一種具有促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的山核桃提取物的提取方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種具有促進(jìn)人類神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的山核桃提取物的提取方法，該方法由以下步驟組成：采摘成熟的山核桃，風(fēng)干后去殼得山核桃仁；將山核桃仁進(jìn)行液氮速凍0.5min-10min后棄去液氮，得速凍后的山核桃仁；將速凍后的山核桃仁用粉碎機(jī)粉碎，得山核桃粉末；山核桃粉末用石油醚水浴加熱回流萃取，得萃取液；萃取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)直至石油醚完全蒸發(fā)，得山核桃提取物。本發(fā)明提取工藝簡(jiǎn)單易行，采用該方法提取的山核桃提物，具有顯著的促進(jìn)人類神經(jīng)細(xì)胞突觸生長(zhǎng)、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用。
【專利說明】—種具有促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的山核桃提取物的提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物提取【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種具有促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的山核桃提取物的提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002]根據(jù)第五次全國(guó)人口普查的資料，2000年我國(guó)已經(jīng)步入了老齡化社會(huì)，而且老齡化進(jìn)程在不斷加快。截至到2007年底，我國(guó)65歲及以上人口占總?cè)丝诘谋壤堰_(dá)9.35%。根據(jù)聯(lián)合國(guó)預(yù)測(cè)，到2030年，這一比例在我國(guó)將達(dá)到15.9% ;到2050年，將增至23.3%。從絕對(duì)數(shù)看，2010年，我國(guó)65歲及以上人口數(shù)量達(dá)到1.11億；2020年將達(dá)到1.8億，2030年將高達(dá)2.36億，2050年更高達(dá)3.31億。21世紀(jì)的中國(guó)將是不可逆轉(zhuǎn)的老齡化社會(huì)，這不僅僅是老齡化的人口結(jié)構(gòu)的問題，更是潛在的健康問題，尤其是神經(jīng)方面的健康問題?，F(xiàn)今生活壓力普遍增大，年輕時(shí)拼命賺錢，老來拿錢買命，這種狀況導(dǎo)致如今的老年人疾病和生理紊亂等風(fēng)險(xiǎn)升高，慢性病患病率不斷增加，包括神經(jīng)衰退、腦血管病、糖尿病等。另外老年人由于缺少足夠的陪伴，孤獨(dú)感倍增，神經(jīng)衰退更加明顯，患神經(jīng)方面的疾病的風(fēng)險(xiǎn)也上升，這是個(gè)潛在的健康難題。[0003]山核桃是補(bǔ)腦的綠色食品，常食山核桃，還具有健脾開胃，潤(rùn)肺強(qiáng)腎、滋補(bǔ)康復(fù)、預(yù)防冠心病、降低血脂之功效，其中補(bǔ)腦健腦功效更是人盡皆知。古人李時(shí)珍有說:核桃能“補(bǔ)腎通腦，有益智慧”，且在《本草綱目》記載，山核桃味甘性平，能補(bǔ)氣益血，調(diào)燥化痰，溫補(bǔ)腎肺，定喘。經(jīng)常吃山核桃能滋養(yǎng)血脈、增進(jìn)食欲、烏黑須發(fā)，而且還能醫(yī)神經(jīng)衰弱、記憶衰退等疾患，所以民間有“常食核桃油，白發(fā)老翁戲牦?！敝r語。從現(xiàn)代營(yíng)養(yǎng)學(xué)、生命科學(xué)的角度來看，山核桃中含有17種氨基酸，總量達(dá)到27.20%,其中谷氨酸含量最高，占氨基酸中的20.19%，而谷氨酸具有健腦作用，能促進(jìn)腦細(xì)胞進(jìn)行呼吸，有利于腦組織中代謝產(chǎn)物氨的排除，保護(hù)腦組織免受氨中毒。另外核仁中還含有8種脂肪酸，總含油率為69.8~74.0%，其中不飽和脂肪酸占總脂肪酸的88.38~95.78%，主要有油酸、亞油酸，這些是人體所必需的且人體又不能自身合成的脂肪酸。有研究表明，核桃油含有的抗氧化劑可以消除體內(nèi)自由基，恢復(fù)人體臟腑器官的健康狀態(tài)，能防止腦衰老，并能延年益壽，另外山核桃油中含有豐富的微量元素角鯊烯、黃酮類物質(zhì)和多酚化合物等，能增強(qiáng)人體的免疫力，延緩衰老。科學(xué)調(diào)查的結(jié)果證明，由于長(zhǎng)期食用核桃油，地中海沿岸居民很多健康的身體指標(biāo)都居世界前列。用核桃油做食用油，可以形成真正健康合理的膳食結(jié)構(gòu)。地中海成為世界三大疾病(老年癡呆癥、心腦血管疾病、腫瘤)發(fā)病率最低的地區(qū)。核桃油產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)成分中，人體不能合成的亞麻酸和亞油酸的比值和母乳相似，且極易吸收，能促進(jìn)嬰幼兒神經(jīng)和骨骼的生長(zhǎng)發(fā)育，因此，亦是孕婦極佳的營(yíng)養(yǎng)品和胎兒生長(zhǎng)劑。
[0004]有大量文獻(xiàn)及民間證據(jù)表明，山核桃油是具有補(bǔ)腦功效的，然而對(duì)于其補(bǔ)腦健腦的效果、作用機(jī)制及具體功能因子(物質(zhì)基礎(chǔ))的發(fā)掘做的還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。眾所周知，山核桃營(yíng)養(yǎng)豐富，民間普遍認(rèn)為是補(bǔ)腦的好食品，但近幾年的研究基本關(guān)注于山核桃和某些提取物的作用表型和效果的研究，例如以小鼠為模型，研究山核桃對(duì)于學(xué)習(xí)能力和記憶能力的影響，很少對(duì)山核桃及其提取物神經(jīng)保護(hù)作用的作用機(jī)理進(jìn)行研究。
[0005]SH-SY5Y是來源于1970年建立的人類神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者的轉(zhuǎn)移骨瘤灶細(xì)胞株，該細(xì)胞株表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞特有的多巴胺-β-羥基酶活性及其它神經(jīng)細(xì)胞特有的結(jié)構(gòu)蛋白，如神經(jīng)纖維蛋白NF58、NF160和NF200等，因此該細(xì)胞模型被廣泛地應(yīng)用在神經(jīng)生物學(xué)、神經(jīng)化學(xué)和神經(jīng)毒理學(xué)的研究中，是一個(gè)成熟的體外神經(jīng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，可以用來檢測(cè)活性化合物對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育和受傷神經(jīng)細(xì)胞功能的修復(fù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種具有促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的山核桃提取物的提取方法。
[0007]所述的一種具有促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的山核桃提取物的提取方法，其特征在于該方法由以下步驟組成:
1)預(yù)處理:采摘成熟的山核桃，風(fēng)干后去殼得山核桃仁；
2)液氮速凍:將步驟I)制得的山核桃仁進(jìn)行液氮速凍0.5min-10min后棄去液氮，得速凍后的山核桃仁；
3)粉碎:將步驟2)制得的速凍后的山核桃仁用粉碎機(jī)粉碎，得山核桃粉末；
4)石油醚萃取:將山核桃粉末用石油醚水浴加熱回流萃取，得萃取液；
5 )將萃取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)直至石油醚完全蒸發(fā)，得山核桃提取物。
[0008]所述的一種具有促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的山核桃提取物的提取方法，其特征在于步驟
2)中山核桃仁以料液的重量體積比為1:2-5的液氮進(jìn)行速凍。采用液氮處理即可有效保證山核桃仁內(nèi)含有的活性成分不被破壞，同時(shí)經(jīng)液氮處理后的山核桃仁變脆變硬，便于后續(xù)粉碎工藝的進(jìn)行。
[0009]所述的一種具有促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的山核桃提取物的提取方法，其特征在于步驟
3)中山核桃粉末過100目篩。
[0010]所述的一種具有促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的山核桃提取物的提取方法，其特征在于步驟
4)中山核桃粉末以料液的重量體積比為1:15-25的石油醚進(jìn)行水浴加熱回流萃取，萃取溫度50-80°C，萃取時(shí)間l_7h。
[0011]所述的一種具有促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的山核桃提取物的提取方法，其特征在于所述山核桃為產(chǎn)地臨安的山核桃。臨安山核桃產(chǎn)量豐富，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高。
[0012]本發(fā)明一種具有促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的山核桃提取物的提取方法，提取工藝簡(jiǎn)單易行，通過將山核桃仁液氮速凍，保證其活性成分不被破壞，同時(shí)方便粉碎成粉狀，石油醚萃取，可保證山核桃仁脂溶性成分被提出，以SH-SY5Y-EGFP (綠色熒光)為神經(jīng)細(xì)胞模型，用山核桃提取物處理神經(jīng)細(xì)胞，研究神經(jīng)細(xì)胞突觸的個(gè)數(shù)和長(zhǎng)度，為進(jìn)一步研究山核桃提取物對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用及其作用機(jī)制打下基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為空白組綠色熒光細(xì)胞突觸觀察圖；
圖2為實(shí)驗(yàn)組綠色熒光細(xì)胞突觸觀察圖；
圖3為陽性組綠色熒光細(xì)胞突觸觀察圖；圖4為實(shí)驗(yàn)組、空白組及陽性組突觸平均長(zhǎng)度圖；
圖5為實(shí)驗(yàn)組、空白組及陽性組40 μ m以上的突觸所占比例圖。
【具體實(shí)施方式】
[0014]本發(fā)明下面結(jié)合實(shí)施例予以進(jìn)一步詳述。其創(chuàng)新之處在于和其他普通提取物做產(chǎn)品不同，本發(fā)明利用人類神經(jīng)細(xì)胞模型，在細(xì)胞水平研究山核桃提取物促進(jìn)人類神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的作用機(jī)理，從而為山核桃提取物在食品保健領(lǐng)域的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，推動(dòng)山核桃深加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。
實(shí)施例
[0015]采摘成熟的臨安山核桃，于通風(fēng)處風(fēng)干后去殼得IOg鮮山核桃仁，然后迅速將IOg鮮核桃仁用20-50ml的液氮速凍0.5min-10min后棄去液氮,得速凍后的硬脆的山核桃仁；然后將速凍后的山核桃仁用粉碎機(jī)粉碎，過100目篩得山核桃粉末；山核桃粉末用150-250ml石油醚于水浴溫度為50_80°C的溫度條件下加熱回流萃取l_7h得萃取液；將萃取液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中直至石油醚完全揮發(fā)，得山核桃提取物6ml。
[0016]實(shí)驗(yàn)例
取山核桃提取物與DMSO按體積比1:3-8的比例進(jìn)行混合，然后于120-200rpm搖床上搖1-4小時(shí)充分混勻制得混合物，分別取2.5 μ 1、5 μ 1、10 μ I混合物作用于人類神經(jīng)細(xì)胞，每2-3天換細(xì)胞培養(yǎng)基一次，換培養(yǎng)基之后再次加入同樣量的混合物，連續(xù)培養(yǎng)5-10天，最后分別對(duì)應(yīng)制得山核桃提取物與培養(yǎng)基質(zhì)量體積濃度為0.lmg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml的三組實(shí)驗(yàn)例，觀察并統(tǒng)計(jì)神經(jīng)細(xì)胞突觸長(zhǎng)度，通過顯著性分析，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組與空白組有顯著性差異。其中，空白組為0.1%DMS0,陽性組為堿性纖維生長(zhǎng)因子bFGF。
[0017]表達(dá)綠色熒光蛋白EGFP的人類神經(jīng)細(xì)胞株SH-SY5Y-EGFP從杭州紐龍生物科技有限公司購得。
[0018]不同實(shí)驗(yàn)組、空白組及陽性組綠色熒光細(xì)胞突觸觀察圖，見圖1-3，由圖1-3可知:山核桃提取物具有促進(jìn)人類神經(jīng)細(xì)胞突觸生長(zhǎng)的作用。
[0019]三組實(shí)驗(yàn)例組成的實(shí)驗(yàn)組、空白組及陽性組對(duì)促進(jìn)人類神經(jīng)細(xì)胞突觸平均長(zhǎng)度的影響，見圖4，由圖4可知:山核桃提取物對(duì)人類神經(jīng)細(xì)胞突觸平均長(zhǎng)度的促進(jìn)作用隨著提取物劑量的增加而加強(qiáng)。
[0020]三組實(shí)驗(yàn)例組成的實(shí)驗(yàn)組、空白組及陽性組對(duì)促進(jìn)人類神經(jīng)細(xì)胞40 μ m以上突觸數(shù)量的影響；結(jié)果見圖5，由圖5可知:山核桃提取物顯著增加了人類神經(jīng)細(xì)胞40 μ m以上突觸的數(shù)量，并且這種促進(jìn)作用隨著提取物劑量的增加而加強(qiáng)。
[0021]由圖1-5可知:山核桃提取物具有顯著的促進(jìn)體外神經(jīng)母瘤細(xì)胞突觸增長(zhǎng)的作用。
【權(quán)利要求】
1.一種具有促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的山核桃提取物的提取方法，其特征在于該方法由以下步驟組成: 1)預(yù)處理:采摘成熟的山核桃，風(fēng)干后去殼得山核桃仁； 2)液氮速凍:將步驟1)制得的山核桃仁進(jìn)行液氮速凍0.5min-10min后棄去液氮，得速凍后的山核桃仁； 3)粉碎:將步驟2)制得的速凍后的山核桃仁用粉碎機(jī)粉碎，得山核桃粉末； 4)石油醚萃取:將山核桃粉末用石油醚水浴加熱回流萃取，得萃取液； 5 )將萃取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)直至石油醚完全蒸發(fā)，得山核桃提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的山核桃提取物的提取方法，其特征在于步驟2)中山核桃仁以料液的重量體積比為1:2-5的液氮進(jìn)行速凍。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的山核桃提取物的提取方法，其特征在于步驟3)中山核桃粉末過100目篩。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的山核桃提取物的提取方法，其特征在于步驟4)中山核桃粉末以料液的重量體積比為1:15-25的石油醚進(jìn)行水浴加熱回流萃取，萃取溫度50-80°C，萃取時(shí)間l_7h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的山核桃提取物的提取方法，其特征在于所述山核桃為產(chǎn)地臨安的山核桃。
【文檔編號(hào)】A61P25/00GK103893257SQ201410110290
【公開日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2014年3月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月24日
【發(fā)明者】錢永常, 黃堅(jiān)欽, 王向軍, 周瑜, 高飛 申請(qǐng)人:浙江農(nóng)林大學(xué)