專利名稱：：一種福氏志賀氏菌噬菌體菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種噬菌體菌株及其應(yīng)用，尤其是能夠特異性裂解福氏志賀氏菌(SWge//a_/fecweW)的噬菌體及其應(yīng)用。屬于生物工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：志賀氏菌是胃腸疾病感染的主要病原菌之一，志賀氏菌屬分4個種，至少47個血清型，其中福氏志賀菌(SWge^^/fec股W)是發(fā)展中國家痢疾發(fā)病的優(yōu)勢菌，每年全球約有1.64億人發(fā)病，死亡人數(shù)高達(dá)110.6萬，并且69%為5歲以下兒童。研究表明，由福氏志賀氏菌導(dǎo)致的兒童腹瀉主要是誤食了被福氏志賀氏菌污染的食物。目前，細(xì)菌污染是食品安全以及食品生產(chǎn)工業(yè)中存在的嚴(yán)重問題，由細(xì)菌污染引起的食物中毒死亡人數(shù)仍有上升趨勢。面對日益嚴(yán)重的耐藥毒株的出現(xiàn)，利用抗生素來防止細(xì)菌污染已經(jīng)不是最佳防控方法。耐藥毒株會在環(huán)境中進(jìn)化并產(chǎn)生，抗生素的開發(fā)遠(yuǎn)不及耐藥毒株出現(xiàn)的速度。因此，由細(xì)菌污染食品引起的中毒檢測表明，導(dǎo)致疾病產(chǎn)生的源頭來自于抗生素濫用所產(chǎn)生的耐藥細(xì)菌。噬菌體是一類細(xì)菌依賴性的病毒，又稱細(xì)菌病毒。裂解性噬菌體感染細(xì)菌后，可在宿主菌內(nèi)快速增殖，并使之裂解，故又稱毒性噬菌體。福氏志賀氏菌噬菌體可以特異性感染并裂解福氏志賀氏菌，因而具有殺菌作用。在感染模型中，噬菌體能夠特異殺死福氏志賀氏菌；而在食品中，噬菌體能夠作為抗菌劑來控制細(xì)菌污染，具有潛在的開發(fā)價值。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對目前人們在防治福氏志賀菌(幼扭//"Ax"^/)引起的腹瀉時，使用抗生素容易導(dǎo)致耐藥致病菌進(jìn)化并產(chǎn)生，提供一種新的能夠特異性裂解福氏志賀氏菌的噬菌體及其應(yīng)用。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種噬菌體菌株，其特征在于保藏號為CCTCCNO:M209029，該菌株對福氏志賀氏菌有強(qiáng)的裂解作用。在本發(fā)明中噬菌體菌株在405(TC中放置30min，其活性穩(wěn)定；在9(TC中放置則失活；噬菌體菌株在pH5.09.0環(huán)境下，其活性穩(wěn)定；4"C保存至180d，其效價降低10倍；-2(TC至-7(rC保存180d后，活性穩(wěn)定；噬菌體菌株保存的保護(hù)劑為含10%或2(P/。甘油的SM溶液。一種上述噬菌體菌株的應(yīng)用，其特征在于將噬菌體菌株純化和擴(kuò)增培養(yǎng)后，用于抑制福氏志賀氏菌。在噬菌體菌株的應(yīng)用中用于抑制福氏志賀氏菌是指將純化的噬菌體用水稀釋至濃度》10Vfo/ml的噴灑液或淋洗液，用于對生產(chǎn)環(huán)境或生產(chǎn)器具的噴灑或消殺，防止食品加工過程中造成的福氏志賀氏菌污染。在噬菌體菌株的應(yīng)用中用于抑制福氏志賀氏菌是指將純化的噬菌體作為食品添加劑，在配料時加入10"pfii/ml或10fU/g濃度的純化的噬菌體，用于防止食品儲存過程中福氏志賀氏菌的生存和繁殖。在噬菌體菌株的應(yīng)用中所述的食品是指由肉類，或蛋類，或奶制品，或糧食，或蔬菜，或它們之間的組合加工的固體或液體類食品。在噬菌體菌株的應(yīng)用中用于抑制福氏志賀氏菌是指將純化的噬菌體用水稀釋至濃度》l(^pfil/ml后，作為消殺劑用于畜禽舍養(yǎng)殖區(qū)對福氏志賀氏菌的消殺和抑制。在噬菌體菌株的應(yīng)用中用于抑制福氏志賀氏菌是指將純化的噬菌體與賦形劑復(fù)配后，作為治療由福氏志賀氏菌導(dǎo)致腹瀉的藥物。在噬菌體菌株的應(yīng)用中所述的賦形劑為制藥領(lǐng)域普遍使用的緩沖液、金屬離子、表面活性劑。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于由于采用噬菌體特異性裂解福氏志賀氏菌可以殺死具有耐藥性的福氏志賀氏菌；由于采用噬菌體特異性裂解福氏志賀氏菌能夠防止福氏志賀氏菌進(jìn)化和耐藥毒株的產(chǎn)生；由于本發(fā)明涉及的噬菌體菌株具有親水相，通過傳統(tǒng)的方法很容易配制成噴灑液或淋洗液，對環(huán)境或器具進(jìn)行消殺；由于本發(fā)明涉及的噬菌體菌株沒有毒副作用，可以作為食品添加劑或藥物，特異性裂解福氏志賀氏菌，防止福氏志賀氏菌對食品的污染，治療由福氏志賀氏菌引起的疾病。圖1是純化SH72噬菌體雙層平板檢測結(jié)果；圖2是不同溫度對噬菌體的影響；圖3是不同pH對噬菌體的影響；圖4在4'C條件下，MOI為100時噬菌體在肉中的殺菌效果；圖5在-20°(:條件下，MOI為100時噬菌體在肉中的殺菌效果；圖6噬菌體在牛奶中的殺菌效果檢測結(jié)果。具體實(shí)施例方式本發(fā)明試驗(yàn)用噬菌體宿主菌保藏于廣東省微生物研究所菌種保藏中心，保藏號CMCC51572。購自廣東省微生物研究。本發(fā)明試驗(yàn)用LB培養(yǎng)基(購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司)、氯仿(上?；瘜W(xué)試劑有限公司)。實(shí)施例l、噬菌體的分離制備本發(fā)明樣品采自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院養(yǎng)豬廠清洗場地污水，經(jīng)雙層濾紙過濾，3000xg.min"離心20min，再用0.22pm濾膜過濾上清。取50ml過濾上清，加入2ml噬菌體宿主菌過夜培養(yǎng)物，再加入CaCl2母液(已過0.22pm濾膜除菌)至終濃度lmM混勻后，加入20mlLB培養(yǎng)基，室溫作用lh，再放置于37。C培養(yǎng)1216h。次日，取上述培養(yǎng)物以14000xg.mii^離心30min,取上清；14000xg.min"再次離心20min，取上清加入0.1%氯仿，形成噬菌體原液。將普通營養(yǎng)瓊脂平板分為2個區(qū)域:吸取宿主菌液O.lml滴于普通營養(yǎng)瓊脂平板正中央，將菌液均勻地涂開；待其晾干后，滴噬菌體原液0.05ml于其中一個區(qū)域，并將其涂布均勻；待自然晾干后，置于37'C溫箱培養(yǎng)10h后，觀察兩個區(qū)域的變化。同時設(shè)立對照，對照中僅涂噬菌體原液，以鑒定噬菌體中是否含有宿主菌。取噬菌體原液O.lml，進(jìn)行10倍稀釋，取102、104和1(^稀釋液各0.1ml與過夜培養(yǎng)的宿主菌液O.lml混勻，室溫作用15min后，加入約5ml0.7%LB培養(yǎng)基，混勻后迅速傾倒入LB培養(yǎng)基平板上層，搖勻平置5min，待其凝固，置于37'C溫箱培養(yǎng)12h后5觀察，獲得形成噬菌斑的雙層平板。實(shí)施例2、噬菌體的純化培養(yǎng)和擴(kuò)增在形成噬菌斑的雙層平板上挑取形態(tài)大小一致的單個噬菌斑，用接種針穿刺目的噬菌斑，將穿刺后接種針伸入35mlLB培養(yǎng)基中，重復(fù)35次后，加入噬菌體宿主菌液O.lml，混勻，室溫作用15min，37。C培養(yǎng)1014h，14000xg.mii!-1，4"C，離心20min，取上清，同時加入0.1ml氯仿，室溫作用20min，無菌過濾(0.22nm)上清液；取2ml新鮮培養(yǎng)的宿主菌，離心，0.4mlLB培養(yǎng)基重懸，加O.lml噬菌體(以單個噬菌體培養(yǎng)物與宿主菌分別按照1:1、1:10和1:100的比例)。加麥芽糖(0.2%)，MgS04(10mM)，37。C溫育20min，使噬菌體顆粒吸附于宿主菌；加入100mlLB液體培養(yǎng)基，其中含有麥芽糖(0.2%)，MgS04(10mM)，37匸搖震培養(yǎng)9-12h;力QO.lml氯仿，37'C繼續(xù)搖震培養(yǎng)10-20min，獲得裂解液。將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管，離心8000xg.min人去細(xì)菌碎片，取上清液；加RNaseA、DNaseI至lpg/ml，37"C溫育30min;力卩9.3gPEG8000，5.8gNaCl，搖勻至溶解，冰浴lh或4。C過夜；4。C離心10000xg.min"20min，去上清液；加2mlSM液，充分洗溶管壁及沉淀，室溫作用lh;通過加入等體積的氯仿抽提噬菌體懸液中的PEG和細(xì)胞碎片，溫和振蕩30s;4'C，3000xg.min—i離心15min以分離有機(jī)相和親水相，回收含有噬菌體顆粒的親水相，獲得純化的噬菌體，雙層平板檢測純化噬菌體(見圖l)。純化的噬菌體命名為Sh72，于2009年2月23日保藏于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏號為CCTCCNO:M209029，分類命名為福氏志賀氏菌噬菌體Sh72，(幼1顧.phageSh72)。實(shí)施例3、溫度及pH對噬菌體Sh72穩(wěn)定性的影響分別取O.lml1X1()Spfii/ml純化噬菌體于4(rC9(rC水浴作用30min和lh，將樣品冰浴冷卻后測其效價；分別取pH4.010.0的蛋白胨水和2x109pfU/ml純化噬菌體等量混合，37'C水浴作用2h后測其效價。結(jié)果表明，如圖2所示，噬菌體在4(TC和50'C作用30min后，其活性無明顯變化；5(TC作用lh，活性有所降低；7(TC作用后，效價降低至初始效價的50%以下；至90'C，幾乎失活。噬菌體經(jīng)不同pH作用后結(jié)果如圖3，噬菌體在pH5.09.0作用后，其效價均在109以上，其活性無明顯變化；當(dāng)pH為4.0和10.0時，其效價降至5xl()Spfti/ml以下。實(shí)施例4、不同保藏溫度和保藏溶液對噬菌體SH72的影響將純化的噬菌體10iVU/ml分別保藏于4t:、-20°(:及-70°(:中，分別于30d、90d、180d檢測噬菌體效價。純化噬菌體分別在SM、生理鹽水、含10。/。甘油和20。/。甘油的SM中保存于-20'C，并于180d后進(jìn)行檢測。結(jié)果見表l，顯示為180d后檢測數(shù)據(jù)，4T:保存至180d，其效價下降一個數(shù)量級；-2(TC及-7(rC保存180d后，效價有微弱變化，其活性較穩(wěn)定。表l不同保藏溫度下的噬菌體活性檢測溫度。c4°C-20°C-70°C保藏前效價(pfij/ml)101110111011保藏后效價(pfia/ml)1.01xl0109.7xl01Ql.llxlO11表2結(jié)果表明，噬菌體在SM中保存180d后，效價下降至1.9xl01G;生理鹽水中，效價下降至9.3xl09;而在10%及20%甘油SM中，180d后效價與初始效價無顯著性差異。由此表明，10。/。和20。/。甘油的SM可作為噬菌體的保護(hù)劑。表2不同溶液對噬菌體的效價的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實(shí)施例5、噬菌體寬檢測分別取O.lml105純化噬菌體與大腸桿菌、腸炎沙門菌、痢疾桿菌和福氏志賀菌分離株菌液各O.lml混勻，室溫放置15min后，加入上層0.7%LB培養(yǎng)基約5ml，將該混合液迅速傾倒入下層LB培養(yǎng)基平板上，37t:溫箱培養(yǎng)1012h后觀察噬菌斑形成情況。結(jié)果表明大腸桿菌、腸炎沙門菌和痢疾桿菌在雙層平板上層培養(yǎng)基生長良好，無噬菌斑形成，而福氏志賀菌分離株中有噬菌斑，說明噬菌體特異性針對福氏志賀氏菌。實(shí)施例6、毒力實(shí)驗(yàn)8周齡雌性SPF級BALB/c小鼠，27g土2g，共30只，購自南京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。隨機(jī)分為兩組，各10只，口服噬菌體10^pfia/0.1ml/只，對照組口服等量PBS，連續(xù)口服14d，脫勁致死小鼠，觀察內(nèi)臟、消化道及黏膜變化情況。結(jié)果顯示，此計(jì)量的噬菌體對小鼠日常行為沒有影響，解剖檢查無異常，且在飼喂結(jié)束兩天后，在小鼠糞便便中檢測不到噬菌體。實(shí)施例7、噬菌體在食品中的滅菌實(shí)驗(yàn)(不同溫度)熟肉制品(鹵牛肉)，將其切成約2x2cm的小塊(約lg)，將肉塊過火焰滅菌；制備5xl04cfii/ml福氏志賀氏菌菌液；制備5xl05pfU/ml(MOI10)、5xl06pfli/ml(MOI100)的Sh72噬菌體樣品。無菌環(huán)境下，將福氏志賀氏菌菌液以20ul(lxl03cfii/ml)滴于肉塊表面，約5min后，滴20pl制備不同濃度的噬菌體(104pfWml、105pfWml)，同時設(shè)立福氏志賀氏菌對照；將制備好的樣品分別置于4-C和-2(TC，分別于lh、2h、4h、12h、24h檢測福氏志賀氏菌數(shù)量。結(jié)果如圖4中所示，4"C作用lh后，與對照組相比較，MOI為10及100的噬菌體均能夠殺滅宿主菌，宿主菌數(shù)量下降；至2h，已檢測不到宿主菌；如圖5中所示，-20。C作用lh后，MOI為IO及IOO的噬菌體均能殺滅宿主菌，與對照相比較，宿主菌數(shù)量亦有下降，至2h，檢測不到宿主菌。實(shí)施例8、噬菌體液體中的殺菌作用將巴氏殺菌牛奶，分成兩組，A組接種宿主菌105cfWml，同時加入10"mlSh72噬菌體，B組中僅加入宿主菌作為對照，4"C作用30min，60min，90min，120min，240min，300min測定宿主菌數(shù)量變化。結(jié)果如圖6所示，作用30min后，宿主菌數(shù)量降至起始接種數(shù)量50%以下；至60min，僅檢測到約30cfti/ml的宿主菌；至90min，檢測不到宿主菌。實(shí)施例9、噬菌體體內(nèi)體外的感染實(shí)驗(yàn)挑取福氏志賀氏菌單克隆，經(jīng)過夜培養(yǎng)后，調(diào)整其濃度為109cfWml;以每只108cfii/100^U的劑量口服BALB/c小鼠(8周齡，SPF級，實(shí)驗(yàn)前體內(nèi)福氏志賀氏菌檢測為陰性)，并在lh后，口服10、fu/100til劑量的噬菌體(用PBS作為賦形劑)，分別在1211、2411、3611將小鼠致死，取腸道，加入2111185，勻漿，4°。離心400(^8.1^11-120min，取O.lml上清進(jìn)行稀釋，并取不同稀釋度涂布SS瓊脂平板，計(jì)算福氏菌志賀氏菌總量。結(jié)果如表4所示，在口服噬菌體12h后，檢測到的細(xì)菌菌落總數(shù)為4.05xl0、fo，顯著低于初始接種量；24h及36h后，檢測不到福氏志賀氏菌。表4小鼠體內(nèi)噬菌體殺菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>挑取福氏志賀氏菌單克隆，經(jīng)過夜培養(yǎng)后，調(diào)整期濃度為104cfWml，噴灑在器具(金屬托盤)表面；然后將純化噬菌體以104、105、10Spfb/ml濃度，對器具(金屬托盤)實(shí)施噴灑消殺，60min后，檢測宿主菌。檢測結(jié)果顯示，在以104、105、10Spfu/ml濃度噬菌體實(shí)施噴灑消殺60min后，器具表面已檢測不到宿主菌，因此以濃度》10"pfb/ml噬菌體能夠有效的殺滅器具表面污染的福氏志賀氏菌。以上各實(shí)施例不是對本發(fā)明的限制，具體實(shí)施時，可以將本發(fā)明所述的方法制備噴灑液或淋洗液，或食品添加劑，以及選擇常用的緩沖液、金屬離子、表面活性劑作為賦形劑制備藥物，用于抑制福氏志賀氏菌生長、繁殖，預(yù)防和控制因福氏志賀氏菌導(dǎo)致的污染和腹瀉。權(quán)利要求1、一種福氏志賀氏菌噬菌體菌株，其特征在于保藏號為CCTCCNOM209029，該菌株對福氏志賀氏菌(Shigellaflexneri)有強(qiáng)的裂解作用。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種福氏志賀氏菌噬菌體菌株，其特征在于噬菌體菌株在405(TC中放置30min，其活性穩(wěn)定；在9(TC中放置則失活；噬菌體菌株在pH5.0~9.0環(huán)境下，其活性穩(wěn)定；4-C保存至180d，其效價降低10倍；-20°〇至-70°。保存180d后，活性穩(wěn)定；噬菌體菌株保存的保護(hù)劑為含10n/a或20M甘油的SM溶液。3、一種如權(quán)利要求1所述噬菌體菌株的應(yīng)用，其特征在于將福氏志賀氏菌噬菌體菌株純化和擴(kuò)增培養(yǎng)后，用于抑制福氏志賀氏菌。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述噬菌體菌株的應(yīng)用，其特征在于用于抑制福氏志賀氏菌是指將純化的噬菌體用水稀釋至濃度》10、fU/ml的噴灑液或淋洗液，用于對生產(chǎn)環(huán)境或生產(chǎn)器具的噴灑或消殺，防止食品加工過程中造成的福氏志賀氏菌污染。5、根據(jù)權(quán)利要求3所述噬菌體菌株的應(yīng)用，其特征在于用于抑制福氏志賀氏菌是指將純化的噬菌體作為食品添加劑，在配料時加入10fWml或l(^pfti/g濃度的純化的噬菌體，用于防止食品儲存過程中福氏志賀氏菌的生存和繁殖。6、根據(jù)權(quán)利要求4或5所述噬菌體菌株的應(yīng)用，其特征在于所述的食品是指由肉類，或蛋類，或奶制品，或糧食，或蔬菜，或它們之間的組合加工的固體或液體類食品。7、根據(jù)權(quán)利要求3所述噬菌體菌株的應(yīng)用，其特征在于用于抑制福氏志賀氏菌是指將純化的噬菌體用水稀釋至濃度》10、fo/ml后，作為消殺劑用于畜禽舍養(yǎng)殖區(qū)對福氏志賀氏菌的消殺和抑制。8、根據(jù)權(quán)利要求3所述噬菌體菌株的應(yīng)用，其特征在于用于抑制福氏志賀氏菌是指將純化的噬菌體與賦形劑復(fù)配后，作為治療由福氏志賀氏菌導(dǎo)致腹瀉的藥物。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述噬菌體菌株的應(yīng)用，其特征在于所述的賦形劑為制藥領(lǐng)域普遍使用的緩沖液、金屬離子、表面活性劑。全文摘要本發(fā)明涉及一種噬菌體菌株及其應(yīng)用，噬菌體菌株的保藏號為CCTCCNOM209029，該菌株對福氏志賀氏菌(Shigellaflexneri)有強(qiáng)的裂解作用。將噬菌體菌株純化和擴(kuò)增培養(yǎng)后，可以用于抑制福氏志賀氏菌。其優(yōu)點(diǎn)是由于采用噬菌體特異性裂解福氏志賀氏菌可以殺死具有耐藥性的福氏志賀氏菌，同時能夠防止福氏志賀氏菌進(jìn)化和耐藥毒株的產(chǎn)生；由于本發(fā)明涉及的噬菌體菌株具有親水相，通過傳統(tǒng)的方法很容易配制成噴灑液或淋洗液，對環(huán)境或器具進(jìn)行消殺；由于本發(fā)明涉及的噬菌體菌株能特異性裂解福氏志賀氏菌，且沒有毒副作用，可以作為食品添加劑，防止福氏志賀氏菌對食品的污染，作為藥物治療由福氏志賀氏菌引起的疾病。文檔編號A01N63/00GK101519651SQ20091002930公開日2009年9月2日申請日期2009年4月8日優(yōu)先權(quán)日2009年4月8日發(fā)明者輝張,冉王,明陳,魏瑞成申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院