每3g所述絞股藍或 絲瓜的愈傷組織細胞中加入l〇ml酶液，在30°C和黑暗環(huán)境中，及轉(zhuǎn)速控制在100r/min的條 件下酶解12h，將酶解后的原生質(zhì)體通過70ym孔徑的一次性網(wǎng)篩過濾，以除去未酶解完全 的細胞團。收集濾液置于離心管中，在離心力為200g下離心5min后棄去的上清液；用CPW 洗液懸浮沉淀，混合均勻后在離心力200g下離心5min，棄去上清液，重復(fù)此步驟3次；然后 用MS液體培養(yǎng)基洗滌1次；接著用2mL原生質(zhì)體培養(yǎng)基懸浮沉淀得到絞股藍原生質(zhì)體或絲 瓜原生質(zhì)體；往絞股藍原生質(zhì)體中標(biāo)記紅色熒光染料，絲瓜原生質(zhì)體中標(biāo)記綠色熒光染料。
[0058] (2)絞股藍原生質(zhì)體和絲瓜原生質(zhì)體融合及篩選：
[0059] 采用電融合法進行絞股藍及絲瓜原生質(zhì)體融合。電融合液為0.6m〇L/L甘露醇和 0.lmm〇L/LCaCL2,pH