一種藍耳病蛋白工程疫苗的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種豬藍耳病(繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合癥，PRRSV)蛋白工程疫苗的制備與應(yīng)用。所述疫苗以PRRSV主要結(jié)構(gòu)蛋白GP5和次要結(jié)構(gòu)蛋白GP3、GP4的體液和細胞免疫表位作為疫苗框架結(jié)構(gòu)，通過柔性linker連接后再與Thelper表位串聯(lián)，克隆入pRSETB載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)過發(fā)酵、純化、乳化等工藝，獲得具有理想免疫原性的重組藍耳病蛋白工程疫苗。本發(fā)明還涉本發(fā)明還涉及該疫苗的使用方法。動物實驗表明，藍耳病蛋白工程疫苗的攻毒保護力與弱毒苗相當，高于滅活苗，可以產(chǎn)生快速有效的免疫反應(yīng)，預(yù)防豬藍耳病病毒的感染。
【專利說明】一種藍耳病蛋白工程疫苗的制備
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)基因工程領(lǐng)域，主要涉及一種豬藍耳病蛋白工程疫苗制備與應(yīng)用。具體地，利用基因重組技術(shù)，將主要結(jié)構(gòu)蛋白GP3、GP4、GP5抗原表位串聯(lián)并在框架結(jié)構(gòu)中加入Thelper表位,克隆入大腸桿菌載體,轉(zhuǎn)化宿主菌,經(jīng)過發(fā)酵,純化、乳化工藝制備，得到重組藍耳病蛋白工程疫苗以及該疫苗在預(yù)防重大動物疾病豬藍耳病中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]豬生殖和呼吸綜合征(PorcineReporductive and Respiratory Syndrome, PRRS),又稱藍耳病(Blue ear diesase)是由動脈炎病毒科的豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PRRVS)引起的一種新的病毒性傳染病，是一種以導(dǎo)致母豬發(fā)熱、厭食、早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎等繁殖障礙及仔豬高死亡率和育成豬呼吸困難、發(fā)育遲緩為特征的新病。1987年該病首次報道于美國，隨后在北美、歐洲及亞洲各國和地區(qū)迅速蔓延，目前已成為一種地方性流行病(DeaSetal，1991 ;殷震等，1985 ；LoulaT, 1991 ；ShimizuM etal.，1994 ；Lindhausff etal.，1991.)。1996年，我國郭寶清首次分離到病毒(北美型經(jīng)典毒株)，證實我國也存在此病(郭寶清等，1996)，之后我國相繼有20多個省份報道發(fā)生了該病的流行(Tian K G et al.，2007 ;田克恭等2008 ;金寧一，2008)，尤其是2006年下半年來，我國有25個省份發(fā)生了以高致病性豬藍耳病病毒(HP-PRRSV)為主要病原的“豬高熱病”。各地高致病性PRRSV變異株有以下特點:傳播迅速，毒力增強，致病力相似；對中小養(yǎng)殖場和農(nóng)戶危害嚴重；分子特征一致，起源于同一祖先。對全國各地分離的高致病性豬藍耳病病毒毒株，通過完整的ORFS和部分Nsp2基因序列比較分析發(fā)現(xiàn)來自不同豬場的HPPRRSV高度同源，而且在Nsp2基因上都有兩個相同位點的缺失:Nsp2基因的第483位和535-563位氨基酸發(fā)生缺失(童光志等，2007 ;郝曉芳等，2007)。而與2005 年以前的PRRSV的Nsp2同源性僅為69.886.2%。新分離毒株的GP5基因相互之間也是高度同源(98.5% -100.0% )，與以前的PRRSV毒株相比變異也比較大，尤其是兩個潛在的認為與病毒毒力相關(guān)的氨基酸(R13 — Q13and R151 — G151) (Madsenet al.,1998 ；Yang et al.，1998 ；Allende et al.，2000)。目前，對該病尚無有效的治療方法，疫苗免疫雖然能在一定程度上減輕疫情的嚴重情況，仍在疫苗的選用上存在不少問題；藍耳病在我國廣泛的流行給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的損失，因此研制有效控制該病的疫苗是當務(wù)之急。
[0003]更加有效的PRRSV疫苗的開發(fā)存在三個主要問題:⑴對于免疫系統(tǒng)PRRSV可能誘導(dǎo)反相調(diào)節(jié)信號，在結(jié)構(gòu)蛋白中存在極大的抗原變異性，因此，免疫保護并未完全搞清楚。⑵正如(I)所示，PRRSV異源二聚體GP5-M肯定是體液免疫和細胞免疫反應(yīng)的主要誘導(dǎo)蛋白；(3)然而，次要結(jié)構(gòu)蛋白對于PRRSV病毒粒子的感染性也是必要的(Wissink etal.，2005)，也可以起到保護作用，而且誘導(dǎo)T細胞保護反應(yīng)表明其也具有有限的T細胞表位(Mateuand Diaz, 2008)。
[0004]PRRSV包括3個主要結(jié)構(gòu)蛋白GP5 (E)、GP6 (M)和GP7 (N)以及次要結(jié)構(gòu)蛋白GP2、GP3、GP4。研究結(jié)果表明，GP2在病毒中含量少，免疫原性差并且在實際操作中難以分離提純；GP3主要誘導(dǎo)機體細胞免疫；GP4、GP5 (E)和GP6 (M)均可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體，其中GP5有6個抗原決定簇，是誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的主要結(jié)構(gòu)蛋白，病毒中和作用與抗GP5抗體效價呈顯著相關(guān)性((Lopez and Osorio, 2004 ；Tong et al., 2009)，GP5還可誘導(dǎo)細胞凋亡。核衣殼蛋白(N)免疫原性強，但產(chǎn)生的抗體無中和活性，主要用于免疫診斷，是檢測病毒抗體的良好抗原。Yoon等的研究發(fā)現(xiàn)，向豬體內(nèi)被動輸入高滴度中和抗體可以預(yù)防本病(Yoon KJ et al., 1996),而且母豬在輸入高滴度中和抗體后可免于出現(xiàn)繁殖障礙(OsorioFAet al.，2002)。這說明，單體液免疫即可有效預(yù)防PRRSV。豬感染PRRSV后，最7d即可檢測到特異性抗體。在整個感染期問，均能檢測出結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白(尤其是Nsp2)抗體(Meulenberg JJ et al., 1995 ；Nelson EA et al., 1994 ；01eksiewica MB et al., 2002 ；ffuWH et al.，2001)，有關(guān)PRRSV的免疫保護機制還沒有完全闡明，體液免疫和細胞免疫均可發(fā)揮作用。
[0005]GP3蛋白由0RF3編碼的一種高度糖基化蛋白。GP3蛋白共有7個N-糖基化位點，且這些糖基化位點在不同分離株間非常保守(Gonin et al.，1998 ；Katz et al.，1995)。GP3在動脈炎病毒糖蛋白中的位置比較特殊，它的膜拓撲結(jié)構(gòu)還在推測中，而且它在病毒粒子中的結(jié)構(gòu)特征還存在爭議(Hedges et al.，1999 ；ffieringa et al.，2002) XP3 是PRRSV各毒株間保守性最差的蛋白之一，GP3可能與誘導(dǎo)細胞免疫有關(guān)，對豬產(chǎn)生保護作用(Plana-Duranet al.，1997)。GP3在歐美型毒株間推導(dǎo)氨基酸的同源率為54%~60%而且多數(shù)變異發(fā)生在其N末端，但GP3的N端潛在的糖基化位點及疏水性仍是保守的。另外，與LV相比，北美型毒株的GP3中C端的推導(dǎo)氨基酸有12個殘基的缺失。0RF3和0RF4的重疊區(qū)有一疏水的高變區(qū)，即GP4的N端存在這樣一個高變區(qū)。據(jù)報道，LV的這個高變區(qū)含有一個推測的中和位點，其中由9個氨基酸構(gòu)成的基元(59-67)構(gòu)成了此中和位點的核心，此處的突變可造成GP4蛋白的抗原性發(fā)生改變(Meulenberg JJ et al.，1997)。
[0006]基質(zhì)蛋白(M)和GP5糖蛋白是囊膜的主要成分，M和GP5構(gòu)成異二聚體。從歐洲LV株上還分離出囊膜糖蛋白GP3，但是在北美IAF-Klop株的GP3是一種可溶性蛋白且與囊膜結(jié)合能力較弱(Dea, Set al., 2000) 0 GP4蛋白的分子量為31~35KD，有4個糖基化位點，為N-糖基化蛋白，是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一。GP4蛋白有一個可以被單抗中和的抗原決定簇，它位于該蛋白胞外區(qū)第40~79位氨基酸之間。該區(qū)域在不同的PRRSV中高度可變，它可能和免疫選擇相關(guān)。已證實LV病毒的GP4蛋白誘導(dǎo)的抗體具有中和作用(Meulenberget al.，1997)，說明這個蛋白質(zhì)至少有部分暴露在病毒粒了的表面。雖然GP4蛋白具有中和表位，但GP4抗體的出現(xiàn)與血清的中和抗體效價似乎無相關(guān)性(Zhang etal.,1998)。Yoo等(2005)認為GP4在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和介導(dǎo)脂質(zhì)雙層漂移中發(fā)揮作用。Meulenberg等在LV株的0RF4編碼蛋白GP4中鑒定了一個中和區(qū)，表明該蛋白誘導(dǎo)的抗體具有中和作用，但是該表位在北美株和歐洲株之間并不保守。而且，針對GP4的單克隆抗體的中和活性不如GP5的單克隆抗體有效。LV株GP4蛋白的中和域為一親水域，靠近N末端(AA40-79)，在歐美毒株之間是高度變異的。Kwang等同大腸桿菌表達PRRSV北美參考株的0RF4，免疫印跡試驗表明，在美國和加拿大豬場中只有65%的PRRSV陽性血清與該重組GP4發(fā)生反應(yīng)(GoninPetal, 1999 ；Kwang J etal.，1994)。然而，康復(fù)豬血清的病毒中和滴度與抗GP4的抗體無相關(guān)性。Zhang等用昆蟲細胞表達北美毒株VR-2385的GP4蛋白，制備的4株單克隆抗體沒有中和活性，它們都是針對構(gòu)象依賴性表位(Zhang Y etal.，1998)。用抗GP4的中和性單克隆抗體研究表明，GP4蛋白暴露于病毒粒子的表面，可能與病毒、細胞之間的相互作用有關(guān)。
[0007]GP5的生物學(xué)功能非常重要，主要在病毒感染、細胞結(jié)合及病毒吸附中起作用，也是淋巴細胞增生性應(yīng)答的靶點。GP5蛋白含有多個中和表位(Pirzadeh B etal.，1997 ；PirzadehB etal.,1998 ；WeilandE et al.，1999 ；ZhangYetal.，1998)，用重組GP5蛋白制備的單克隆抗體具有中和活性，病毒中和作用與抗GP5抗體效價呈顯著相關(guān)性。針對GP5的單克隆抗體的中和活性比針對其它蛋白如GP4蛋白的單克隆抗體更強(Weiland E et al, 1999)。研究表明，GP5蛋白至少包含兩種類型的中和抗原決定簇，一些為線性決定簇(Pirzadeh B etal.1998)，還有一些為構(gòu)象依賴性決定簇(Weiland E et al.，1999 ；Zhang Y etal.，1998)。人報道稱，無論是自然感染還是實驗感染，M蛋白的抗體卻早于其他蛋白的抗體。由于該蛋白的保守性較好，所以其診斷學(xué)上具有重要意義(MengelingWLet al.,1995)。
[0008]PRRS自發(fā)生以來給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的危害。盡管弱毒疫苗和滅活苗被應(yīng)用于控制病毒感染，但由于其本身內(nèi)在的缺陷使得免疫效果都不十分理想。活疫苗只能保護同源病毒的攻擊，而對異源毒株的保護效果較差(Mengeling W Let al., 2003 ；Meng X J,2000)?；钜呙缰荒芨纳撇糠值呐R床癥狀，而不能預(yù)防感染。另外，活疫苗還可能出現(xiàn)毒力返強的危險(Opriessnig T et al.,2002)。另一方面,滅活苗預(yù)防和控制疾病的效果更差。
[0009]發(fā)明概述
[0010]本發(fā)明根據(jù)不同結(jié)構(gòu)蛋白在病毒感染中的作用，選擇主要結(jié)構(gòu)蛋白GP5和次要結(jié)構(gòu)蛋白GP3、GP4的表位作為疫苗框架結(jié)構(gòu)，通過柔性linker連接后再與Thelper表位串聯(lián)，克隆入PRSETB載 體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)過發(fā)酵、純化、乳化等工藝，獲得具有理想免疫原性的重組藍耳病蛋白工程疫苗。利用本發(fā)明制備的疫苗可以有效預(yù)防豬藍耳病的感染。
[0011]本發(fā)明的目的之一在于提供了一種新的能用于預(yù)防藍耳病的蛋白工程疫苗多肽及其疫苗組合物；本發(fā)明的目的之二在于提供了所述蛋白工程疫苗的構(gòu)建及獲得方法；本發(fā)明的目的之三在于提供了能夠表達所述藍耳病蛋白工程疫苗的基因工程菌株；本發(fā)明的目的之四在于提供了所述藍耳病蛋白工程疫苗的制備方法；本發(fā)明的目的之五在于提供了所述蛋白工程疫苗在預(yù)防藍耳病中的用途。
[0012]在第一方面，本發(fā)明提供了一種用于預(yù)防藍耳病的蛋白工程疫苗多肽及其組合物。其含有對主要的結(jié)構(gòu)蛋白GP5以及次要結(jié)構(gòu)蛋白GP3、GP4篩選得到的抗原表位以及Thelper表位。所述的蛋白工程疫苗蛋白或多肽或藥學(xué)上可接受的鹽以及表達抗原表位所需要的載體。載體也可以包括單獨編碼各抗原表位的序列，串聯(lián)可以通過遺傳工程方法進行。所述疫苗也包括非免疫活性物質(zhì)，即為各多肽的連接部分，不具有抗原表位的免疫原性，也不具有任何佐劑活性，主要有純化標簽、接頭肽、化學(xué)修飾部分、N端信號肽和C端多聚腺苷酸等。所述藥學(xué)上可接受的鹽是指無毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng)，適用于人或動物組織的鹽。非活性物質(zhì)和藥學(xué)上可接受的鹽為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
[0013]在第二方面，本發(fā)明提供了一種核苷酸分子，其編碼本發(fā)明第一方面所述的藍耳病蛋白工程疫苗多肽。本發(fā)明中核苷酸可以是RNA形式，DNA形式，通過人工合成方式合成多抗原表位串聯(lián)序列，然后經(jīng)過基因工程操作連接后克隆入載體，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，篩選、發(fā)酵、純化后獲得藍耳病蛋白工程疫苗多肽。在本發(fā)明中可以對該核酸進行常規(guī)的分子生物學(xué)操作，如:PCR、限制性內(nèi)切酶酶切、連接等，核酸設(shè)計5’端和3’端均加入酶切位點。優(yōu)選本發(fā)明中的核苷酸序列如下:[0014]GCAAAGTTCGTTGCAGCATGGACCCTGAAAGCAGCAGCAATCTCCGAGATCAAGGGTGTCATCGTCCACAAGATCGAGGGGATCGGTTCTGGTATAGGGCATGACCGATGTAGTGAGAACGATCATGACGAACTAGTTCACGACGGGGATAACGCCACCTTGCCTCGCCATGACAATATTGTCTTTCGGACATCAAAACCAACACCACCGCAGCATCAGGGTTCTGGTCCATGTTTCAGTTCGAGCCTTTCGGACATCAAAACCAACACCTCCGCAGCATCAGACTTCGTTGTCCTCCAGGACATCAGCTGCCTTAGGCATGGCGACTCGTCCCCTCCGACGGTTCGCAAAATCCCTCAGTGCCGCTCTGAGATGAGTGAAAAGGGATTCAAAGTGGTGTTCGGCAATGTGTCAGGCATCGTGGCTGTGTGCGTCAACTTTACCAGCTACGTCCAACACGTCAAGGAGTTTACCCAACGCTCCTTAGGTGGTGCCAACCCAAACAACAGCTCTTATTCACAGTTGATTTATAACCTGACACTATGTGAGCTGAATGGCACAGATTGGTTGGTGAAGAATTGCATGTCTTGGCGCTACTCATGTACCAGGTATACTAATTTTCTTTTAGACACCAAAGGCAAAATTTATCGTTGGCGATCACCCGTCATCATAGAGAAAGGGGGAAAAGTTGAGGTCGAGGGCCACCTCATCGACCTCAAGAGAGTTGTGCTTGATGGTTCCGCGGCTATCCCTGTAACCAAAATTTCAGCTGAGCGATGGGGTCATCCC
[0015]在第三方面，本發(fā)明提供了一種載體，其除了含有本發(fā)明第二方面所述的編碼藍耳病蛋白工程疫苗核苷酸分子，還含有與該核苷酸序列可操作的連接，在原核細胞表達(轉(zhuǎn)錄和翻譯)所需的表達控制元件。最基本的表達控制元件包括啟動子、轉(zhuǎn)錄終止子、增強子，選擇性標記等，這些調(diào)控元件為本領(lǐng)域所熟知。在一優(yōu)選實施方案中，所述表達載體為大腸桿菌表達載體。
[0016]在第四方面，本發(fā)明提供了一種宿主細胞，其含有本發(fā)明第三方面所述的載體。宿主細胞經(jīng)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染含有本發(fā)明所述編碼蛋白的基因序列，而后經(jīng)檢測具有良好的的遺傳和表達穩(wěn)定性后，可用于發(fā)酵 表達生產(chǎn)所需的藍耳病蛋白工程疫苗多肽。
[0017]在第五方面，本發(fā)明提供了一種藍耳病蛋白工程疫苗的制備方法，其包括以下步驟:工程菌發(fā)酵表達蛋白工程疫苗多肽，經(jīng)過粗純化與精細純化工藝以及后續(xù)乳化工藝，獲得所需要的重組疫苗。其中涉及的方法包括但不限制于菌體破碎、包涵體洗滌、離心、變性、親和層析、疏水層析、陰離子交換色譜、反相色譜、復(fù)性、乳化等。本發(fā)明中涉及的制備方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
[0018]在第六方面，本發(fā)明提供了一種用于預(yù)防豬藍耳病的重組蛋白工程疫苗，其包括本發(fā)明第一方面所述的多肽以及藥學(xué)上可接受的載體。所述蛋白工程疫苗能夠預(yù)防豬藍耳病的爆發(fā)。本發(fā)明所述的藥學(xué)上可接受的載體為免疫增強劑或免疫佐劑，優(yōu)選免疫佐劑為進口白油佐劑。
[0019]在第七方面，本發(fā)明提供了第六方面所述的重組藍耳病蛋白工程疫苗的應(yīng)用。疫苗可以一定有效劑量肌肉注射，皮內(nèi)或皮下注射或鼻內(nèi)接種注射動物，能夠誘導(dǎo)足夠量的體液及細胞免疫提供抗病毒活性，保護動物免于藍耳病流行毒株的攻擊。此外，在本發(fā)明的實施方案中，通過對疫苗進行靶動物攻毒對比試驗、實驗室安全性試驗等，表明本發(fā)明所述的重組藍耳病蛋白工程疫苗是安全的(見實施例四)，能夠保護動物免受藍耳病病毒感染(見實施例五、六、七、八、九、十)。
[0020]另外，需要指出的是，在本申請的上下文的公開內(nèi)容的基礎(chǔ)上，本發(fā)明的其他具有實質(zhì)性特點的方面對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人來說是顯而易見的。此外，本發(fā)明亦使用了公開文獻，他們的全文內(nèi)容均納入本文進行參考。
【專利附圖】

【附圖說明】[0021]下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的本發(fā)明范圍。圖1重組藍耳病蛋白工程疫苗表達載體pRSETB-PRRSV(GP3/4/5)構(gòu)建圖；圖2pRSETB-PRRSV(GP3/4/5)載體質(zhì)粒酶切圖，其中泳道I為DNAmarker，從上至下分子量依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp，泳道2為質(zhì)粒酶切圖，泳道3為未酶切對照，泳道4為陰性對照；圖3SDS-PAGE檢測圖，其中泳道I為蛋白Marker，從上至下依次為97.2KD、66.4KD、44.3KD、29.0KD、20.1KD、14.3KD，泳道2為未誘導(dǎo)的陰性對照樣品，泳道3為陽性對照，泳道4為誘導(dǎo)的樣品，箭頭所指為表達的目的蛋白檢測圖，其中泳道I為預(yù)染marker，從上至下依次為97KD、66KD、43KD、3IKD、20KD、14KD，泳道2為陽性對照，泳道3為陰性對照，泳道4為目的蛋白。圖5為小鼠血清GP5特異性抗體檢測結(jié)果；圖6為針對PRRSV刺激鼠腎細胞T淋巴細胞增殖反應(yīng)；圖7針對PRRSV刺激仔豬PBMC T淋巴細胞增殖反應(yīng)；圖8為PRRSV中和抗體水平檢測結(jié)果；圖9為病毒特異性(記憶抗原刺激)產(chǎn)生頻率和自發(fā)(背景)IFN Y-SC的平均值；圖10為PBMC自發(fā)產(chǎn)生IL-10的檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0022]實施例中所述的具體試驗方法描述僅是示例性描述，用于詳細闡述本發(fā)明，但并不構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制，依據(jù)本發(fā)明的許多變化為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。
[0023]實施例一大腸桿菌表達載體與表達菌株的構(gòu)建
[0024]將設(shè)計好的多肽編碼核苷酸送上海英俊生物技術(shù)公司合成，核苷酸片段兩端分別設(shè)計了 EcoRI (5’端)和HindIII (3’端)限制性酶切位點，把這片段合成后分別克隆到PMD18T載體上，序列測定證實插入基因片段與設(shè)計序列一致(見序列表)。將重組質(zhì)粒分別命名為pMD18T-PRRSV(GP3 /4/5)。用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶將兩種質(zhì)粒進行酶切處理，大腸桿菌表達載體選用Invitrogen公司的pRSETB質(zhì)粒,也使用相同的限制性內(nèi)切酶處理,酶切條件:10μ I反應(yīng) 體系，體系內(nèi)加入2 μ I質(zhì)粒，限制性內(nèi)切酶為5個活性單位(NewEngland biolabs)，加入IOX緩沖液I μ 1，去離子水補齊，37°C酶切90min。酶切結(jié)束后加入I μ 1200mM EDTA終止反應(yīng)。在I %瓊脂糖凝膠電泳中，電泳30分鐘。紫外燈下將2.88kbpRSETB質(zhì)粒和796bp PRRSV (GP3 /4/5)片段切下，按照Qiagen公司凝膠回收試劑盒說明書進行膠回收。按照載體:片段=1: 2-3的比例將多表位核苷酸片段單獨和表達載體混合，反應(yīng)體系15 μ 1，由T4DNA連接酶進行連接，16°C連接過夜，獲得重組質(zhì)粒分別命名為pRSETB-PRRSV(GP3 /4/5)，(見圖1)，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌 BL21 (DE3)pLysS。
[0025]轉(zhuǎn)化:將pRSETB-PRRSV (GP3 /4/5)置冰上融化，加入2 μ I鏈接反應(yīng)液，再次混勻，冰水浴30分鐘，42°C 30秒，然后迅速放回冰浴1.5分鐘，加入1ml LB培養(yǎng)液，37°C，靜置培養(yǎng)I小時，4000g低溫離心10秒鐘棄上清，用200 μ ILB培養(yǎng)基重懸菌體；將菌液均勻涂布于含有100 μ g / mL氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)板上，倒置于37°C恒溫箱中培養(yǎng)12-16小時，直至克隆形成。
[0026]鑒定:挑取平板上的單克隆至LB培養(yǎng)基中，37°C，180rpm震蕩培養(yǎng)12小時，提取質(zhì)粒，分別使用內(nèi)切酶EcoRI和Hindi 11進行雙酶切，可以切出相應(yīng)藍耳病疫苗基因大小片段的克隆為SOObp左右，可初步確定為陽性克隆(見圖2);陽性克隆進行DNA序列測定進一步驗證其正確性(見序列表)。
[0027]誘導(dǎo)表達。即將陽性克隆過夜培養(yǎng)，次日早上按1: 100轉(zhuǎn)接，培養(yǎng)3小時后，加入0.5mM IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)3小時，制備樣品；常規(guī)SDS-PAGE檢測目的蛋白表達情況——在33.8KD(見圖3)，見到特異性條帶為正確克?。蝗≌_克隆，放大培養(yǎng)，SDS-PAGE證實表達正確后，使用常規(guī)Western-blot進一步證實其表達準確性(見圖4);經(jīng)過上述構(gòu)建及鑒定程序后，可將挑選的陽性克隆作為工程菌進行原始種子庫的建立，菌種命名pRSETB-PRRSV(GP3 / 4 / 5) / BL21(DE3，Plys)。
[0028]實施例二工程菌的發(fā)酵、純化與乳化
[0029]發(fā)酵取生產(chǎn)菌種，接種于2ml LB液體培養(yǎng)基中(含100 μ g/ml氨芐青霉素)，37°C，180rpm振蕩培養(yǎng)12小時活化菌種。再以1: 100的接種量接入搖瓶，37 °C振蕩培養(yǎng)至0D600=3，可按10%比例接種入發(fā)酵罐。發(fā)酵用培養(yǎng)基為半合成培養(yǎng)基，用蒸餾水配制，其中不含有任何抗生素。校正溶氧和PH值電極，開啟罐體攪拌，轉(zhuǎn)數(shù)為300rpm，罐體在線滅菌，待罐內(nèi)培養(yǎng)液溫度降至37.(TC時，標定pH及溶氧(OD)零點。發(fā)酵溫度為37.0 ± 0.1°C，溶氧控制在20%左右，pH控制在7.0，接種后培養(yǎng)菌體0D600=1.0~1.2時流加補料500ml，補料后I小時加入IPTG (終濃度為0.5mM)誘導(dǎo)表達，連續(xù)誘導(dǎo)6個小時后發(fā)酵結(jié)束，取樣做SDS-PAGE檢定表達情況。
[0030]純化將收集到的菌體，用包含體洗液(1% Triton X-100，20mMTris_cl PH8.0)混懸后進行超聲，2000W超聲裂解I小時，4°C，12000rpm離心收集包含體，用4M鹽酸胍，0.2%β -ME, 20mM Tris-cl (pH=8.00)混勻，室溫攪拌4小時,8000rpm低溫離心30min,棄去沉淀。變性蛋白1: 100稀釋，復(fù)性液用Tris (PH8.0)緩沖體系，加入0.3M精氨酸，4°C攪拌復(fù)性24小時。復(fù)性液用pH=8.0的20mM磷酸緩沖液，0.5M氯化鈉，20mM咪唑，平衡上親和層析柱，用pH=8.0的20mM磷酸緩沖液，0.5M氯化鈉，0.5M咪唑洗脫；即得重組藍耳病蛋白工程疫苗半成品原液。做SDS-PAGE以及Western blot印記檢定純化產(chǎn)物是否為目標蛋白。
[0031]乳化將純化的半成品用滅菌的PBS稀釋至200μ8 / ml。取進口白礦物油佐劑DU0PRME(醫(yī)藥級)經(jīng)121 °C，滅菌15分鐘，備用。按油相:水相=50: 50的比例配制，先將油相加入乳化缸內(nèi)，開動攪拌機以80-100r / min的速度緩慢攪拌，緩緩加入水相，加完后再攪拌2min,然后以5500r / min高速循環(huán)乳化9min,制成油包水單相疫苗。
[0032]實施例三重組藍耳病蛋白工程疫苗安全性試驗
[0033]I 材料
[0034]1.1疫苗:由寶麥德生物研發(fā)中心提供，批號為20120611、20120612、20120613。
[0035]1.2試驗動物:18_22gBalb / C小白鼠購自北京華阜康。30日齡健康三元雜交仔豬由廣東永順制藥提供。
[0036]2 方法
[0037]2.1疫苗對小白鼠的安全性
[0038]皮下注射18_22gBalb / C小白鼠，每只注射0.5ml，每批疫苗注射5只，共三個批次，注射15只小白鼠，同時設(shè)定2只陰性對照，連續(xù)觀察10天，觀測小白鼠的健康狀況。
[0039]2.2疫苗對仔豬的安全性
[0040]選擇30日齡健康三元雜交仔豬，每頭耳后肌肉注射重組藍耳病蛋白工程疫苗，每批次5頭，共三個批次，注射15頭仔豬，同時設(shè)立陰性對照2頭，每頭注射生理鹽水乳化液2ml,臨床觀察1 4天。
[0041]3 結(jié)果[0042]3.1疫苗對小白鼠的安全性試驗
[0043]結(jié)果如表1，免疫后，所有小鼠的食欲、精神和健康狀況無異常，與對照組一致，無死亡發(fā)生，可見重組藍耳病蛋白工程疫苗對小白鼠是安全的，見表1。
[0044]表1疫苗對小白鼠的安全性試驗結(jié)果
[0045]
【權(quán)利要求】
1.一種藍耳病蛋白工程疫苗融合蛋白，其氨基酸序列為SEQ IDN0.2。
2.—種核酸分子，其編碼權(quán)利要求1項所述融合蛋白。
3.—種載體,其含有權(quán)利要求2所述的核酸分子。
4.一種宿主細胞,其含有權(quán)利要求3所述的載體。
5.權(quán)利要求2所述的核酸分子，其具體序列如下:
gcaaagttcgttgcagcatggaccctgaaagcagcagcaatctccgagatcaagggtgtcarcgtccacaagatcgaggggatcggttctggtatagggcatgaccgatgtagtgagaacgatcatgacgaactagttcacgacggggataacgccaccttgcctcgccatgacaatattgtctttcggacatcaaaaccaacaccaccgcagcatcagggttctggtccatgtttcagttcgagcctttcggacatcaaaaccaacacctccgcagcatcagacttcgttgtcctccaggacatcagctgccttaggcatggcgactcgtcccctccgacggttcgcaaaatccctcagtgccgctctgagatgagtgaaaagggattcaaagtggtgttcggcaatgtgtcaggcatcgtggctgtgtgcgtcaactttaccagctacgtccaacacgtcaaggagtttacccaacgctccttaggtggtgccaacccaaacaacagctcttattcacagttgatttataacctgacactatgtgagctgaatggcacagattggttggtgaagaattgcatgtcttggcgctactcatgtaccaggtatactaattttcttttagacaccaaaggcaaaatttatcgttggcgatcacccgtcatcatagagaaagggggaaaagttgaggtcgagggccacctcatcgacctcaagagagttgtgcttgatggttccgcggctatccctgtaaccaaaatttcagctgagcgatggggtcatccc
6.一種用于預(yù)防高致病性藍耳病的疫苗，其包含權(quán)利要求1所述的融合蛋白以及藥學(xué)上可接受的載體。
7.權(quán)利要求1所述的 融合蛋白在制備重組藍耳病蛋白工程疫苗中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P31/14GK103992408SQ201410118926
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年3月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月24日
【發(fā)明者】李殿明, 蒲勤, 李毅, 齊春梅, 田春輝, 任百亮, 張導(dǎo)春, 劉甜甜, 顧富香 申請人:青島寶麥德生物醫(yī)藥科技有限公司