專利名稱：志賀氏菌IpaD蛋白及其作為抗志賀氏菌感染疫苗的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及阻斷志賀氏菌(Shigella)侵入動物細胞從而防止志賀氏菌感染或降 低其嚴重性的組合物和方法。更具體而言，本發(fā)明涉及從天然來源和/或通過合成或重組 技術(shù)獲取的IpaD蛋白及其共軛體的使用以誘導具有對抗多種血清型的志賀氏菌特別是福 氏志賀氏菌(S.flexneri)的保護性活性的中和抗體。本發(fā)明的組合物可用于預防和/或 治療由志賀氏菌屬細菌造成的志賀氏菌痢疾。
背景技術(shù)：
許多革蘭氏陰性病原性細菌使用第III型分泌(T3S)系統(tǒng)來與它們的宿主細胞 相互作用。每個T3S系統(tǒng)由跨越細菌包膜并延伸到細菌表面的分泌裝置(T3SA)、運送通 過T3SA然后嵌入所述宿主細胞膜并形成孔的轉(zhuǎn)運子、運送通過T3SA和所述轉(zhuǎn)運子孔以到 達細胞質(zhì)的效應子、與轉(zhuǎn)運子和效應子相關(guān)的細胞質(zhì)中的特異性分子伴侶和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子組 成。T3SA的組裝需要約15種蛋白。 隸屬志賀氏菌屬的細菌是人類志賀氏菌痢疾的病原體[l]。細菌侵入上皮細胞 和在巨噬細胞中誘導細胞凋亡所需的基因聚集在一個220-kb毒性質(zhì)粒的稱作侵入?yún)^(qū)域的 30-kb區(qū)域內(nèi)。所述侵入?yún)^(qū)域含有編碼T3SA成分的mxi和spa基因，編碼運送通過T3SA 的蛋白的ipaA、B、C和D， ipgBl， ipgD及icsB基因，編碼分子伴侶的ipgA、 ipgC、 ipgE和 spal5基因，以及編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的virB和mxiE基因[2]。 在生長于培養(yǎng)液中的細菌內(nèi)是弱活性的T3SA通過細菌與上皮細胞的接觸而激活 [3] 。 ipaA、 ipaB、 ipaC和ipaD以及大多數(shù)mxi和spa基因的失活廢除了細菌侵入上皮細 胞、在巨噬細胞內(nèi)誘導細胞凋亡和表達接觸溶血活性的能力。IpaB和IpaC含有疏水部分且 保持與溶解的紅細胞膜關(guān)聯(lián)，表明這兩種蛋白是福氏志賀氏菌轉(zhuǎn)運子的成分。此外，已經(jīng)提 出IpaB和IpaC有效應子功能[4， 5， 6， 7， 8] 。 ipaB和ipaD而非ipaC的失活導致去調(diào)節(jié)的 T3SA，即本質(zhì)上活性的T3SA，表明IpaB和IpaD在保持T3SA在沒有誘導子時失活上起著重 要作用[9，10]。 IpaD的一小部分與細菌包膜相連[9，11]。 Picking及其合作者[12]報道 了 IpaD在T3SA活性控制中的作用可以與它在細菌侵入上皮細胞中的作用分開。
為得到對針狀復合體的結(jié)構(gòu)更深的認識，本發(fā)明人在用交聯(lián)劑BS3處理的細菌上 進行了免疫電子顯微鏡分析，所述分析既在整個細菌上也在輕度純化的針狀復合體(NC) 上進行。本發(fā)明人為IpaD是位于針端的NC的成分且抗IpaD培育的抗體對福氏志賀氏菌 侵入上皮細胞具有抑制效果提出了證據(jù)。


圖1 :用B^處理的負染色細菌的電子顯微照片。箭頭表示伸出細菌表面的針尖處 的顯著致密體。線段代表100nm。 圖2 :由單顆粒分析獲得的NC的針部分的投影映射圖(class-sums) 。 (A-B)從野 生型分離的NC的映射圖，用BS3處理(A-C);來自野生型而不用BS3處理(D-F)和來自ipaD突變株而用B^處理(G-I)。箭頭指向與不用B^處理制備的針部分相連的殘余致密體。線 段代表10nm。 圖3 :純化NC的免疫印跡分析。用SDS-PAGE和使用MxiJ、MxiN和IpaD的特異性 抗體的免疫印跡分析了從野生型和IpaD缺乏菌株純化的全細胞提取物(WCE)和交聯(lián)(+CR) NC和非交聯(lián)(-CR)NC。在從交聯(lián)的野生型細菌制備的NC中IpaD僅富集到WCE水平。MxiJ 是表現(xiàn)完整T3SA的正對照。T3S的細胞質(zhì)成分MxiN是表現(xiàn)非結(jié)合細胞質(zhì)蛋白的污染的正 對照。 圖4 :免疫電子顯微鏡所示IpaD局部化。將提純自BS3處理的野生型細菌的NC與 抗IpaD抗體一起培養(yǎng)并負染色(A-D)。在E中顯示了提純自未用B^處理的細菌的250個 NC的平均圖像作為對比。線段代表10nm。 圖5 :上皮細胞受野生型福氏志賀氏菌的侵襲試驗。將細菌與抗IpaD和抗IpaB多 克隆抗體的系列稀釋液一起培養(yǎng)，并通過將細胞裂解液點板對細胞內(nèi)的抗慶大霉素細菌計 數(shù)。相對于用PBS處理的野生菌株的侵入效率表達了在各個條件下的侵入效率。數(shù)值為至 少三次獨立實驗的平均值，誤差線段表示標準偏差。 圖6 :志賀氏菌菌株IpaD蛋白的現(xiàn)有技術(shù)氨基酸序列(GenBank登錄號 AL391753)。 圖7 :編碼圖6的IpaD蛋白(GenBank登錄號AL391753)的現(xiàn)有技術(shù)核酸序列。
具體實施例方式
本發(fā)明人驚訝地發(fā)現(xiàn)IpaD特異性中和抗體能阻斷志賀氏菌侵入允許細胞諸如上 皮細胞且在不同志賀氏菌血清型中觀測到了該中和效果。就此而論，本發(fā)明具體涉及IpaD 蛋白，編碼該蛋白或抗IpaD中和抗體的多核苷酸在引起對抗志賀氏菌感染的交叉保護組 合物的制備和方法施展中的使用。
定義 術(shù)語"動物"或"宿主"指容易或已知會被志賀氏菌菌株諸如福氏志賀氏菌感染的 任何動物。具體而言，所述動物包括人類。 術(shù)語"允許細胞"指能被志賀氏菌菌株感染的細胞。例如，這種細胞可以為不僅僅 限于上皮細胞或免疫系統(tǒng)細胞，特別是在小腸粘膜免疫系統(tǒng)中是志賀氏菌侵襲目標的那些 免疫系統(tǒng)細胞，諸如樹突狀細胞和單核細胞/巨噬細胞，而且包括B和T淋巴細胞，所述淋 巴細胞受到通過第III型分泌系統(tǒng)的志賀氏菌效應子的注入，盡管這不會導致志賀氏菌侵 襲。 術(shù)語"治療"指一種過程，通過所述過程減輕或完全消除了與志賀氏菌菌株有關(guān)的 感染或疾病的癥狀。如本文所用，術(shù)語"防止"指一種過程，通過所述過程阻礙或延遲了與 志賀氏菌菌株有關(guān)的感染或疾病的癥狀。 術(shù)語"保護性應答"指對志賀氏菌相關(guān)疾病的發(fā)病或者由物種導致的感染的預防， 或減輕在動物中存在的這類疾病的嚴重性。 表述"可接受的載體"指容納本發(fā)明所設想的組合物組成部分的載具，所述載具能 對動物宿主施用而沒有不良反應。本領(lǐng)域內(nèi)已知的合適載體包括但不限于金顆粒、無菌水、 生理鹽水、葡萄糖、右旋糖或緩沖溶液。載體可包含包括稀釋劑、穩(wěn)定劑(例如，糖類和氨基
5酸)、防腐劑、潤濕劑、乳化劑、PH緩沖劑、增粘添加劑、色素等等在內(nèi)的助劑。 通常所理解和本文所用的"功能性衍生物"指具備與完整IpaD蛋白/肽序列生物
活性基本相似的功能性生物活性的蛋白/肽序列。換言之，它優(yōu)選的是指基本保留了在對
動物施用所述功能性衍生物時引發(fā)產(chǎn)生對抗志賀氏菌菌株感染的抗IpaD中和抗體的能力
的多肽或其片段。 通常所理解和本文所用的"功能性片段"指對與完整IpaD核酸序列生物活性基本 相似的功能性生物活性編碼的核酸序列。換言之，且在本發(fā)明的背景下，它優(yōu)選的是指基本 保留了編碼IpaD多肽/蛋白的能力的核酸或其片段，所述IpaD多肽/蛋白在對動物施用 時引發(fā)了對抗志賀氏菌菌株感染的抗IpaD中和抗體的產(chǎn)生。 術(shù)語"志賀氏菌血清型"指通過大寫字母A D辨識的四組志賀氏菌痢疾志賀 氏菌(Shigella dysenteriae) (A)、福氏志賀氏菌(Shigellaflexneri) (B)、鮑氏志賀氏菌 (Shigella boydii) (C)和宋內(nèi)氏志賀氏菌(Shigella sonnei) (D)。它們各自包含A組:8 種血清型，B組11種血清型和亞血清型，C組11種血清型，D組1種血清型。例如，志賀 氏菌血清型可以為但不限于福氏志賀氏菌2a、 lb及3a，痢疾志賀氏菌1和宋內(nèi)氏志賀氏菌。
術(shù)語"中禾口"或"阻斷"是指本發(fā)明的抗IpaD抗體的能力，所述抗IpaD抗體與IpaD 蛋白特異性結(jié)合并干擾IpaD蛋白的生物功能因而阻斷了例如所述細菌將其毒性效應子傳 輸?shù)侥繕思毎哪芰?。換言之，這類抗體有利地解除了所述病原體的威脅并使其既無法造 成損害又不能有效抵抗宿主免疫防御。
本發(fā)明的組合物 在一方面，本發(fā)明提供了治療和/或預防志賀氏菌感染的組合物。本發(fā)明還提供
了阻斷至少一種志賀氏菌血清型侵入允許細胞的組合物。本發(fā)明的這些預期組合物至少包
含下列組成部分之一 -IpaD多肽或其功能性衍生物；-編碼IpaD多肽或其功能性片段的多核苷酸；-抗IpaD中和抗體。 本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員可以理解的是，本發(fā)明的組合物有利地在對宿主施用時提供 了對抗一種以上志賀氏菌血清型的交叉保護。換言之，本發(fā)明的組合物防止或顯著降低了 一種以上志賀氏菌血清型對允許細胞的侵入。 本發(fā)明所預期的IpaD多肽或其功能性衍生物具有例如與GenBank登錄號 AL391753的氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列，并在本文中稱為SEQ ID.NO:l(參 見圖6)。在所述IpaD多肽的功能性衍生物的情形中，可以使用于2007年10月10日存在 CNCM的登錄號為1-3839的pMal-IpaD質(zhì)粒。該質(zhì)粒編碼從IpaD蛋白的130號密碼子開始 的IpaD蛋白片段。 在提及氨基酸序列時通過"基本相同"可以理解的是，本發(fā)明所設想的多肽具有例 如對于SEQ ID冊1所示的部分或全部序列有至少75%同一性或85%同一性或甚至95% 同一性的氨基酸序列。 本發(fā)明所設想的多核苷酸或其功能性片段為如上所述的IpaD多肽或其功能性衍 生物進行編碼。例如，這種多核苷酸具有與GenBank登錄號AL391753的核苷酸序列相同或 基本相同的核苷酸或核酸序列， 在本文中稱為SEQ ID N0:2(參見圖7)。在所述IpaD多的pMal-IpaD質(zhì)粒。 在提及核苷酸序列或多核苷酸序列時通過"基本相同"可以理解的是，本發(fā)明所 設想的多核苷酸具有例如對于SEQ ID冊2所示的部分或全部序列有至少65%同一性或 80%同一性或甚至95%同一性的核酸序列。 確定核酸和氨基酸"序列同一性"的技術(shù)也是本領(lǐng)域內(nèi)已知的。典型地，所述技 術(shù)包括確定基因的mRNA核苷酸序列、DNA序列自身和/或確定由該基因編碼的氨基酸序 列，并將這些序列與第二核苷酸或氨基酸序列比較。 一般而言，"同一性"指兩個多核苷 酸序列的核苷酸對核苷酸，或多肽序列的氨基酸對氨基酸的各自嚴格對應?？赏ㄟ^確定 兩個或多個序列(多核苷酸或氨基酸)的"百分比同一性"來比較所述兩個或多個序列。 不管是核酸序列還是氨基酸序列，兩個序列的百分比同一性是兩個對準的序列之間的嚴 格匹配數(shù)除以較短序列長度并乘以100。對核酸序列的大致比對由Smith & Waterman, Advances inApplied Mathematics 2:482-489(1981)的局部同源性算法提供。該算法 可通過使用計分矩陣而應用于氨基酸序列，所述計分矩陣由Dayhoff， Atlas of Protein Sequences and Structure, M. 0. Dayhoff ed. ，5suppl.3 :353-358， National Biomedical Research Fo皿dation，Washington，D. C. ， USA開發(fā)并由Gribskov，Nucl. Acids Res. 14(6): 6745-6763(1986)歸一化。Genetics Computer G麗p(Madison， Wis.)在"BestFit"實用 程序應用中提供了確定序列的百分比同一性的該算法的示例性實現(xiàn)方式。在Wisconsin Sequence Analysis Package Program Ma皿al， Version 8(1995)(可從Genetics Computer Group,Madison, Wis.獲取)中說明了該方法的缺省參數(shù)。在本發(fā)明的背景下確立百分比同 一性的優(yōu)選方法是使用MPSRCH程序包，該程序包由University of Edinburgh版權(quán)所有， 由JohnF. Collins禾口 Shane S. Sturrok開發(fā)并由IntelliGenetics， Inc. (Mo皿tainView， Calif.)分發(fā)。Smith-Waterman算法可以從這套程序包中采用，其中對計分表使用缺 省參數(shù)(例如，空隙開放罰分為12，空隙延長罰分為1，空隙為6)。在所產(chǎn)生數(shù)據(jù)中"匹 配"("Match")值反映了"序列同一性"。計算序列之間的百分比同一性或相似性的其它 適合程序通常在本領(lǐng)域內(nèi)已知，例如，另一個比對程序是BLAST,使用缺省參數(shù)。例如，可 使用BLASTN和BLASTP，使用下列缺省參數(shù)遺傳密碼=標準；過濾=無；鏈型=兩種均有； 截止=60 ;期望=10 ;矩陣BL0SUM62 ;描述=50條序列；分類=高分；數(shù)據(jù)庫=非冗余， GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻譯+瑞士 (Swiss)蛋白+Spupdate+PIR。
可通過各種本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的方法來制備與IpaD蛋白特異性結(jié)合的本 發(fā)明所設想的中和抗體。例如，可對動物施用所述IpaD多肽以便誘導多克隆抗體的產(chǎn) 生。另一種方式是，如本文所述使用的抗IpaD中和抗體可為單克隆抗體，所述抗體使 用已知雜交瘤技術(shù)制備(參見，例如Hammerling等，In Monoclonal Antibodies and T-CeIIHybridomas， Elsevier, NY， 1981)。關(guān)于本發(fā)明所設想的抗體，術(shù)語"特異性結(jié)合"指 以相對高親和力結(jié)合到一個或多個IpaD多肽的表位的抗體，但所述抗體不顯著識別和結(jié) 合除所述IpaD多肽外的其它分子。如本文所用，術(shù)語"相對高親和力"指所述抗體和所述 IpaD多肽之間的結(jié)合親和力至少為106M—、且優(yōu)選為約107M—1而更優(yōu)選為108M—1 101QM—、 該親和力的確定優(yōu)選在標準競爭性結(jié)合免疫檢測條件下進行，所述標準競爭性結(jié)合免疫檢 測條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員的常識。 可以理解的是，對阻礙志賀氏菌侵入細胞的抗體的篩選和鑒定在本領(lǐng)域技術(shù)人員
7的知識范圍內(nèi)。 在優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的組合物還包含佐劑。如本文所用，術(shù)語"佐劑"指加 入本發(fā)明的組合物中以增加所述組合物的免疫原性的物質(zhì)。佐劑如何作用的機理還未完全 知曉。據(jù)信某些佐劑通過緩慢釋放抗原來增強免疫應答(體液應答和/或細胞應答)，而 其它佐劑本身是強免疫原性的且據(jù)信它們協(xié)同地發(fā)揮功能。已知佐劑包括但不限于油和水 乳狀液(例如，弗氏(Freund' s)完全佐劑和弗氏不完全佐劑)、白喉桿菌-parvuin、 Quil A、細胞因子諸如IL 12、Emulsigen-Plus⑧、卡介苗(Bacillus Calmette Guerin)、氫氧化 鋁、葡聚糖、硫酸右旋糖苷、氧化鐵、海藻酸鈉、Bacto佐劑、某些合成高分子諸如聚氨基酸和 氨基酸共聚物、皂苷、石蠟油和胞壁酰二肽。佐劑還包括基因佐劑諸如在共接種的DNA中編 碼的免疫調(diào)制分子，或CpG寡核苷酸。所述共接種的DNA可以與質(zhì)粒免疫原在同一質(zhì)粒構(gòu) 建中或在單獨DNA載體中。 根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，所述組合物還可包含多糖(polyosidic)抗原，諸如 W0 2005/003995中所述多糖抗原。例如，設想的多糖抗原可以為但不限于對應于目的菌株 的0側(cè)鏈(血清型的要素)的合成多糖，特別是那些優(yōu)選考慮其高流行率的血清型福氏志 賀氏菌2a、lb及3a、痢疾志賀氏菌1和宋內(nèi)氏志賀氏菌。還可用從相似血清型的細菌培養(yǎng) 物中提取的脂多糖(LPS)解除所設想的多糖抗原的毒性。
處理方法和組合物 本發(fā)明所設想的IpaD多肽或功能性衍生物、編碼它們的多核苷酸或功能性片段 及抗體可以多種方式用于志賀氏菌感染的治療和/或預防，或用于阻斷志賀氏菌菌株侵入 允許細胞。 例如，且根據(jù)本發(fā)明的一個方面，所述IpaD多肽可作為免疫原用于特異性抗IpaD 中和抗體的產(chǎn)生。如前所述，可以使用適當?shù)囊阎Y選方法來確定適合的抗IpaD中和抗 體，例如通過測量特定抗體阻礙或阻斷志賀氏菌菌株侵入細胞的能力。
根據(jù)另一方面，編碼IpaD多肽或其衍生物的多核苷酸可用在DNA免疫方法中以產(chǎn) 生抗IpaD中和抗體。亦即，可將它們并入在注射后可復制和表達的載體中從而在體內(nèi)產(chǎn)生 所述抗原多肽。例如，可將多核苷酸合并到在CMV啟動子控制下的在真核細胞中有功能性 的質(zhì)粒載體中。優(yōu)選的是將所述載體進行肌肉注射。 本發(fā)明的多核苷酸在基因免疫中的使用將優(yōu)選地采用適當?shù)妮斔头椒ɑ蜉斔拖?統(tǒng)諸如質(zhì)粒DNA在肌肉中直接注射[Wolf等H M G(1992) 1 :363 ;Tumes等，Vaccine (1999)， 17 :2089 ;Le等，Vaccine (2000) 18 :1893 ;Alves等，Vaccine (2001) 19 :788]、 帶佐 劑或不帶佐劑的質(zhì)粒DNA注射[Ulmer等，Vaccine (1999) 18 :18 ;MacLaughlin等， J. ControlRelease(1998)56 :259 ;Hartikka等，Gene Then (2000) 7 :1171-82 ;Be読nisty and Reshef， PNAS USA(1986)83 :9551 ;Singh等，PNASUSA(2000)97 :811]、通過與特異性 載體復合的DNA的傳輸來耙向細胞[Wa等，J Biol Chem(1989) 264 :16985 ;Ch即lin等， Infect. Immun. (1999)67 :6434]、注射復合或封裝于各種脂質(zhì)體形式中的質(zhì)粒[Ishii等， AIDS Research and Human Retroviruses(1997) 13 :142 ;Perrie等，Vaccine(2001) 19 : 3301]、用不同轟擊方法的DNA的施用[Tang等，Nature (1992) 356 :152 ;Eisenbraun等， DNA Cell Biol (1993) 12 :791，Chen等，Vaccine(2001) 19 :2908]以及帶活性載體的DNA的 施用[Tubulekas等，Gene (1997) 190 :191 ;Pushko等，Virology (1997) 239 :389 ;Spreng等FEMS (2000) 27 :299 ;Dietrich等，Vaccine (2001) 19 :2506]。 本發(fā)明的另一方面是被動免疫的特異性抗IpaD中和抗體的使用。 此外，本發(fā)明的另一方面是提供治療和/或預防動物中的志賀氏菌感染的方法。
本發(fā)明所述方法包括對所述動物施用本發(fā)明的組合物的步驟。 此外，本發(fā)明的另一方面是提供阻斷至少一種志賀氏菌血清型侵入允許細胞的方 法，所述方法包括允許通過將抗IpaD中和抗體與能感染所述允許細胞的志賀氏菌菌株接 觸來形成免疫復合物的步驟，所述免疫復合物防止或顯著降低了所述志賀氏菌菌株對允許 細胞的侵入。 本發(fā)明的組合物的成分或組成部分的量優(yōu)選為治療有效量。設想成分的治療有效 量是允許所述組合物執(zhí)行其免疫學作用(例如產(chǎn)生抗IpaD中和抗體)而不會在所述組合 物所施用的宿主中造成過度副作用所必須的量。待使用的成分和待施用的組合物的確切量 將根據(jù)諸如受治療的病況類型、待治療的動物的類型和年齡、施用模式以及所述組合物中 的其它成分等因素而變化。 本發(fā)明的組合物可通過各種施用途徑給予動物。例如，所述組合物可以以諸如無 菌可注射水性懸浮液或油狀懸浮液的無菌可注射制劑形式施用。這些懸浮液可根據(jù)本領(lǐng)域 內(nèi)已知技術(shù)使用適當?shù)姆稚┗驖櫇駝┖蛻腋﹣砼渲啤Ｋ鰺o菌可注射制劑也可為在腸 胃外可用的無毒稀釋劑或溶劑中的無菌可注射溶液或懸浮液。可以將它們在腸胃外施用， 例如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下注射、輸注或口服。適當劑量可以取決于諸如所述組合物內(nèi)各成 分的量、所需效果(短期或長期)、施用途徑、待治療的動物的年齡和體重等因素而變化。任 何其它本領(lǐng)域內(nèi)熟知的方法也可用于本發(fā)明的組合物的施用。 本發(fā)明的另一方面是提供用于本發(fā)明所設想的任何上述方法中的試劑盒。 一個試 劑盒可以包含執(zhí)行預定檢測所必須的兩個或多個成分。所述成分可為化合物、試劑、容器和 /或裝置。例如，試劑盒內(nèi)的一個容器可容納特異地中和IpaD蛋白的單克隆抗體或其片段 或多克隆抗體。另外的一個或多個容器可包含待用于所述檢測的組成部分諸如試劑或緩沖 液。本發(fā)明所設想的其它試劑盒可包含如上所述的至少一個IpaD多肽或編碼它的多核苷 酸以引導對抗志賀氏菌IpaD蛋白的中和免疫應答。 參考下列實施例將使本發(fā)明更易于理解。這些實施例是對本發(fā)明的廣泛應用范圍 的說明性實施例而并非旨在限制本發(fā)明的范圍?？梢栽谄渲羞M行修改和變化而不背離本發(fā) 明的主旨和范圍。盡管在實踐中可以使用任何與本文所述相似或等同的方法和材料，在下 文中將對優(yōu)選的方法和材料進行說明。
實施例 大量革蘭氏陰性病原菌使用第III型分泌(T3S)系統(tǒng)來將毒性蛋白注入動物和植 物宿主細胞內(nèi)。所述T3S裝置的核心被稱為針狀復合體，由橫穿兩層細菌膜的基本主體和 伸出細菌表面上方的針組成。在福氏志賀氏菌中，要求IpaD在細菌與宿主接觸前抑制T3S 裝置的活性，且已經(jīng)提出IpaD協(xié)助細菌蛋白轉(zhuǎn)移侵入宿主細胞。本發(fā)明人通過對交聯(lián)細菌 和輕度純化的針狀復合體的電子顯微鏡分析研究了 IpaD的定位。該分析揭示了針尖處的 顯著致密體的存在。單顆粒分析、免疫標記和生化分析的組合表明IpaD形成了針尖處結(jié)構(gòu) 的一部分。據(jù)顯示抗IpaD抗體阻斷了細菌侵入上皮細胞。
—般材料和方法
9
細菌菌株和生長培養(yǎng)基 本研究中使用的菌株是野生型福氏志賀氏菌5菌株M90T-Sm[13]，它的ipaD衍生 物SF622[14]。細菌在37t:的胰蛋白酶酪蛋白大豆培養(yǎng)液(TSB) (Sigma)中生長。
針狀復合體(NC)的純化 如文獻[15]所述純化NC。通過離心收集37t:的lL TSB中在指數(shù)生長期的細菌，重 新懸浮在25mL磷酸鹽緩沖生理鹽水中并在lmM二 (磺基琥珀酸亞胺基)辛二酸酯(BS3)的 存在下在37t:培養(yǎng)30min。添加lOOmM Tris-HCl到所述混合物中并在37。C培養(yǎng)15min。收 集BS3處理的培養(yǎng)物并將其重新懸浮在添加了 lmM苯甲基磺酰氟的冰冷裂解緩沖液(0. 5M 蔗糖，20mM Tris-HCl[pH 7. 5] ， 2mM EDTA， 0. 5mg/mL溶菌酶)中并在4t:培養(yǎng)45min然后 在37t:培養(yǎng)15min。將所得原生質(zhì)球與0. 01% Triton X-100 —起培養(yǎng)30min然后用4mM MgCl2禾口 80 ii g/mL DNA酶(Sigma)在30。C處理20min。通過離心(20， OOOg， 4°C ， 20min)除 去碎片，膜組分通過離心(110，000g，4°C，30min)顆?；⒅匦聭腋≡赥ET緩沖液中(20mM Tris-HCl pH 7. 5， lmM EDTA， 0. 01 % Triton X-100)。如文獻[16]所述用抗MxiJ、MxiN和 IpaD培育的抗體進行免疫印跡分析。
電子顯微鏡和圖像分析 在輝光放電的鍍碳銅網(wǎng)上用2X醋酸鈾對全細胞和純化NC樣品進行負染色。電子 顯微鏡分析在工作于120kV的裝有場發(fā)射槍的PhilipsCM120FEG型電子顯微鏡上進行。用 放大率為80， 000倍的4000SP 4K慢掃描CCD相機在樣本等級以3.75 A的像素尺寸(二進 制存儲圖像后)記錄圖像，并用"GRACE"軟件進行半自動樣本選擇和數(shù)據(jù)采集[17]。如文 獻[15]所述進行包括多參考和非參考方法的單顆粒分析、多元統(tǒng)計分析和分類。對于免疫 標記，將純化NC與親和純化的IpaD多克隆抗體(pAbs) —起在最終濃度0. 132ng/ y L下在 2(TC培養(yǎng)lh。如上所述對樣品用2%醋酸鈾進行染色并觀測。
侵襲試驗 在抗IpaD抗體(稀釋1/2000 1/50)或抗IpaB抗體(1/50)存在下將2mL野生型 的培養(yǎng)液或指數(shù)生長期的mxiD菌株(0D6。。 為0. 4)在37。C培養(yǎng)lh并將細菌在含2105Hela 細胞的板上在2000g離心10min。在37。C培養(yǎng)lh后，在lh中用2mL EBSS沖洗細胞三次 并與含50iig/mL慶大霉素的2mL MEM介質(zhì)一起培養(yǎng)。在用2mL EBSS沖洗三次后，將板與 0. 5%脫氧膽酸鹽溶液在2(TC培養(yǎng)15min并稀釋細胞裂解液然后點板到瓊脂板上進行菌落 計數(shù)。 實施例1 :T3SA針尖處的顯著結(jié)構(gòu) 蛋白純化過程傾向于選擇不含有微弱相連的亞單元的最穩(wěn)定復合體。近來，本發(fā) 明人揭示了低達0. 01%濃度的Triton-XlOO表面活性劑足以誘導NC從細胞膜釋放(Sani 等，2006)。為檢測與所述針相連的潛在性不穩(wěn)定亞單元，本發(fā)明人在任何純化前在細菌上 用B^進行了交聯(lián)步驟。電子顯微鏡分析表明，在B^處理后，大多數(shù)細菌顯示了在針尖盡 頭處有額外致密體的附器(圖1)。 如文獻[18]所述在表面活性劑溶解細胞膜后從BS3處理的細菌中純化NC。對含 足夠數(shù)量的帶針尖處額外致密體的NC的制備物進行結(jié)構(gòu)分析。為計算孤立NC的二維投影 映射，用單顆粒分析對電子顯微鏡圖像進行分析。本發(fā)明人選擇了數(shù)百張NC圖像，所述NC 帶相對直而短的針端附器且長度接近45nm。平均化的NC清晰地顯示了在針尖以及基本主
10體的上部附近致密體的存在(圖2A和圖2B ;也參見圖4ENC的全圖)。然而，NC在平均化 后由于針長度的變化而看上去有點模糊。當在屏蔽基部后將投影對齊并分類后獲得了針部 分尖端的更銳利特征(圖2C)。針尖的任何一端處致密體的存在是交聯(lián)顆粒的平均映射的 顯著特征。相反，由沒有交聯(lián)的野生型菌株制備的顆粒的平均映射顯示了缺乏大多數(shù)這些 致密體的針(圖2D F)。在這些樣品中在交聯(lián)制備物中存在強致密體的相同位置上可看 到微弱的致密體(箭頭，圖2E和2F)。這些結(jié)果表明，在不存在交聯(lián)時，大多數(shù)純化NC失 去了形成交聯(lián)后觀測到的致密體的額外分子。為鑒定形成T3SA針尖處的致密體的分子，本 發(fā)明人用缺乏IpaD表達的ipaD突變體進行了類似實驗。需要IpaD與IpaB —起在沒有誘 導劑時保持T3SA失活且一小部分IpaD與膜相連[9]。從BS3處理的ipaD突變體中純化的 NC在針尖的任一端都沒有顯示致密體(圖2G I)，這表明IpaD是該結(jié)構(gòu)組成部分的一部 分或其組裝所必需。 實施例2 : IpaD存在于T3SA針尖處 為測試IpaD是否構(gòu)成所觀測的致密體，用SDS-PAGE和免疫印跡分析了從BS3處 理的野生型細菌中純化的NC(圖3)。與由非交聯(lián)細菌制備的NC相比(圖3，右圖，右列)， IpaD在由交聯(lián)野生型細菌中制備的NC中富集，然而少量仍在非交聯(lián)制備物中共純化因而 確證了非交聯(lián)NC的平均的針尖處微弱致密體。NC的主要成分MxiJ以相似量存在于所有制 備物中(圖3)。使用識別T3S系統(tǒng)的細胞質(zhì)成分的抗體的對照試驗沒有顯示細胞內(nèi)成分對 NC的任何污染(圖3)，這表明制備物中IpaD的存在不是由于細胞質(zhì)蛋白污染引起的。
為確認在NC尖端處檢測到的致密體含有IpaD，本發(fā)明人使用抗IpaD血清進行了 免疫染色。抗體特異性地結(jié)合到了由BS3處理的野生型細菌制備的NC的針尖(圖4A D)。 還觀察到某些針與它們的尖端相連，推測是與帶兩個針的二價抗體相互作用的結(jié)果(左下 圖，圖4D)。在對照實驗中，沒有發(fā)現(xiàn)與從ipaD突變體中分離的NC的針相結(jié)合的抗體(數(shù) 據(jù)未顯示)。 實施例3 :抗IpaD抗體阻斷細菌侵入上皮細胞 由于IpaD是細菌侵入上皮細胞所必需[14]，且由于如本文所示IpaD位于T3SA 的尖端，本發(fā)明人研究了抗IpaD抗體是否會干擾細菌侵入HeLa細胞。將細菌與不同濃度 的抗IpaD血清一起培養(yǎng)，或與抗IpaB血清一起培養(yǎng)作為對照，使用所述細菌感染HeLa細 胞。細菌在抗IpaD血清而非抗IpaB血清中的暴露以劑量依賴的方式抑制了細菌侵入。用 抗IpaD抗體的處理還抑制了福氏志賀氏菌2a菌株的侵入(數(shù)據(jù)未顯示)。
關(guān)于實施例1 3的一般性討論 在細菌與上皮細胞接觸后，福氏志賀氏菌T3SA被激活且通過ipaB或ipaD的失活 而去調(diào)制。本發(fā)明提出這些蛋白是形成連接T3SA的復合體所必需。本文中，本發(fā)明人提出 了 IpaD存在于針尖處的證據(jù)。來自交聯(lián)細菌的表面暴露的針的透射電子顯微照片顯示在 針尖處存在顯著結(jié)構(gòu)，而輕度純化的NC的免疫印跡分析表明IpaD與所述交聯(lián)NC —起被共 純化。 從交聯(lián)野生型細菌分離的NC的計算平均圖顯示了針尖任何一端處的顯著致密 體。在從未用交聯(lián)劑處理的野生型菌株和從用交聯(lián)劑處理的ipaD突變體分離的NC中都 沒有觀察到該特征。免疫電子顯微鏡的結(jié)果表明在針尖處所觀測到的致密體含有IpaD分 子。然而，無法從2D投影映射中獲取所述額外致密體的確切形狀。兩個額外物質(zhì)的維度為約7X7nm。由于IpaD的大小為37kDa，在這些結(jié)構(gòu)中可能存在數(shù)個IpaD的拷貝。事 實上，已提出IpaD可形成寡聚物[19]。 IpaD存在某些與小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersinia enterocolitica)的LcrV相似的結(jié)構(gòu)相似性，因為所述兩個蛋白具有相似大小且都是所提 出的轉(zhuǎn)運子嵌入宿主細胞的細胞膜所必需，所述轉(zhuǎn)運子為福氏志賀氏菌內(nèi)的IpaB和IpaC 以及小腸結(jié)腸炎耶爾森菌內(nèi)的YopB和UopD [9， 20， 21]。近期數(shù)據(jù)表明LcrV位于T3SA針的 尖端處[20]。耶爾森菌內(nèi)的結(jié)構(gòu)看上去與志賀氏菌內(nèi)結(jié)構(gòu)稍有不同，其側(cè)面的伸出致密體 較小且尖端不同。 對T3Sa針尖處的含結(jié)構(gòu)組成部分的IpaD的鑒定提供了對福氏志賀氏菌T3SA的 組成和結(jié)構(gòu)的進一步認識。不久前還用生化方法顯示了 IpaD定位在T3SA針尖，在那里它 發(fā)揮作用控制轉(zhuǎn)運子分泌并正確嵌入宿主細胞膜[22]。然而，本發(fā)明的單顆粒分析直接顯 示了 IpaD在針尖處的位置而且為IpaD在細菌與細胞接觸前充當T3SA的接頭的假設增加 了可信度。如同對耶爾森菌的LcrV所提出的一樣，IpaD也可能幫助轉(zhuǎn)運子的成分嵌入細 胞膜。通過用抗IpaD中和抗體處理來對細菌侵入HeLa細胞的抑制表明抗體與IpaD的結(jié) 合干擾了該蛋白的功能。在動物研究中也已顯示LcrV是瘟疫疾病的保護性抗原[23，24]。 于是，IpaD代表了可有效對抗幾種血清型的志賀氏菌的疫苗制劑的令人感興趣的目標。
實施例4 :抗IpaD抗體在體內(nèi)的保護性效果 將109CFU福氏志賀氏菌血清型5a單獨或在不同稀釋度的對IpaD特異的兔多克 隆血清存在下接種到運行于兔中的小腸髂腸管。所述抗IpaD多克隆血清在用由pMal-IpaD 表達載體表達的IpaD蛋白功能性衍生物進行免疫作用后產(chǎn)生，所述pMal-IpaD表達載體于 2007年10月10日保藏在CNCM，登記號為1-3839。該模型總結(jié)了在人類志賀氏菌痢疾期間 隨著該腸侵襲性細菌對小腸上皮的撕裂、侵襲和炎性破壞而觀察到的系列損傷。這些損傷 表現(xiàn)出小腸絨毛的形貌改變和水腫的組合，伴以炎性細胞濾出液，特別是多核中性粒細胞， 以及膿腫并最終在腸腔內(nèi)形成潰瘍。總之，這引起了通常為侵襲性的腔內(nèi)粘液膿性滲出液。
通過比較僅接種了細菌的小腸腸管內(nèi)與在抗IpaD多克隆血清存在下接受了細菌 的小腸腸管內(nèi)的組織破壞，觀察到了依賴于所述抗IpaD抗體濃度的保護性效果。事實上， 當所用血清未稀釋時，未見任何損傷。然而，當所用血清為1/10稀釋時，出現(xiàn)非常輕微的損 傷，而當使用1/100稀釋時損傷更明顯，但這些都沒有在僅用細菌時觀察到的嚴重。使用導 向非相關(guān)蛋白的對照多克隆血清沒有觀察到任何保護。因此，所觀察到的保護特異地與抗 IpaD抗體的存在相關(guān)。
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權(quán)利要求
阻斷至少一種志賀氏菌血清型侵入允許細胞的組合物，所述組合物至少包含下列組成部分之一-IpaD多肽或其功能性衍生物；-編碼IpaD多肽的多核苷酸或其功能性片段；和/或-抗IpaD中和抗體。
2. 用于志賀氏菌感染的治療和/或預防的組合物，所述組合物至少包含下列組成部分之一 -IpaD多肽或其功能性衍生物；-編碼IpaD多肽的多核苷酸或其功能性片段；和/或-抗IpaD中和抗體。
3. 如權(quán)利要求l或2所述的組合物，其中所述IpaD多肽具有與SEQ ID NO:l相同或基本相似的氨基酸序列。
4. 如權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中所述多核苷酸具有與SEQ ID N0:2相同或基本相似的核苷酸序列。
5. 如權(quán)利要求1 4中任一項所述的組合物，其中所述抗IpaD中和抗體是多克隆的。
6. 如權(quán)利要求1 4中任一項所述的組合物，其中所述抗IpaD中和抗體是單克隆的。
7. 如權(quán)利要求1 6中任一項所述的組合物，還包含多糖抗原。
8. 至少下列組成部分之一用于阻斷至少一種志賀氏菌血清型侵入允許細胞的用途，所述組成部分包括-IpaD多肽或其功能性衍生物；-編碼IpaD多肽的多核苷酸或其功能性片段；和/或-抗IpaD中和抗體。
9. 至少下列組成部分之一用于志賀氏菌感染的治療和/或預防的用途，所述組成部分包括-IpaD多肽或其功能性衍生物；-編碼IpaD多肽的多核苷酸或其功能性片段；和/或-抗IpaD中和抗體。
10. 如權(quán)利要求8或9所述的用途，其中所述IpaD多肽具有與SEQID NO:l相同或基本相似的氨基酸序列。
11. 如權(quán)利要求8或9所述的用途，其中所述多核苷酸具有與SEQID N0:2相同或基本相似的核苷酸序列。
12. 如權(quán)利要求8 11中任一項所述的用途，其中所述抗IpaD中和抗體是多克隆的。
13. 如權(quán)利要求8 11中任一項所述的用途，其中所述抗IpaD中和抗體是單克隆的。
14. 如權(quán)利要求8 13中任一項所述的用途，還包含多糖抗原。
15. 阻斷至少一種志賀氏菌血清型侵入允許細胞的試劑盒，所述試劑盒包含-IpaD多肽或其功能性衍生物；-編碼IpaD多肽的多核苷酸或其功能性片段；和/或_抗IpaD中和抗體。
16. 治療和/或預防動物中志賀氏菌感染的方法，所述方法包括對所述動物施用如權(quán)利要求1 7中任一項所定義的組合物的步驟。
17. 阻斷至少一種志賀氏菌血清型侵入允許細胞的方法，所述方法包括通過將抗IpaD中和抗體與能感染所述允許細胞的志賀氏菌菌株相接觸而允許形成免疫復合物的步驟，所述免疫復合物阻止或顯著降低所述志賀氏菌菌株對所述允許細胞的侵入。
18. 如權(quán)利要求17所述的方法，所述方法包括體內(nèi)方法。
19. 如權(quán)利要求17或18所述的方法，其中所述抗IpaD中和抗體由包含所述允許細胞的宿主在對所述宿主施用IpaD多肽或其功能性衍生物和/或編碼IpaD多肽的多核苷酸或其功能性片段后產(chǎn)生。
20. 如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述IpaD多肽具有與SEQ IDNO :1相同或基本相似的氨基酸序列。
21. 如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述多核苷酸具有與SEQ IDNO :2相同或基本相似的核苷酸序列。
22. 如權(quán)利要求17所述的方法，其中通過被動免疫宿主從而將所述抗IpaD中和抗體提供給包含所述允許細胞的宿主。
全文摘要
本發(fā)明涉及阻斷志賀氏菌侵入動物細胞從而提供對抗志賀氏菌感染的保護或降低其嚴重性的組合物和方法。更具體而言，本發(fā)明涉及從天然來源和/或通過合成或重組技術(shù)獲取的IpaD蛋白及其共軛體的使用以誘導具有對抗幾種血清型的志賀氏菌特別是福氏志賀氏菌的保護性活性的中和抗體。本發(fā)明的組合物可用于預防和/或治療由志賀氏菌屬細菌造成的志賀氏菌痢疾。
文檔編號A61K39/00GK101707918SQ200780046068
公開日2010年5月12日 申請日期2007年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月12日
發(fā)明者克勞德·帕索特, 埃格伯特·J·伯克馬, 安妮·博蒂奧克斯, 穆薩·薩尼, 菲利普·桑索尼蒂, 阿德貝爾莫奈姆·阿拉奧伊 申請人:巴斯德研究院;國家健康與醫(yī)學研究院;布魯塞爾自由大學;格羅寧根大學