專利名稱：一種可用于疫苗穩(wěn)定劑的類人膠原蛋白及其生產(chǎn)方法
技術領域：
本發(fā)明屬于疫苗穩(wěn)定劑技術領域，特別是涉及一種一種可用于疫苗穩(wěn)定劑的類 人膠原蛋白及其生產(chǎn)方法，利用基因工程技術改造酵母菌生產(chǎn)類人膠原蛋白。
背景技術：
膠原蛋白又稱膠原，是由三條肽鏈擰成的螺旋形纖維狀蛋白質，這類蛋白是人 體內含量最多的蛋白質。膠原蛋白的氨基酸組成有如下特征①、甘氨酸(glycine)約 25 30%，每隔兩個其他氨基酸殘基(X，Y)即有一個甘氨酸，其肽鏈可用(甘-X-Y) η表示。②、膠原中脯氨酸(Proline)約12 %，羥脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)約 10%, 一般動物性蛋白質中羥脯氨酸含量極少，另外丙氨酸(alanine)有11%，羥賴氨酸 (hydroxylysine)約0.5%。③、膠原中缺乏色氨酸，所以它在營養(yǎng)上為不完全蛋白質。由于膠原蛋白具有非抗原性、可生物降解、易吸收、無毒和生物相容等特性， 因此在醫(yī)學材料領域備受青睞，被廣泛用于手術縫合線、止血海綿、人工皮膚、人工血 管、人工角膜、藥物載體，疫苗穩(wěn)定劑等方面。很多疫苗對制備和保存過程的條件非常敏感，尤其是減毒活疫苗。為了保護生 物成分的完整性，在疫苗制備過程中通常加入穩(wěn)定劑以確保免疫接種功效。一直以來， 能夠作為疫苗穩(wěn)定劑的物質包括糖，堿金屬磷酸鹽，谷氨酸鹽，?；蛉搜灏椎鞍祝?蛋白水解物等，最主要的還有明膠。明膠(Gelatin)是膠原的水解產(chǎn)物，是一種無脂肪的 高蛋白，不含膽固醇，是保護疫苗穩(wěn)定的優(yōu)良選擇，但其主要從動物皮提取獲得。由于動物來源的膠原蛋白存在病毒隱患和易引發(fā)人體排異反應，因此采用分子 生物學技術制備重組人膠原蛋白有著各種傳統(tǒng)提取方法不可比擬的優(yōu)勢。目前，國內外 報道的利用基因工程技術表達膠原蛋白的宿主有，微生物(大腸桿菌和酵母)，昆蟲，哺 乳動物細胞等。由于大腸桿菌易培養(yǎng)，繁殖快，已有很多轉基因藥物成功表達的實例， 現(xiàn)已成為人們首選基因表達的載體。然而對于類人膠原蛋白來說，大腸桿菌存在致命的 缺陷，即大腸桿菌表達系統(tǒng)無法進行蛋白翻譯后修飾，所以無法形成高級結構的膠原蛋 白。昆蟲和哺乳動物細胞目前均處在實驗室水平，雖然兩者表達的重組膠原蛋白在結構 功能上更接近于人體膠原蛋白，但其成本高，生產(chǎn)周期較長等缺陷均又阻礙了它們的發(fā) 展。酵母是真核生物，具備分子伴侶蛋白和糖基化、羥基化、乙?；拿福梢詫σ?些具有高級結構的蛋白在合成后進行一定的修飾，并且酵母細胞的培養(yǎng)條件，成本也較 哺乳動物細胞低得多，非常適合工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種可用于疫苗穩(wěn)定劑的類人膠原蛋白及其生產(chǎn)方法， 一株新的酵母工程菌株，其可以利用人工合成類人膠原蛋白基因表達小分子量的類人膠 原蛋白。該酵母工程菌命名為畢赤酵母(Pichia sP.)，編號CGMCC No.4187。該菌種已
4經(jīng)在國家知識產(chǎn)權局指定的保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC No.4187，保藏時間2010年9月20日。為達到上述目的，本發(fā)明所采用的技術方案為1. 一種人工合成類人膠原蛋白基因Cd，其堿基序列如下GAAGCTGGTTTGCCTGGTGCTAAGGGTCTGACTGGTTCTCCTGGTTCTCCCG GACCCGATGGTAAGACTGGACC CCCAGGACCAGCTGGTCAAGATGGACGTCCTGGACCTCCAGGCCCTCCAGG GGCCCGAGGCCAAGCAGGTGTTATGGGGTTTCCTGGACCAAAGGGAGCAGCCGGCGAGCCAGGTAAAGCCGGC GAAAGGGGTGTCCCAGGACCACCAGGTGCTGTGGGACCAGCCGGCAAAGACGGTGAGGCAGGTGCTCAGGGTCC ACCAGGACCTGCTGGTCCTGCTGGAGAAAGATAA其核酸長度為306bp。2.所述類人膠原蛋白的生產(chǎn)方法如下(1)所述酵母工程菌的構建方法①根據(jù)已知膠原蛋白氨基酸序列人工合成其基因序列，然后進行酵母密碼子偏 好性的修飾，最終獲得人工合成類人膠原蛋白基因Cd。②再將人工合成類人膠原蛋白基因col克隆至酵母表達載體pPICZa，命名為 pPICZ α /col ；。③利用電擊轉化方法將重組質粒pPICZ α /col轉化至酵母細胞X_33。④最后利用PCR和測序的方法篩選正確的酵母轉化子。(2)所述酵母工程菌的搖瓶誘導培養(yǎng)①固體培養(yǎng)基(YEPD)的成分及其每升含量為蛋白胨20克，酵母粉10克，葡 萄糖20克，瓊脂粉15克。②固體培養(yǎng)條件將酵母工程菌接種到上述固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，于 200C -50°C培養(yǎng) 3-5 天。③種子培養(yǎng)基的成分及其每升含量為蛋白胨20克，酵母粉10克，酵母膽堿 YNB13.4克，甘油10毫升，磷酸鉀緩沖液0.1摩爾，生物素0.4毫克。④種子液培養(yǎng)條件用無菌接種環(huán)從上述培養(yǎng)皿中取適量菌體，接種到已滅菌 的上述種子培養(yǎng)基中，20°C-50°C，220rpm搖床培養(yǎng)12-24小時。⑤搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及其每升含量為蛋白胨20克，酵母粉10克，酵母膽 堿YNB13.4克，甲醇10毫升，磷酸鉀緩沖液0.1摩爾，生物素0.4毫克。⑥搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件收獲酵母工程菌的種子液后，離心收集菌體，經(jīng)發(fā)酵培 養(yǎng)基洗劑，按照體積比-30%接種量將酵母工程菌接種到上述搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中， 200C -50°C, 100rpm-300rpm,期間需定期補充甲醇誘導維持體積比為0.5% -5%的濃 度，搖床培養(yǎng)1-10天。(3)所述類人膠原蛋白的粗提及驗證酵母工程菌發(fā)酵結束，離心收集發(fā)酵上清液，然后加入質量百分比為60%-100%的硫酸銨或硫酸鈉或氯化鈉進行沉淀濃縮，最后離心收集沉淀，獲得類人膠 原蛋白粗品；再經(jīng)質量百分比為5%濃縮膠和10%-20%分離膠的SDS-PAGE凝膠檢測。本發(fā)明的創(chuàng)新點在于獲得了一條適用于酵母表達體系的人工合成類人膠原蛋白 基因，一株可表達小分子量類人膠原蛋白的酵母工程菌，表達的小分子量的類人膠原蛋 白可替代明膠用于疫苗穩(wěn)定劑。本發(fā)明的優(yōu)點在于，利用酵母基因工程菌生產(chǎn)的類人膠原蛋白不僅具有良好的 生物學特性，而且與動物來源的產(chǎn)品相比具有無病毒隱患、低排異反應等優(yōu)良特性，故 經(jīng)純化后可替代動物來源的膠原蛋白應用于疫苗穩(wěn)定劑。菌種保藏信息名稱畢赤酵母(PichiasP.)，編號 CGMCC No.4187 ；保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏編號CGMCCNo.4187 ；保藏時間2010年9月20日。
具體實施例方式實施例1表達載體的構建合成的外源片段以連接在質粒pUC57上的形式獲得，將此質粒和真核表達載體 pPICZ α同時用EcoRI和XbaI兩種酶進行雙酶切，然后回收300bp大小的人工合成類人 膠原蛋白基因(參見

圖1)和線性化的載體pPICZa。利用T4DNA連接酶將上述兩片段進行連接，即構建成為表達載體pPICZ α / col。然后將連接體系轉化至大腸桿菌感受態(tài)細胞，利用Sac I單酶切方法進行驗證14個克 隆所提質粒，因正確質粒上僅含有1個Sac I酶切位點，所以酶切完畢出現(xiàn)質粒線性化的 為陽性結果，參見圖2。并將篩選獲得的11#，12#，14#三個質粒送去進一步測序驗證， 最終比對結果顯示12#和14#質粒含有正確、完整的人工合成類人膠原蛋白基因。實施例2酵母工程菌的構建1.質粒的線性化表達載體pPICZ α /col需線性化后轉化畢赤酵母X_33感受態(tài)，此目的是為了得 到更高的轉化效率。在本實驗中，線性化后的表達載體由Sac I消化后回收所得。2.酵母細胞電轉感受態(tài)的制備(1)在含5mlYPD的50ml離心管中，培養(yǎng)畢赤酵母，30°C過夜。(2)取0.5ml過夜培養(yǎng)物，接種含500ml新鮮培養(yǎng)基的2L搖瓶，過夜生長至 0D6001.5。(3)在4°C，1500g離心5min收集細胞，用500ml預冷的滅菌水懸浮細胞。(4)如上離心，用250ml預冷的滅菌水懸浮細胞。(5)如上離心，用20ml預冷的IM山梨醇懸浮細胞。(6)如上離心，用Iml預冷的IM山梨醇懸浮細胞，至終體積約1.5ml。3.轉化:(1)取80ul上述細胞與15ug線性化的表達載體pPICZ α /col (溶于5ulTE)混合，
轉入預冷的0.2cm電轉杯中。
(2)在冰上放置lOmin。(3)調整電穿孔儀參數(shù)電壓1.5KV ；電容25 μ F ；電阻200 Ω。電擊樣品，電 擊時間為4.6msec。(4)立即加入Iml預冷的IM山梨醇至杯中，將內容物轉移至1.5ml的離心管中。 30°C培養(yǎng)箱放置2小時。(5)分成200ul等份，涂于含博萊霉素的YEPD固體培養(yǎng)基平板上。(6)在30°C孵育平板至克隆產(chǎn)生。實施例3重組酵母工程菌的篩選1.菌落PCR驗證待轉化的YEPD平板上長出單克隆，經(jīng)菌落PCR方法初篩陽性克隆，再以酵母 基因組為模板擴增目的片段并送去測序。最終從200多個轉化子中最終得到了 9個酵母 工程菌的陽性克隆，參見圖3。2.搖瓶發(fā)酵驗證上述酵母工程菌的陽性克隆還需通過搖瓶發(fā)酵實驗進一步驗證類人膠原蛋白的 表達情況。畢赤酵母X-33是增體積發(fā)酵，先利用種子培養(yǎng)基培養(yǎng)種子，然后離心收集菌 體轉接至以甲醇為碳源的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，每隔12小時補加體積比為0.5%的 甲醇進行誘導，發(fā)酵至96小時結束，收集上清液，經(jīng)質量百分比為60%的硫酸銨鹽析沉 淀獲得最終樣品。最后用質量百分比為5%濃縮膠和15%分離膠的SDS-PAGE凝膠電泳 檢測類人膠原蛋白，參見圖4。與對照(含有空白表達載體pPICZa的酵母X-33菌株) 相比，3#菌株在預期蛋白大小處(約12.8KD)有表達條帶。質量百分比為5%濃縮膠和 15%分離膠的配方如表1所示表1 SDS-PAGE 凝膠配方
權利要求
1.一種可用于疫苗穩(wěn)定劑的類人膠原蛋白，其特征在于，由酵母工程菌發(fā)酵獲得， 該酵母工程菌命名為畢赤酵母(Pichia Pastoris) X-33/col CGMCCNo.4187。
2.權利要求1所述酵母工程菌，其特征在于，其染色體上整合一種人工合成的類人膠 原蛋白基因col，其堿基序列如下GAAGCTGGTTTGCCTGGTGCTAAGGGTCTGACTGGTTCTCCTGGTTCTCCCGGA CCCGATGGTAAGACTGGACCCCCAGGACCAGCTGGTCAAGATGGACGTCCTGGACCTCCAGGCCCTCCA GGGGCCCGAGGCCAAGCAGGTGTTATGGGGTTTCCTGGACCAAAGGGAGCAGCCGGCGAGCCAGGTAA AGCCGGCGAAAGGGGTGTCCCAGGACCACCAGGTGCTGTGGGACCAGCCGGCAAAGACGGTGAGGCAGG TGCTCAGGGTCCACCAGGACCTGCTGGTCCTGCTGGAGAAAGATAA 其核酸長度為306bp。
3.一種權利要求1或2所述類人膠原蛋白的生產(chǎn)方法，其特征在于，(1)酵母工程菌的構建根據(jù)已知膠原蛋白氨基酸序列，經(jīng)酵母密碼子偏好性的修飾，最終獲得人工合成類 人膠原蛋白基因col;再將人工合成類人膠原蛋白基因col克隆至酵母表達載體pPICZ α，命名為pPICZa/col ；利用電擊轉化方法將重組質粒pPICZ α /col轉化至酵母細胞X-33 ； 最后利用PCR和測序的方法篩選正確的酵母工程菌；(2)酵母工程菌的搖瓶誘導培養(yǎng)固體培養(yǎng)基YEPD的成分及其每升含量為蛋白胨20克，酵母粉10克，葡萄糖20 克，瓊脂粉15克；固體培養(yǎng)條件將酵母工程菌接種到上述固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，于20°C-5(TC培 養(yǎng)3-5天；種子培養(yǎng)基的成分及其每升含量為蛋白胨20克，酵母粉10克，酵母膽堿YNB13.4 克，甘油10毫升，磷酸鉀緩沖液0.1摩爾，生物素0.4毫克；種子液培養(yǎng)條件用無菌接種環(huán)從上述培養(yǎng)皿中取適量菌體，接種到已滅菌的上述 種子培養(yǎng)基中，20°C-50°C，220rpm搖床培養(yǎng)12-24小時；搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及其每升含量為蛋白胨20克，酵母粉10克，酵母膽堿 YNB13.4克，甲醇10毫升，磷酸鉀緩沖液0.1摩爾，生物素0.4毫克；搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件收獲酵母工程菌的種子液后，離心收集菌體，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng) 基洗劑，按照體積比-30%接種量將酵母工程菌接種到上述搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中， 20 0C -50 °C, 100rpm-300rpm,期間需定期補充甲醇誘導維持體積比的0.5 % -5%的濃 度，搖床培養(yǎng)1-10天；(3)類人膠原蛋白的粗提及驗證酵母工程菌發(fā)酵結束，離心收集發(fā)酵上清液，然后加入質量百分比為60%-100%的硫酸銨或硫酸鈉或氯化鈉進行沉淀濃縮，最后離心收集沉淀，獲得類 人膠原蛋白粗品； 再經(jīng)質量百分比為5%濃縮膠和10% -20%分離膠的SDS-PAGE凝膠檢測。
全文摘要
一種可用于疫苗穩(wěn)定劑的類人膠原蛋白及其生產(chǎn)方法，屬于疫苗穩(wěn)定劑技術領域。由酵母工程菌發(fā)酵獲得，該酵母工程菌命名為畢赤酵母(Pichia Pastoris)X-33/col CGMCC No.4187。生產(chǎn)方法包括人工合成類人膠原蛋白基因；含類人膠原蛋白基因酵母工程菌的構建及篩選；工程菌的搖瓶誘導培養(yǎng)；SDS-PAGE凝膠檢測目的類人膠原蛋白。優(yōu)點在于，利用酵母基因工程菌生產(chǎn)的類人膠原蛋白不僅具有良好的生物學特性，而且與動物來源的產(chǎn)品相比具有無病毒隱患、低排異反應等優(yōu)良特性，故經(jīng)純化后可替代動物來源的膠原蛋白應用于疫苗穩(wěn)定劑。
文檔編號C12R1/84GK102020712SQ20101053968
公開日2011年4月20日 申請日期2010年11月11日 優(yōu)先權日2010年11月11日
發(fā)明者黨磊, 印紅, 龐欣, 王小雪, 王瑋, 齊文武 申請人:北京東方紅航天生物技術股份有限公司