雜交蕓苔屬植物及其生產(chǎn)方法
【專利說(shuō)明】雜交蕓苔屬植物及其生產(chǎn)方法 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因的蕓苔屬植物、植物材料和種子，特別是油籽油菜（oilseed rape)植物，其特征在于這些植物包含兩個(gè)特定轉(zhuǎn)化事件的組合，具體為在蕓苔屬基因組特 定位置存在雄性不育基因，和在蕓苔屬基因組另一特定位置存在育性恢復(fù)基因。本發(fā)明還 涉及一對(duì)轉(zhuǎn)基因蕓苔屬植物，特別是油籽油菜植物，其特別適于生產(chǎn)雜交種子。更具體地， 一種植物的特征為雄性不育，因?yàn)樵谄浠蚪M中存在雄性不育基因，而另一種植物的特征 為攜帶可阻止雄性不育基因活性的育性恢復(fù)基因。本發(fā)明的這對(duì)蕓苔屬植物將形成雜交種 子的能力與最佳總體農(nóng)學(xué)性能、遺傳穩(wěn)定性以及對(duì)不同遺傳背景的適應(yīng)性相結(jié)合。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 轉(zhuǎn)基因在植物中的表型表達(dá)由該基因自身的結(jié)構(gòu)及其在植物基因組中的位置來(lái) 決定。同時(shí)，（外源DNA中的）轉(zhuǎn)基因在基因組的不同位置存在，可以以不同方式影響植物 的總體表型。通過(guò)遺傳操作對(duì)植物從農(nóng)業(yè)上或工業(yè)上成功導(dǎo)入商業(yè)感興趣的性狀是一個(gè)漫 長(zhǎng)的、受不同因素影響的過(guò)程。經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化的植物的實(shí)際轉(zhuǎn)化和再生只是一系列選擇步驟 的第一步，其中所述選擇步驟包括廣泛的遺傳鑒定、育種及野外試驗(yàn)的評(píng)估。
[0004] 術(shù)語(yǔ)"油菜籽"（rapeseed)涵蓋蕓苔屬物種的各種種子。蕓苔屬（植物）作為最 有價(jià)值的油料作物在從中國(guó)和印度到芬蘭和加拿大廣泛種植。多數(shù)蕓苔屬種類屬于十字花 科家族。它們起源于二倍體物種，具有從7(地中海包心菜（Brassica fruticulosa))到 12 (白芥（Sinapsis alba))的非整倍體（aneuploid)染色體數(shù)。在加拿大最廣泛種植的蕓 苔屬物種為憲菁（turnip rape)，或 Brassica campestris(aa，n = 10)。甘藍(lán)（Brassica oleracea) (cc，n = 9)在近期進(jìn)化史中分化為至少六種園藝種類，包括椰菜，花椰菜和甘藍(lán) (cabbage)。黑芥（Brassica nigra) (bb，n = 8)或稱黑芥（black mustard)是商業(yè)上的 較不重要的作物，主要以其種子為人所知，芥末起初由其種子制得。從這些基本種類，在更 近期的進(jìn)化階段中通過(guò)互交（intercross)產(chǎn)生雙倍體雜種（amphiploid)。這之中最重要 的是歐洲油菜（Brassica napus) (aacc)以及芥菜（Brassica juncea) (aabb)或稱褐芥菜 (brown mustard)，前者的冬季種類在北歐提供了最高的油菜籽產(chǎn)量，后者為印度次大陸主 要的油料作物之一。盡管不同蕓苔屬物種（特別是那些基因組相容的）之間的互交是可 能的，并且經(jīng)常出于育種目的進(jìn)行互交，但不是所有的性狀（或基因）都能夠從一個(gè)物種轉(zhuǎn) 移到另一物種，或在轉(zhuǎn)移到不同物種時(shí)，不是所有的特性（或基因）都能夠保持相同的特征 (或表達(dá)模式）。因此，在一個(gè)蕓苔屬物種中賦予天然或嵌合基因最佳表達(dá)的遺傳基因座， 在另一物種中不一定具有相同的效果。
[0005] 蕓苔屬物種為兩性的，一般60-70%為自花傳粉。作為選擇基礎(chǔ)，雜交體的產(chǎn)生和 遺傳變異的導(dǎo)入通常依賴于對(duì)自然發(fā)生現(xiàn)象（例如自身不相容性和細(xì)胞質(zhì)雄性不育）的適 應(yīng)。在蕓苔屬育種中未廣泛使用人工授粉控制法例如手工去雄或使用殺配子劑，分別是因 為它們有限的實(shí)用性和高成本。
[0006] 已開發(fā)了用于產(chǎn)生雄性或雌性不育植物的轉(zhuǎn)基因方法，它們提供了有意義的常規(guī) 技術(shù)替代方法。
[0007] EP 0, 344, 029描述了用于獲得核雄性不育的體系，其中將植物用雄性不育基因 轉(zhuǎn)化，所述雄性不育基因包含例如在絨氈層（tapetum)特異啟動(dòng)子TA29控制下的編碼 芽孢桿菌RNA酶分子的DNA，當(dāng)該基因摻入植物中后，可選擇性破壞絨氈層細(xì)胞。用此 基因轉(zhuǎn)化煙草及油籽油菜植物導(dǎo)致花粉形成完全受阻的植物（Mariani等，1990, Nature 347:737-741)。
[0008] De Block和De Brouwer (1993, Planta 189:218-225)描述了包含嵌合PTA29:芽 孢桿菌RNA酶基因的歐洲油菜植物花藥發(fā)育的細(xì)胞化學(xué)和組織化學(xué)分析。
[0009] 為恢復(fù)雄性不育植物之子代的育性，開發(fā)了這樣的體系，其中雄性不育植物與攜 帶育性恢復(fù)基因的轉(zhuǎn)基因植物雜交，育性恢復(fù)基因在表達(dá)時(shí)可抑制或阻止雄性不育基因的 活性（US5, 689, 041;US5, 792, 929 ;De Block和De Brouwer,同上）。WO 96/26283中描 述了在雄性不育植物的生產(chǎn)中使用共同調(diào)節(jié)的（多個(gè)）基因以增加具有良好農(nóng)藝學(xué)性狀的 轉(zhuǎn)化體的（產(chǎn)生）頻率。典型地，當(dāng)不育性DNA編碼芽孢桿菌RNA酶，共同調(diào)節(jié)的DNA將編 碼芽孢桿菌RNA酶抑制劑。
[0010] 原種事件MS-B2,和包含賦予雄性不育性的此原種事件的雄性不育植物，在 TO01/31042中詳細(xì)描述（在此引入作為參考），包括轉(zhuǎn)基因和所插入的轉(zhuǎn)基因緊側(cè)翼的植 物DNA序列的表征。
[0011] 包含原種事件MS-B2的參考種子以ATCC保藏號(hào)PTA-850于1999年10月14日保 藏于ATCC(10801 University Blvd.，Manassas, VA 20110-2209)。同一種子的另一樣品以 保藏號(hào)PTA-2485保藏。MS-B2的備選名字為MS 11。
[0012] 原種事件RF-BN1，和包含賦予雄性不育性的此原種事件的雄性不育植物，在 TO01/41558中詳細(xì)描述（在此引入作為參考），包括轉(zhuǎn)基因和所插入的轉(zhuǎn)基因緊側(cè)翼的植 物DNA序列的表征。
[0013] 包含原種事件RF-BNl的參考種子以ATCC保藏號(hào)PTA-730于1999年9月20日保 藏于 ATCC(10801University Blvd. ,Manassas,VA 20110-2209)。RF-BNl的備選名字為Rf 3〇
[0014] W001/41558還描述了原種事件MS-BN1，包含該事件的雄性不育植物，以及鑒定這 樣的植物及其子代的方法。MS-BNl的備選名字為MS 8。
[0015] MS-BNl和RF-BNl事件包含在以商標(biāo)名InVigor?Canola出售的雜交歐洲油菜 植物中。
[0016] 前述這些文件既未描述蕓苔屬植物中MS-B2和RF-BNl的具體組合，也未描述其在 雜交種子生產(chǎn)中的用途。迄今也未提及芥菜中的RF-BNl，以及MS-B2增加蕓苔屬油料種子 植物產(chǎn)量的用途。
[0017] 發(fā)明概述
[0018] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了從油籽油菜植物，例如歐洲油菜或芥菜生產(chǎn)雜 交種子的方法，包含如下步驟，提供包含原種事件MS-B2的雄性不育的雌性親本油籽油菜 植物，包含所述原種事件的參考種子以保藏號(hào)ATCC_PTA 2485或ATCC_PTA-850保藏于 ATCC;提供包含原種事件RF-BNl的雄性不育的雄性親本油籽油菜植物，優(yōu)選為純合形式， 包含所述原種事件的參考種子以保藏號(hào)ATCC_PTA-730保藏于ATCC ;用來(lái)自所述雄性親本 油籽油菜植物的花粉對(duì)所述雌性親本油籽油菜植物進(jìn)行授粉；并從所述雌性親本植物收獲 雜交種子。
[0019] 在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了油籽油菜植物，例如歐洲油菜或芥菜植物，其 核基因組中包含至少一個(gè)拷貝的原種事件MS-B2,包含該原種事件的參考種子以保藏號(hào) ATCC_PTA 2485或ATCC_PTA-850保藏于ATCC，還包含至少一個(gè)拷貝的原種事件RF-BN1，包 含該原種事件的參考種子以保藏號(hào)ATCC_PTA-730保藏于ATCC。本發(fā)明還提供了這樣的油 籽油菜植物的細(xì)胞或組織或種子。
[0020] 在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供了一對(duì)油籽油菜植物，以用于生產(chǎn)雜交種子，其 中一種植物包含原種事件MS-B2,包含該原種事件的參考種子以保藏號(hào)ATCC_PTA 2485或 ATCC_PTA-850保藏于ATCC，另一種所述油籽油菜植物包含原種事件RF-BNl，包含該原種事 件的參考種子以保藏號(hào)ATCC_PTA-730保藏于ATCC。
[0021] 本發(fā)明的目的還在于提供油籽油菜植物，例如歐洲油菜或芥菜植物的基因組DNA， 其核基因組中包含至少一個(gè)拷貝的原種事件MS-B2,包含該原種事件的參考種子以保藏號(hào) ATCC_PTA 2485或ATCC_PTA-850保藏于ATCC，還包含至少一個(gè)拷貝的原種事件RF-BN1，包 含該原種事件的參考種子以保藏號(hào)ATCC_PTA-730保藏于ATCC。
[0022] 本發(fā)明還提供了包含原種事件RF-BNl的芥菜，及其細(xì)胞和種子，包含該原種事件 的參考種子以保藏號(hào)ATCC_PTA-730保藏于ATCC。這樣的植物還可包含原種事件MS-B2,包 含該原種事件的參考種子以保藏號(hào)ATCC_PTA 2485或ATCC_PTA-850保藏于ATCC。
[0023] 本發(fā)明還提供了原種事件MS-B2的用途，用于提高轉(zhuǎn)基因油籽油菜植物例如芥菜 植物的種子產(chǎn)量，包含該原種事件的參考種子以保藏號(hào)ATCC_PTA 2485或ATCC_PTA-850保 藏于ATCC。
[0024] 在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，提供了增加油籽油菜植物產(chǎn)量的方法，包含如下步驟， 提供具有原種事件MS-B2的油籽油菜植物，包含該原種事件的參考種子以保藏號(hào)ATCC_PTA 2485 或 ATCC_PTA-850 保藏于 ATCC。
[0025] 附圖簡(jiǎn)述
[0026] 圖1 :應(yīng)用除草劑后MS/RF雜交歐洲油菜種系的活力（vigor)比對(duì)。圖A :無(wú)草銨 膦應(yīng)用。圖B: