專利名稱：誘導(dǎo)花生不定芽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種組織培養(yǎng)誘導(dǎo)花生叢生芽的方法，特別是涉及一種高效誘導(dǎo)花生不定 芽的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
花生是一種重要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物，在我國種植面積較大。提高花生的產(chǎn)量、質(zhì) 量，離不開優(yōu)良品種，花生組織培養(yǎng)是利用生物技術(shù)進(jìn)行花生育種的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。目前，有些作物建立起了高效的植株再生體系，篩選出高誘導(dǎo)率基因型(如水稻的 日本晴，中華11)，但大多數(shù)作物的植株再生率仍很低(1%-30%)，成為限制基因工程技術(shù)應(yīng) 用的瓶頸。目前花生叢生芽誘導(dǎo)率報(bào)道的平均不超過50%，且穩(wěn)定性和重復(fù)性差?；ㄉ咝?再生體系的建立是花生基因轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)。植株再生受基因型影響很大，同時(shí)也和外植體類 型及培養(yǎng)基配方有關(guān)。細(xì)胞分裂素在組織培養(yǎng)誘導(dǎo)芽再生中比較有效，BA和TDZ在多種作

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題提供一種誘導(dǎo)率高、穩(wěn)定性高、重復(fù)性好的組織培養(yǎng)誘導(dǎo)花 生不定芽的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案
一種誘導(dǎo)花生不定芽的方法，包括如下步驟
(1)種子預(yù)培養(yǎng)選取成熟的豫花1號花生種子，先用70%乙醇浸潤20-30S，然后用 0. 1%的HgCl2溶液消毒8-lOmin，用無菌水沖洗5飛次，然后在無菌水中浸泡2 3h，將花生 種皮去掉，再去掉一片子葉，將剩下帶有胚芽的另一半子葉接種于不添加激素的MS培養(yǎng)基 中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25 26°C，光照時(shí)間12-14h/d，光照強(qiáng)度1000-2000 Ix,培養(yǎng)4天；
(2)外植體制備將培養(yǎng)后的花生子葉掰掉，夾緊胚軸，用無菌刀片將花生幼葉從基部 切下，將幼葉橫切，平均分成三份，或從近葉柄1/3處一分為二，得到外植體；
(3)誘導(dǎo)和分化將外植體接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25 26°C、光照時(shí)間 12-14h/d，光照強(qiáng)度1000-2000 lx，培養(yǎng)7-8天后外植體邊緣出現(xiàn)綠色芽點(diǎn)，轉(zhuǎn)到繼代培養(yǎng) 基中，再培養(yǎng)18-22天獲得誘導(dǎo)芽。所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+BA 3 mg/L +NAA 0. 4 - 0. 8 mg/L +TDZ 0. 1 - 0. 3 mg/ L +AgNO3 3. 5 mg/L ο所述繼代培養(yǎng)基為MS +BA 5 mg/L +NAA lmg/L +AgNO3 3. 5 mg/L。本發(fā)明的有益效果
(1)本發(fā)明通過嚴(yán)格篩選，選出基因型豫花1號作為外植體，經(jīng)過種子預(yù)培養(yǎng)、外植體 制備和誘導(dǎo)、分化等環(huán)節(jié)，得到花生不定芽，比目前文獻(xiàn)報(bào)道的花生叢生芽的誘導(dǎo)率高，經(jīng) 多次接種試驗(yàn)證明，誘導(dǎo)率結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性較好。(2)本發(fā)明優(yōu)化了芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方，使外植體萌發(fā)不定芽的時(shí)間大大提前，萌發(fā) 時(shí)間從原來的14天左右，提前到7-8天。(3)本發(fā)明方法可獲得穩(wěn)定的高誘導(dǎo)率，豫花1號在三種不同的培養(yǎng)基上培養(yǎng)(MS +BA 3 mg/L +NAA 0. 4 mg/L +TDZ 0. 3 mg/L +AgNO3 3. 5 mg/L ；MS +BA 3 mg/L +NAA 0. 8mg/L +TDZ 0. 1 mg/L +AgNO3 3. 5 mg/L ；MS +BA 3 mg/L +NAAO. 8 mg/L +TDZ 0. 3 mg/L +AgNO3 3. 5 mg/L)，芽誘導(dǎo)率穩(wěn)定在 90% 以上，分別為 91. 6 92. 5%,97. 5 98. 5%,99. 5 100%。而同樣條件下開農(nóng)49、開農(nóng)30、豫花15號在MS +BA 3 mg/L +ΝΑΑ0. 8 mg/ L +TDZ 0.3 mg/L +AgNO3 3.5 mg/L培養(yǎng)基上培養(yǎng)，其不定芽誘導(dǎo)率分別為51. 2 52. 6%、 31. 8^33. 5%,36. 8^38. 5%。可看出，豫花1號作為外植體時(shí)的不定芽誘導(dǎo)率比其他品種優(yōu)勢 明顯。


圖 1 豫花 1 號外植體在 MS +BA 3 mg/L +NAAO· 8 mg/L +TDZ 0. 3 mg/L +AgNO3 3. 5 mg/L培養(yǎng)基上誘導(dǎo)不定芽情況。圖中外植體切口邊緣的綠色突起為誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定芽。圖 2:開農(nóng) 49 (對照)外植體在 MS +BA 3 mg/L +NAAO· 8 mg/L +TDZ 0.3 mg/L +AgNO3 3.5 mg/L培養(yǎng)基上誘導(dǎo)不定芽情況。圖中外植體切口邊緣的綠色突起為誘導(dǎo)產(chǎn)生 的不定芽，黃、白色為愈傷組織。從圖1、2可以看出，在相同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，豫花1號外植體的芽點(diǎn)多而且 長勢旺；開農(nóng)49 (對照)外植體芽點(diǎn)較稀少，而且外植體邊緣產(chǎn)生白色的疏松愈傷組織，說 明豫花1號和開農(nóng)49基因型間的芽誘導(dǎo)率存在顯著差異。圖3 豫花15號(對照)在三種不同的培養(yǎng)基上的外植體誘導(dǎo)不定芽對照圖圖中 外植體切口邊緣的綠色突起為誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定芽，黃、白色為愈傷組織。圖中(1)培養(yǎng)基為MS +BA 3 mg/L +NAAO· 8 mg/L +TDZ 0.3 mg/L +AgNO3 3.5 mg/ L ； (2)培養(yǎng)基為 MS +BA 3 mg/L +NAA 0.8 mg/L +TDZ 0.1 mg/L +AgNO3 3.5 mg/ L ；(3) 培養(yǎng)基為 MS +BA 3 mg/L +NAA 0. 4 mg/L +TDZ 0. 3 mg/L +AgNO3 3. 5 mg/L。從圖3可看出，同一基因型(豫花15號)在不同培養(yǎng)基上，不定芽的誘導(dǎo)反應(yīng)不同。 圖中(2)和(3)較(1)誘導(dǎo)出較多愈傷組織，但不定芽誘導(dǎo)率均較低，誘導(dǎo)率不足40%。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明，其中出現(xiàn)的百分比濃度如無特別說明，均指質(zhì)量百 分比濃度。實(shí)施例1 誘導(dǎo)花生不定芽的方法，包括如下步驟
1、種子預(yù)培養(yǎng)選取顆粒飽滿、較大、表面無裂痕、沒有出胚芽的豫花1號成熟種子，用 鑷子加入無菌三角瓶中，先用70%乙醇浸潤30s，再用0. 1%的HgCl2溶液消毒8min，用無菌 水沖洗5飛次，然后在無菌水中浸泡2 3h，待花生種皮舒展之后，在超凈工作臺上用鑷子將 花生種皮去掉，再去掉一片子葉，將剩下帶有胚芽的另一半子葉接種于裝有MStl (MS培養(yǎng)基 不添加任何激素)培養(yǎng)基的無菌罐頭瓶中，置光照培養(yǎng)室中，在25°C、光照強(qiáng)度為20001x，光 照14h/d條件下培養(yǎng)4天；
2、制備外植體用鑷子將花生的子葉掰掉，之后夾緊胚軸，再用無菌刀片將花生幼葉從 基部切下，將幼葉近葉柄部1/3處一分為二 ；
3、誘導(dǎo)和分化將外植體分別接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+BA 3 mg/L +NAA 0.8 mg/L +TDZ 0.3 mg/L +AgNO3 3.5 mg/L，置光照培養(yǎng)室 25°C、光照強(qiáng)度為 20001x， 光照14h/d條件下培養(yǎng)，經(jīng)過7-8天，部分外植體切口邊緣可見綠色芽點(diǎn)出現(xiàn)；14天左右， 所有外植體邊緣均出現(xiàn)大量綠色芽點(diǎn)。兩周后，轉(zhuǎn)到繼代培養(yǎng)基中，使芽點(diǎn)進(jìn)一步分化，繼代培養(yǎng)基為MS +BA 5 mg/L +NAA lmg/L +AgNO3 3.5 mg/L，再培養(yǎng)18天得到誘導(dǎo)花生不定芽。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，誘導(dǎo)率達(dá)到
100% ο實(shí)施例2 誘導(dǎo)花生不定芽的方法
種子預(yù)培養(yǎng)選取顆粒飽滿、較大、表面無裂痕、沒有出胚芽的豫花1號成熟種子，用鑷 子加入無菌三角瓶中，先用70%乙醇浸潤20s，再用0. l%HgCl2溶液消毒lOmin，用無菌水沖 洗5飛次，然后在無菌水中浸泡2 3h，待花生種皮舒展之后，在超凈工作臺上用鑷子將花生 種皮去掉，再去掉一片子葉，將剩下帶有胚芽的另一半子葉接種于裝有MStl (MS培養(yǎng)基不添 加任何激素)培養(yǎng)基的無菌罐頭瓶中。置光照培養(yǎng)室中，在26°C、光照強(qiáng)度為1500 lx，光照 12h/d條件下培養(yǎng)4天。制備外植體用鑷子將花生的子葉掰掉，之后夾緊胚軸，再用無菌刀片將花生幼葉 從基部切下，將幼葉橫切平均一分為三。誘導(dǎo)和分化將外植體分別接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上MS +BA 3 mg/L +NAA 0. 8 mg/L +TDZ 0. 1 mg/L +AgNO3 3.5 mg/L，置光照培養(yǎng)室26°C、光照強(qiáng)度為1500 lx，光照12h/d條 件下培養(yǎng)，經(jīng)過7-8天，部分外植體切口邊緣可見綠色芽點(diǎn)出現(xiàn)；14天左右，幾乎外植體邊 緣均出現(xiàn)大量綠色芽點(diǎn)。兩周后，轉(zhuǎn)到繼代培養(yǎng)基上，繼代培養(yǎng)基為MS +BA 5 mg/L +NAA lmg/L +AgNO3 3.5 mg/L，使芽點(diǎn)進(jìn)一步分化，再培養(yǎng)22天得到誘導(dǎo)花生不定芽。經(jīng)統(tǒng)計(jì)， 誘導(dǎo)率為97. 5%。實(shí)施例3 同實(shí)施例1基本相同，不同之處在于 培養(yǎng)室條件26°C、光照強(qiáng)度1000 lx，光照13h/d ；
芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基:MS +BA 3 mg/L +NAA 0.4 mg/L +TDZ 0.3 mg/L +AgNO3 3.5 mg/L，誘 導(dǎo)率為91. 6%ο說明書摘要
本發(fā)明涉及一種高效誘導(dǎo)花生不定芽的方法，包括選取成熟的豫花1號花生種子，先 用70%乙醇浸潤，然后用0. 1%的HgCl2溶液消毒，用無菌水沖洗，然后在無菌水中浸泡，將剩 下帶有胚芽的另一半子葉接種于不添加激素的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)4天；將培養(yǎng)后的幼 葉橫切，平均分成三份，得到外植體；誘導(dǎo)和分化，將外植體接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)7-8 天后外植體邊緣出現(xiàn)綠色芽點(diǎn)，轉(zhuǎn)到繼代培養(yǎng)基中，再培養(yǎng)18-22天獲得誘導(dǎo)芽。本發(fā)明選 出基因型豫花1號作為外植體得到花生不定芽，優(yōu)化了芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方，經(jīng)多次接種試 驗(yàn)證明，芽誘導(dǎo)率穩(wěn)定在90%以上，重復(fù)性好。
權(quán)利要求
一種誘導(dǎo)花生不定芽的方法，其特征在于該方法包括如下步驟(1)種子預(yù)培養(yǎng)　選取成熟的豫花1號花生種子，先用70%乙醇浸潤20 30s，然后用0.1%的HgCl2溶液消毒8 10min，用無菌水沖洗5~6次，然后在無菌水中浸泡2~3h，將花生種皮去掉，再去掉一片子葉，將剩下帶有胚芽的另一半子葉接種于不添加激素的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25~26℃，光照時(shí)間12 14h/d，光照強(qiáng)度1000 2000 lx，培養(yǎng)4天；(2)外植體制備　將培養(yǎng)后的花生子葉掰掉，夾緊胚軸，用無菌刀片將花生幼葉從基部切下，將幼葉橫切，平均分成三份，或從近葉柄1/3處一分為二，得到外植體；(3)誘導(dǎo)和分化　將外植體接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25~26℃、光照時(shí)間12 14h/d，光照強(qiáng)度1000 2000 lx，培養(yǎng)7 8天后外植體邊緣出現(xiàn)綠色芽點(diǎn)，轉(zhuǎn)到繼代培養(yǎng)基中，再培養(yǎng)18 22天獲得誘導(dǎo)芽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)花生不定芽的方法，其特征在于所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS +BA 3 mg/L +NAA 0. 4 - 0. 8 mg/L +TDZ 0. 1 - 0. 3 mg/L +AgNO3 3. 5 mg/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的誘導(dǎo)花生不定芽的方法，其特征在于所述繼代培養(yǎng)基 為 MS +BA 5 mg/L +NAA lmg/L +AgNO3 3. 5 mg/L。全文摘要
本發(fā)明涉及一種高效誘導(dǎo)花生不定芽的方法，包括選取成熟的豫花1號花生種子，先用70%乙醇浸潤，然后用0.1%的HgCl2溶液消毒，用無菌水沖洗，然后在無菌水中浸泡，將剩下帶有胚芽的另一半子葉接種于不添加激素的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)4天；將培養(yǎng)后的幼葉橫切，平均分成三份，得到外植體；誘導(dǎo)和分化，將外植體接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)7-8天后外植體邊緣出現(xiàn)綠色芽點(diǎn)，轉(zhuǎn)到繼代培養(yǎng)基中，再培養(yǎng)18-22天獲得誘導(dǎo)芽。本發(fā)明選出基因型豫花1號作為外植體得到花生不定芽，優(yōu)化了芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方，經(jīng)多次接種試驗(yàn)證明，芽誘導(dǎo)率穩(wěn)定在90%以上，重復(fù)性好。
文檔編號A01H4/00GK101960988SQ20101029825
公開日2011年2月2日 申請日期2010年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月30日
發(fā)明者張新友, 湯豐收, 苗利娟, 董文召, 高偉, 黃冰艷 申請人:河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院