專利名稱：志賀氏菌的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種微生物培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
志賀氏菌(Shigella)是目前致腸道感染的主要病原菌之一，屬于腸桿菌科的志賀氏菌(Shigella)屬，又稱痢疾桿菌，為革蘭氏陰性桿菌，需氧或兼性厭氧。人類對痢疾桿菌有很高的易感性，幼兒可引起急性中毒，死亡率甚高。臨床上通常表現(xiàn)腹部痙攣痛、腹瀉和發(fā)熱，患者將不能從事飲食業(yè)、炊事及保育等工作。目前在我國志賀氏菌的檢測及確認的方法為《GB/T4789. 5-2003食品衛(wèi)生微生物學檢驗志賀氏菌檢驗》，檢驗步驟有(I)增菌無菌操作將待檢樣品放入GN增菌液中，置37°C培養(yǎng)6小時 8小時。(2)分離取⑴增菌液I環(huán)劃線接種于SS瓊脂平板或HE瓊脂平板，于37°C培養(yǎng)18小時 24小時。志賀氏菌在在這些瓊脂平板上呈現(xiàn)無色透明不發(fā)酵乳糖的菌落。(3)生化試驗和血清學鑒定從平板上要求挑選不少于5個 8個可疑菌落，進行生化鑒定和血清凝集試驗。⑷結(jié)果報告根據(jù)選擇性分離平板、生化試驗和血清學鑒定結(jié)果，報告樣品中檢出或未檢出志賀氏菌。由于志賀氏菌和侵襲性大腸桿菌有較高的同源性，在麥康凱瓊脂平板或伊紅美藍瓊脂平板上都能生長，且侵襲性大腸桿菌菌落大，增長速度快，經(jīng)常會覆蓋菌落小并透明的志賀氏菌菌落，導致難以挑取可疑的志賀氏菌菌落，造成低濃度志賀氏菌漏檢和誤判的結(jié)果O

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明提供一種志賀氏菌培養(yǎng)方法，解決現(xiàn)有技術(shù)中志賀氏菌一般培養(yǎng)方法造成志賀氏菌漏檢或誤判的技術(shù)問題。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種志賀氏菌培養(yǎng)方法，包括如下步驟將硝酸纖維素膜用志賀氏菌抗血清處理一次以上，晾干后再用質(zhì)量百分數(shù)為 1% I. 5%的硫代硫酸鈉處理，晾干，得到含志賀氏菌抗血清和硫代硫酸鈉的硝酸纖維素將所述含志賀氏菌抗血清和硫代硫酸鈉的硝酸纖維素膜加入至含志賀氏菌的懸浮液中，于36. 8 37. 2°C條件下放置30 35分鐘，得到含志賀氏菌的硝酸纖維素膜；將所述含志賀氏菌的硝酸纖維素膜用磷酸緩沖液洗滌；
將所述用磷酸鹽緩沖液洗滌后的硝酸纖維素膜涂板于培養(yǎng)基，在36. 8 37. 2°C 條件下培養(yǎng)18 24小時。本發(fā)明志賀氏菌培養(yǎng)方法，通過使用含志賀氏菌抗血清和硫代硫酸鈉的硝酸纖維素膜，根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的特異性，硝酸纖維素膜中志賀氏菌抗血清與樣本中的志賀氏菌特異結(jié)合，硫代硫酸鈉能防止其他的細菌在膜條上的生長，通過洗滌將其他細菌洗脫，將吸附有較純濃度志賀氏菌的硝酸纖維素膜條接種于培養(yǎng)基并進行培養(yǎng)，減少了其他細菌，特別是侵襲性大腸菌落對志賀氏菌菌落的影響，保證樣本中低濃度志賀氏菌不出現(xiàn)漏檢，從而提高志賀菌的檢出率。


圖I是本發(fā)明實施例志賀氏菌培養(yǎng)方法得到的SS瓊脂平板菌落圖；圖2是對比例志賀氏菌培養(yǎng)方法得到的SS瓊脂平板菌落圖；圖3是本發(fā)明實施例含硝酸纖維素膜的攪拌示意圖。
具體實施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。本發(fā)明實施例提供一種志賀氏菌培養(yǎng)方法，包括如下步驟步驟SOI，制備含志賀氏菌抗血清和硫代硫酸鈉的硝酸纖維素膜將硝酸纖維素膜用志賀氏菌抗血清處理一次以上，晾干后再用質(zhì)量百分數(shù)為 I % I. 5 %的硫代硫酸鈉處理，晾干，得到含志賀氏菌抗血清和硫代硫酸鈉的硝酸纖維素步驟S02，制備含志賀氏菌的硝酸纖維素膜將所述含志賀氏菌抗血清和硫代硫酸鈉的硝酸纖維素膜加入至含志賀氏菌的懸浮液中，于36. 8 37. 2°C條件下放置30 35分鐘，得到含志賀氏菌的硝酸纖維素膜；步驟S03，洗滌上述含志賀氏菌的硝酸纖維素膜將所述含志賀氏菌的硝酸纖維素膜用磷酸鹽緩沖液洗滌；步驟S04，培養(yǎng)志賀氏菌將所述用磷酸鹽緩沖液洗滌后的硝酸纖維素膜涂板于培養(yǎng)基，在36. 8 37. 2°C 條件下培養(yǎng)18 24小時。步驟SOl之前，還包括硝酸纖維素膜的預(yù)處理步驟在SM31-25膠版的一端，貼上帶有“MAX箭頭”的膜條；然后在SM31-25膠版的另一端貼上硝酸纖維素膜；然后將貼有“MAX箭頭”和硝酸纖維素膜的攪拌剪切成面積為4 Scm2的膜條。請參閱圖3，圖3顯示硝酸纖維素膜預(yù)處理后得到的膜條，在SM31-25膠版上，包括MAX箭頭I 和硝酸纖維素膜2。具體地，步驟SOl中，所述將硝酸纖維素膜用志賀氏菌抗血清處理的步驟具體為向硝酸纖維素膜上滴加志賀氏菌抗血清，晾干，再向硝酸纖維素膜上滴加志賀氏菌抗血清，晾干，使志賀氏菌抗血清對硝酸纖維素膜進行處理(浸潰)，志賀氏菌抗血清晾干以后，和硝酸纖維素膜緊密結(jié)合，實現(xiàn)志賀氏菌抗血清在硝酸纖維素膜上存留。步驟SOl中，該志賀氏菌抗血清用量為10 15ul，每次處理硝酸纖維素膜時志賀氏菌抗血清的用量沒有限制，能富集至少104cfu/ml的志賀氏菌。用志賀氏菌抗血清處理完硝酸纖維素膜后，晾干，再用質(zhì)量百分數(shù)為1% I. 5% 的硫代硫酸鈉處理該志賀氏菌抗血清處理后的硝酸纖維素膜(浸潰)，硫代硫酸鈉的用量沒有限制，優(yōu)選為10 15ul (能抑制部分大腸桿菌的生長)，硫代硫酸鈉處理完以后，晾干， 使硫代硫酸鈉硝酸纖維素膜緊密結(jié)合，實現(xiàn)硫代硫酸鈉在硝酸纖維素膜上存留。步驟S02 中，首先制備含志賀氏菌的懸浮液，方法沒有限制，例如I、在無菌操作條件下，將含有志賀氏菌的樣品(肛拭子，普通醫(yī)院體檢科能得到) 加入至GN增菌液中，置36°C培養(yǎng)6小時 8小時；2、取Iml上述I步驟之后的液體，在3500rpm條件下離心2分鐘，去除上清液，加入Iml磷酸鹽緩沖液懸浮，即得到含志賀氏菌的懸浮液；得到含志賀氏菌的懸浮液后，將步驟SOl所得到的含志賀氏菌抗血清和硫代硫酸鈉的硝酸纖維素膜加入至含志賀氏菌的懸浮液中，于36. 8 37. 2°C條件下放置30 35分鐘，通過志賀氏菌和硝酸纖維素膜上的志賀氏菌抗血清的抗原抗體反應(yīng)，使志賀氏菌附著于硝酸纖維素膜上，得到含志賀氏菌的硝酸纖維素膜。具體地，步驟S03中，將步驟S02所得到的含志賀氏菌的硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)移至含有磷酸鹽緩沖液(PBS)的離心管中，放置2 3分鐘，進行第一次洗滌；由于硝酸纖維素膜上的硫代硫酸鈉會阻止步驟S02中的含志賀氏菌的懸浮液中的其他細菌在硝酸纖維素膜上生長，經(jīng)過步驟S03用磷酸鹽緩沖液洗滌，使得硝酸纖維素膜上的志賀氏菌以外的其他菌被洗脫；上次洗滌步驟完成后，再次將經(jīng)過洗滌后的含志賀氏菌的硝酸纖維素膜放入至另一含磷酸鹽緩沖液的離心管中，放置2 3分鐘，進行第二次洗滌，使得硝酸纖維素膜上的非志賀氏菌被洗脫干凈。具體地，步驟S04中，將經(jīng)過步驟S03洗滌后的含志賀氏菌的硝酸纖維素膜涂板與培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基為SS平板或HE瓊脂平板，然后在36. 8 37. 2°C條件下培養(yǎng)18 24 小時，即完成志賀氏菌的培養(yǎng)。本步驟涂板時，將貼有“MAX箭頭”膜條的一端折成90°左右，便于操作，貼有硝酸纖維素膜的一端與瓊脂平板充分接觸，每平板涂I 2次，然后用接種環(huán)將其劃開。進一步，步驟S04完成后，還包括檢測步驟從志賀氏菌培養(yǎng)平板上挑選不少于5個 8個可疑菌落，進行生化鑒定和血清凝集試驗。本發(fā)明志賀氏菌培養(yǎng)方法，通過使用含志賀氏菌抗血清和硫代硫酸鈉的硝酸纖維素膜，根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的特異性，硝酸纖維素膜中志賀氏菌抗血清與樣本中的志賀氏菌特異結(jié)合，硫代硫酸鈉能防止其他的細菌在膜條上的生長，通過洗滌將其他細菌洗脫，將吸附有較純濃度志賀氏菌膜條接種于麥康凱瓊脂平板或伊紅美藍瓊脂平板，減少了其他細菌，特別是侵襲性大腸菌落對志賀氏菌菌落的影響，保證樣本中低濃度志賀氏菌不出現(xiàn)漏檢,從而提高志賀菌的檢出率。
以下結(jié)合具體實施例對上述志賀氏菌培養(yǎng)方法進行詳細闡述。實施例一本發(fā)明實施例志賀氏菌培養(yǎng)方法包括如下步驟a)將“MAX箭頭”膜條貼在SM31-25膠板一端，另一端貼硝酸纖維素膜；b)將上述膠版切成8cmX0. 5cm的大??；c)在貼有硝酸纖維素膜的一端滴加5ul志賀氏菌抗血清，室溫晾干后再加入5ul 志賀氏菌抗血清，室溫晾干后滴加I %硫代硫酸鈉溶液10ul，晾干得到含志賀氏菌抗血清和硫代硫酸鈉的硝酸纖維素膜，加入干燥劑封好，備用；d)待檢樣本加入GN增菌液中，置37°C培養(yǎng)6小時；e)取上述GN增菌液3500rpm離心2min,去除上清,加入ImL的磷酸鹽緩沖液懸浮, 得到含志賀氏菌的懸浮液，將上述含志賀氏菌抗血清和硫代硫酸鈉的硝酸纖維素膜上貼有硝酸纖維素膜的一端侵入含志賀氏菌抗血清的懸浮液中37°C放置30min，將膜條轉(zhuǎn)移至含有Iml磷酸鹽緩沖液溶液的離心管中，放置2 3min，重復(fù)洗滌I次，將膜條涂板于SS平板，于36°C培養(yǎng)18小時。實施例二本發(fā)明實施例志賀氏菌培養(yǎng)方法包括如下步驟a)將“MAX箭頭”膜條貼在SM31-25膠板一端，另一端貼硝酸纖維素膜；b)將上述膠版切成8cmX Icm的大??；c)在貼有硝酸纖維素膜的一端滴加7ul志賀氏菌抗血清，室溫晾干后再加入5ul 志賀氏菌抗血清，室溫晾干后滴加I. 5%硫代硫酸鈉溶液15ul，晾干得到含志賀氏菌抗血清和硫代硫酸鈉的硝酸纖維素膜，加入干燥劑封好，備用；d)待檢樣本加入GN增菌液中，置37. 2°C培養(yǎng)8小時；e)取上述GN增菌液3500rpm離心2min,去除上清,加入ImL的磷酸鹽緩沖液懸浮，得到含志賀氏菌的懸浮液，將上述含志賀氏菌抗血清和硫代硫酸鈉的硝酸纖維素膜上貼有硝酸纖維素膜的一端侵入含志賀氏菌的懸浮液中37. 2°C放置35min，將膜條轉(zhuǎn)移至含有Iml磷酸鹽緩沖液溶液的離心管中，放置2 3min，重復(fù)洗滌I次，將膜條涂板于SS平板，于36°C培養(yǎng)18小時。實施例三本發(fā)明實施例志賀氏菌培養(yǎng)方法包括如下步驟a)將“MAX箭頭”膜條貼在SM31-25膠板一端，另一端貼硝酸纖維素膜；b)將上述膠版切成12cmX0. 5cm的大?。籧)在貼有硝酸纖維素膜的一端滴加6ul志賀氏菌抗血清，室溫晾干后再加入6ul 志賀氏菌抗血清，室溫晾干后滴加I. 25%硫代硫酸鈉溶液12ul，晾干得到含志賀氏菌抗血清和硫代硫酸鈉的硝酸纖維素膜，加入干燥劑封好，備用；d)待檢樣本加入GN增菌液中，置36. 8°C培養(yǎng)7小時；e)取上述GN增菌液3500rpm離心2min,去除上清,加入ImL的磷酸鹽緩沖液懸浮，將上述含志賀氏菌抗血清和硫代硫酸鈉的硝酸纖維素膜上貼有硝酸纖維素膜的一端侵入懸浮液中36. 8°C放置32min，將膜條轉(zhuǎn)移至含有Iml磷酸鹽緩沖液溶液的離心管中，放置 2 3min，重復(fù)洗滌I次，將膜條涂板于SS平板，于36°C培養(yǎng)18小時。
對比例(I)待檢樣本加入GN增菌液中，置36°C培養(yǎng)6小時。(2)對照組(培養(yǎng)法):取上述GN增菌液I環(huán)劃線接種于SS瓊脂平板，于36°C培養(yǎng)18小時結(jié)果報告請參閱圖1，圖I顯示本發(fā)明實施例志賀氏菌培養(yǎng)方法得到的SS瓊脂平板菌落圖， 該SS瓊脂平板上可明顯看出志賀氏菌菌落，請參閱圖2，圖2顯示對比例志賀氏菌培養(yǎng)方法得到的SS瓊脂平板菌落圖，從圖2中可以看出，對比例的SS瓊脂平板上大部分是侵襲性大腸桿菌，難以挑取出志賀氏菌菌落。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種志賀氏菌培養(yǎng)方法，包括如下步驟將硝酸纖維素膜用志賀氏菌抗血清處理一次以上，晾干后再用質(zhì)量百分數(shù)為1% I. 5%的硫代硫酸鈉處理，晾干，得到含志賀氏菌抗血清和硫代硫酸鈉的硝酸纖維素膜；將所述含志賀氏菌抗血清和硫代硫酸鈉的硝酸纖維素膜加入至含志賀氏菌的懸浮液中，于36. 8 37. 2°C條件下放置30 35分鐘，得到含志賀氏菌的硝酸纖維素膜；將所述含志賀氏菌的硝酸纖維素膜用磷酸鹽緩沖液洗滌；將所述用磷酸鹽緩沖液洗滌后的硝酸纖維素膜涂板于培養(yǎng)基，在36. 8 37. 2°C條件下培養(yǎng)18 24小時。
2.如權(quán)利要求I所述的志賀氏菌培養(yǎng)方法，其特征在于，所述硝酸纖維素膜的面積為 4 8cm2。
3.如權(quán)利要求I所述的志賀氏菌培養(yǎng)方法，其特征在于，所述志賀氏菌抗血清的用量為 10 15ul。
4.如權(quán)利要求2所述的志賀氏菌培養(yǎng)方法，其特征在于，所述硫代硫酸鈉的體積為 10 15ul。
5.如權(quán)利要求I所述的志賀氏菌培養(yǎng)方法，其特征在于，所述含志賀氏菌的懸浮液通過如下步驟制備將含志賀氏菌的樣品加入至GN增菌液中，在36. 8 37. 2°C條件下培養(yǎng)6 8小時，離心后除上清液，加入磷酸鹽緩沖液懸浮，得到含志賀氏菌的懸浮液。
全文摘要
本發(fā)明適用于微生物領(lǐng)域，提供了一種志賀氏菌培養(yǎng)方法，包括制備含志賀氏菌抗血清和硫代硫酸鈉的硝酸纖維素膜、制備含志賀氏菌的硝酸纖維素膜、洗滌上述含志賀氏菌的硝酸纖維素膜及培養(yǎng)志賀氏菌等步驟。本發(fā)明志賀氏菌培養(yǎng)方法，通過使用含志賀氏菌抗血清和硫代硫酸鈉的硝酸纖維素膜，減少了其他細菌，特別是侵襲性大腸菌落對志賀氏菌菌落的影響，保證樣本中低濃度志賀氏菌不出現(xiàn)漏檢，從而提高志賀菌的檢出率。
文檔編號C12R1/01GK102604866SQ20121006811
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月15日
發(fā)明者盧柳燕, 吳炳義, 唐曉玲, 李兵, 汪再興, 董紹旺, 龔劍 申請人:深圳市生科源技術(shù)有限公司