生產(chǎn)脂質(zhì)和抗氧化劑的真核微生物的制作方法

專利名稱：：生產(chǎn)脂質(zhì)和抗氧化劑的真核微生物的制作方法生產(chǎn)脂質(zhì)和抗氧化劑的真核微生物本申請要求以2005年6月7日提交的美國臨時申請No.60/688,207和2005年12月16日提交的美國臨時申請No.60/751，401作為優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)，這兩份美國臨時申請的全文通過援引的方式納入本文。
背景技術(shù)：
：大量科學(xué)證據(jù)表明，(n-3)高度不飽和脂肪酸例如二十二碳六烯酸(DHA)對心血管疾病、慢性炎癥和腦障礙有積極作用。另一方面，(n-6)脂肪酸被認為是二十酸類固醇例如前列腺素、白三烯等的中間代謝產(chǎn)物。目前，這些高度不飽和脂肪酸的主要來源是魚，已注意到多種深藍色魚類(例如沙丁魚和金槍魚)體內(nèi)的DHA和二十碳五烯酸(EPA)的量分別為約20%和10%。然而，若要使用魚油作為這些脂質(zhì)的唯一來源尚存在一些缺點，例如串味、不能穩(wěn)定利用、天然魚油含量存在差異以及可能累積有害環(huán)境的污染物等問題。另外，若想從這些來源獲得高度純化的(n-3)或(n-6)油，優(yōu)先的分離和純化會非常困難。
發(fā)明內(nèi)容所7>開的是涉及真核生物》皮嚢壺菌目(thraustochytriales)和破嚢壺菌科(Thraustochytriaceae)的組合物和方法，所述真核生物在培養(yǎng)時可產(chǎn)生大量不飽和脂肪酸例如co3(n-3)和/或co6(n-6)油，如DHA、EPA和DPA,由于所有這些組合物可被使用，并且由于其生產(chǎn)方式，它們均能被純化和使用。被納入并構(gòu)成本說明書的一部分的附圖闡述了幾個實施方案，并與說明書一起對所公開的組合物和方法進行了闡述。圖1示出給出對來源于0NC-T18的脂質(zhì)進行脂肪酸曱基化獲得的結(jié)果的圖。圖2以圖表方式描述了在AdvocateHarbor收集到的ONC-T18原始分離林和以編號PTA-6245保藏于ATCC的0NC-T18破嚢壺菌屬種(r力rwi^ocA^r/咖M.)的分離林之間脂肪酸曱酯的比較情況。所有的峰均通過氣相色譜和質(zhì)譜來鑒定。圖3示出進行0NC-T18生物量最優(yōu)化實驗得到的結(jié)果的散點圖。這些實驗使用被稱為Taguchi法的技術(shù)，目的是確定在不同培養(yǎng)基條件下ONC-T18的最佳生長條件。圖4示出在最佳條件(實施例4)下生長九天的ONC-T18的脂肪酸生產(chǎn)情況的柱狀圖。圖5示出如在本文其它地方所述分離得到的產(chǎn)油微生物的圖。圖6示出0NC-T18和其它破嚢壺菌目的18SrRM基因之間的關(guān)系的分枝系統(tǒng)樹。圖7示出在不同條件下0NC-T18的脂質(zhì)和DHA生產(chǎn)情況。圖8示出由關(guān)于本文公開真核生物的生長條件的信息進行改進的圖(對Ratledge，C.(2004)，LipidTechnol.16:34-39的方法進4亍改進)。圖9示出所公開的真核生物產(chǎn)生PUFA的推定代謝途徑。圖10示出在各種備選的低成本碳源的情況下脂肪酸最大產(chǎn)率和組分的比較情況。圖11示出對收集到的分離林基于其C20和C22PUFA生產(chǎn)情況的分組。結(jié)果與兩個參照菌林ATCC20891和MYA-1381相比較。圖12示出菌林0NC-T18的18SrRNA鄰接樹(Neighbour-joiningtree)。橫線代表遺傳距離，而方括號給出在該系統(tǒng)樹中使用的來源于GenBank的序歹'J。圖13給出在以下3類不同發(fā)酵環(huán)境下于含有2gL^酵母提取物、8g1^L-谷氨酰胺、6gf海鹽和60gC葡萄糖的培養(yǎng)基中生長的ONC-T18的脂肪酸生產(chǎn)情況瓊脂板(1.5%瓊脂，251C，27天)、燒瓶(250ml燒瓶中裝有50ml，120RPM，25°C,3天)和5L生物反應(yīng)器(4lpm空氣，p0290%，25°C,3天)。圖14給出自破嚢壺菌屬種0NC-T18分離得到的類胡蘿卜素化合物的HPLC色譜圖。例如自破嚢壺菌屬種0NC-T18中分離出奸青素、玉米黃素、角黃素、海膽酮和P-胡蘿卜素。圖15示出在裝有培養(yǎng)基的5L生物反應(yīng)器中維持168h的破嚢壺菌屬種0NC-T18的典型生物量、總脂肪酸(TFA)、DHA生產(chǎn)情況和葡萄糖利用情況，所述培養(yǎng)基含有60gL^葡萄糖、2gL—t酵母提取物、8gL—'谷氨酸和6g1^鹽(4lpm空氣、p0290°/。、25°C，pH7-9)。圖16給出破嚢壺菌屬種0NC-T18中奸青素形成所涉及的推定途徑。具體實施例方式在對本發(fā)明的化合物、組合物、物品、裝置和/或方法進行公開和描述之前，應(yīng)理解的是，除非另外指明，它們不限于特定合成方法或特定重組生物技術(shù)方法，或者除非另外指明，它們不限于具體的試劑，因此理所當(dāng)然可有所改變。還應(yīng)理解的是，本文所使用術(shù)語其目的僅在于對具體實施方案進行描述，而無意于限定。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會認識到或能確定不僅可以使用常規(guī)實驗，也可使用本文所描述方法和組合物的特定實施方案的多種等價方案。這些等價方案旨在嚢括于下面的權(quán)利要求中。A.定義除非上下文明確指出相反，說明書和所附權(quán)利要求書中所使用的單數(shù)形式"一個"、"一種"和"該"包括復(fù)數(shù)指代對象。因此，例如，"一種藥物載體，，包括兩種或多種這類載體的混合物等。本文中范圍可以表示為從"大約，，一個具體的數(shù)值，和/或至"大約，，另一個具體的數(shù)值。當(dāng)表示為這種范圍時，另一個實施方案包括從所述一個具體數(shù)值和/或至所述另一個具體數(shù)值。類似地，當(dāng)通過在前面使用"大約"將數(shù)值表示為近似值時，應(yīng)當(dāng)理解的是，該具體的數(shù)值構(gòu)成另一個實施方案。應(yīng)當(dāng)進一步理解的是，每個范圍的端點在與另一個端點相關(guān)和獨立于另一個端點時都是有意義的。還應(yīng)當(dāng)理解的是此處公開了許多數(shù)值，且除了數(shù)值本身外每一個數(shù)值在此還以"大約"該具體數(shù)值公開。例如，如果公開了數(shù)值"10"，那么也公開了"大約10"。還應(yīng)當(dāng)理解的是，當(dāng)公開了一個數(shù)值時，也公開了"小于或等于該數(shù)值，，，"大于或等于該數(shù)值"以及數(shù)值間可能的范圍，這正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所恰當(dāng)理解的。例如，如果公開了數(shù)值"10"，也公開了"小于或等于10"以及"大于或等于10"。還應(yīng)理解，在整個本申請中，以多種不同格式提供數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)代表了端點和起點，以及這些數(shù)據(jù)點任何組合的范圍。例如，如果公開了特定數(shù)據(jù)點"10"和特定數(shù)據(jù)點"15",應(yīng)該理解，大于、大于或等于、小于、小于或等于、等于10和15，以及10和15之間的數(shù)值也認為已經(jīng)被公開。還應(yīng)理解的是，兩個具體單位之間的每個單位也被公開。例如，若公開了10和15,那么也公開了11、12、13和14。"降低，，或其它形式的降低指的是減少某一事件或特征。應(yīng)理解的是，這通常與某些標準或預(yù)期數(shù)值相關(guān)，換言之它是相對而言的，但是并不是待指代的標準或相關(guān)數(shù)值通常所必須的。例如，"降低磷酸化作用"指的是相對于標準或?qū)φ諟p少所發(fā)生的磷酸化的量。應(yīng)理解的是，除非特別指明相反，否則某一化合物或組合物或病癥可相對于另一化合物或組合物或病癥有所降低。"抑制"或其它形式的抑制意味著阻止或限制某一具體特征。應(yīng)理解的是，這通常與某些標準或預(yù)期數(shù)值相關(guān)，換言之它是相對而言的，但是它并非待指代的標準或相關(guān)數(shù)值通常所必須的。例如"抑制磷酸化作用，，指的是相對于標準或?qū)φ兆柚够蛳拗扑l(fā)生的磷酸化的量。應(yīng)理解的是，否非特別指明相反，否則某一化合物或組合物或病癥可相對于另一化合物或組合物或病癥被抑制。"阻止，，或其它形式的阻止指的是終止某一具體特征或病癥。由于阻止通常比例如降低或抑制更為絕對，因此它并不需要與對照進行比較。本文所使用的某些事物可被降低但不能被抑制或阻止，但是可被降低的某些事物也可被抑制或阻止。可以理解的是，使用降低、抑制或阻止時，若未明確指明相反，另外兩個單詞的使用也被特別公開。因此，若公開了抑制磷酸化作用，則也公開了降低和阻止磷酸化作用。術(shù)語"治療有效"指的是所使用組合物的量是足以改善某一疾病或障礙的一個或多個病因或癥狀的量。這種改善僅需降低或改變，而不必消除。術(shù)語"載體"指的是，就使用意圖或目的而言，在與某一化合物或組合物混合時，有助于所述化合物或組合物的制備、儲存、給藥、送遞、有效性、選擇性或任何其它特征或?qū)ζ溆袔椭幕衔铩⒔M合物、物質(zhì)或結(jié)構(gòu)。例如，可對載體進行選擇，以將活性成分的任何降解減少到最小并將對于受試者的任何不良副作用減少到最小。在本說明書的整篇描述和權(quán)利要求書中，單詞"包括，，以及該單詞的變化形式如"包含"和"含有"指的是"包括但不限于"，無意于排除例如其它添加劑、組分、整數(shù)或步驟。本文所使用的術(shù)語"細胞"還指各個微生物細胞或來源于該細胞的培養(yǎng)物。"培養(yǎng)物"指的是包含相同或不同類型分離細胞的組合物。術(shù)語"代謝產(chǎn)物，，指的是在將某一化合物引入生物環(huán)境例如患者內(nèi)時產(chǎn)生的活性衍生物。在談及藥物組合物和營養(yǎng)組合物時，所使用的術(shù)語"穩(wěn)定"在本領(lǐng)域通常被理解為在特定儲存條件下于指定時期內(nèi)活性成分的損失少于某一特定量，該量通常為10%。組合物被認為穩(wěn)定所要求的時間是與每種產(chǎn)品的用途相關(guān)的，并由生產(chǎn)該產(chǎn)品、對其進行質(zhì)量控制和檢查、將其輸送給批發(fā)商或直接輸送給消費者(此時在其最終使用之前再次進行保藏)的商業(yè)實踐規(guī)定。包括幾個月時間的安全系數(shù)在內(nèi)，藥物的最短產(chǎn)品壽命通常為一年，優(yōu)選18個月以上。本文所使用的術(shù)語"穩(wěn)定"參照了在容易實現(xiàn)的環(huán)境條件(例如2'C至8t:的冷藏條件)下儲存和運輸該產(chǎn)品的那些市場真實情況和能力。說明書和文末的權(quán)利要求書中所提及的某一組合物或物品中某一具體元件或組分的重量份表示表示為重量份的所述組合物或物品中該元件或組分與任何其它元件或組分之間的重量關(guān)系。因此，在含有2重量份組分X和5重量份組分Y的化合物中，所存在的X和Y的重量比為2:5，并且不管該化合物中是否還含有其它組分，X和Y均以該比率存在。除非明確指出相反，否則某一組分的重量百分比以含有該組分的制劑或組合物的總量為基礎(chǔ)。"分離的"和任何形式例如"分離"指的是某物處于可被操作或被進一步純化形式的情形。"分離的"及其各種同義形式指的是某物當(dāng)前所處的狀態(tài)不同于之前所處的狀態(tài)。例如，若核糖體RNA分子從生物體取出、合成或通過重組方式產(chǎn)生，則它是"分離的"。通常，某一事物的"分離"是相對于其它某物的分離。例如，如本文所述可通過如下方式分離本文述及的真核生物例如通過培養(yǎng)真核生物，從而使得該真核生物在不存在可測量(可檢測)量的其它生物體的情況下存活?？梢岳斫獾氖?，除非特別指明相反，任何所公開的組合物可如本文所公開的那樣分離。"純化"和任何形式例如"純化的"指的是某一物質(zhì)或化合物或組合物所處狀態(tài)的同質(zhì)性比之前更高的狀態(tài)。可以理解的是，如本文所公開的那樣，除非另外指明，某物的純度可為至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7°/、8%、9°/、10%、11°/。、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23/24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、歌41%、42%45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%84%、85/"86%、87%、88%、89°/。、90%、91%、92%、93%、94%97%、98%、99%或100%。例如，若某一指定組合物A的純度為90%，則這意味著該組合物的90%為A，而該組合物的10%為一種或多種事物，例如分子、化合物或其它物質(zhì)。例如，若所公開真核微生物例如產(chǎn)生35%DHA，則這可被進一步"純化"，從而使得最終的脂質(zhì)組合物具有90%以上的DHA。除非另外指明，否則純度可由該組合物中組分的相對"重量"確定?？梢岳斫獾氖?，除非特別指明相反，否則任一所公開組合物可如所公開的那樣純化。"任選的"或"任選地"指的是隨后描述的事件或情況出現(xiàn)與否均可，并且該敘述包括其中所述事件或情況出現(xiàn)的情形及其不出現(xiàn)的情形。"引物"為一小類這樣的探針它們能支持某類酶操作，并且可與靶核酸雜交，從而使酶操作能夠發(fā)生。引物可由不干擾酶操作、本領(lǐng)域可獲得的核酸或核酸衍生物或類似物的任一組合制備。這份申請中引用了多篇出版物。這些出版物的公開內(nèi)容通過援引全文納入本申請中，目的在于更為全面地描述其所屬的現(xiàn)有技術(shù)。所公開參考文獻還通過援引就其中含有的內(nèi)容分別地和特別地納入本文，所述內(nèi)容在該參考文獻所依附的句子中進行了闡述。公開了可用于制備所公開組合物的組分，以及可在所公開方法中使用的組合物自身。在本文中公開了這些物質(zhì)和其他物質(zhì)，并且可以理解的是，在公開這些物質(zhì)的組合、子集、相互作用和群組等時，盡管這些化合物的每種不同的各個和全部的組合和排列可能并未明確地公開，但每種都在此被特別地考慮和描述。例如，如果公開和討論了破嚢壺菌科某一具體的種，、43%、44%、、56%、57°/"、69%、70%、、82%、83%、、95%、96%、并且討論了對包括破嚢壺菌科種在內(nèi)的生物體所進行的多種4多飾，那么除非特別指明相反，否則破嚢壺菌科的這些種和可能的修飾的每種和各種組合和排列均得到特別地考慮。因此，如果公開了一類分子A、B和C,并且還公開了一類分子D、E和F,同時公開了組合分子A-D的實例，則即使沒有每個逐一列舉，每個也單獨和共同被認為是有意義的組合，A-E，A-F，B-D,B-E，B-F,C-D，C-E以及C-F被認為/>開。同樣，這些的任何子集或組合也被公開。因此，例如，A-E、B-F和C-E的子群也被公開。將這一概念適用于本申請的所有方面，包括但不限于制備和應(yīng)用所^HH且合物的方法中的步驟。因此，如果有多個其他步驟可以實施，應(yīng)當(dāng)理解的是，所述其他步驟的每一步都可以與所公開方法的任何具體實施方案或?qū)嵤┓桨傅慕M合一起來進行。B.組合物公開了真核微生物破嚢壺菌目，優(yōu)選具有產(chǎn)生脂質(zhì)的能力的破嚢壺菌屬種或裂殖壺菌屬(Sc力/zocAr"/咖)種，所述脂質(zhì)例如脂肪酸，例如不飽和脂肪酸，如co-3脂肪酸，如co-6脂肪酸和co-9脂肪酸，如(n-3)系列的二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)、(n-6)系列的二十二碳五烯酸(DPA)和(n-9)系列的棕櫚酸和硬脂酸。所公開的真核微生物還可產(chǎn)生抗氧化劑，例如但不限于類胡蘿卜素化合物胡蘿卜素(例如P-胡蘿卜素)和葉黃素化合物蝦青素、玉米黃素、角黃素和海膽酮。還公開了真核微生物的分離和生長條件。例如，同時分別和共同公開了產(chǎn)生所公開脂質(zhì)和抗氧化劑的異養(yǎng)生長條件。因此，通過使用這種獨特的真核生物，能有效產(chǎn)生(n-3)系列的DHA和/或(n-6)系列的DPA和/或類胡蘿卜素系列的抗氧化劑化合物和/或葉黃素系列的抗氧化劑化合物，它們可用作或用于營養(yǎng)制品、食品添加劑、藥物或工業(yè)加工。公開了含有真核微生物的組合物，所述真核微生物包括破嚢壺菌屬種(本文公開的一個實例是0NC-Tl8菌林，其ATCC保藏編號為PTA-6245)或由其組成?？梢岳斫獾氖牵€公開了表述為ONC-T18的真核微生物以及自所述生物體分離的任何克隆、經(jīng)修飾生物體或基因。所公開的生物體具有產(chǎn)生不飽和脂肪酸(如含有(o-3系列的DHA和EPA以及(o-6系列的DPA的脂質(zhì))和各種抗氧化劑(如類胡蘿卜素、葉黃素和酚類物質(zhì))的能力。還公開了產(chǎn)生含所述化合物的生物量的方法。進一步公開了利用真核微生物來制備co-3、co-6和類胡蘿卜素化合物的方法。還公開了生產(chǎn)微生物來源(或單細胞來源)的油的方法。另外，公開了由所公開真核微生物和任何子代(經(jīng)遺傳修飾或以其它方式修飾)所產(chǎn)生的脂肪酸和類胡蘿卜素，補充有脂質(zhì)和抗氧化劑的各種伺料、營養(yǎng)制品、藥物和食品，以及將這些化合物用作各種祠料和食品的添加劑的方法。授權(quán)給Barclay的美國專利No.5，130，242公開了一種收集和篩選方法，以分離產(chǎn)生co-3脂肪酸并具有如下特征的微生物菌林l)能異養(yǎng)生長；2)產(chǎn)生高含量co-3脂肪酸；3)單細胞的；4)產(chǎn)生低含量標準的和co-6脂肪酸；5)無著色的白色或無色的細胞；6)耐熱的(如在30。C以上生長的能力)；和7)具有廣耐鹽性(如在較寬范圍鹽度但優(yōu)選在低鹽度下生長的能力)。該'242專利的公開內(nèi)容還描述了異養(yǎng)生產(chǎn)具有高濃度co-3脂肪酸的全細胞或經(jīng)提取的微生物產(chǎn)物的方法，所述全細胞或微生物產(chǎn)物隨后可用于動物食品或者人食品。該方法使用了通過該專利公開的收集和篩選方法鑒定的微生物。這些微生物為破嚢壺菌目，在磨碎的谷物中培養(yǎng)。為提高co-3脂肪酸的產(chǎn)生，使用低溫脅迫(stressing)和高溶解氧，同時添加抗氧化劑、生長因子、維生素和磷。提取得到的產(chǎn)物含有高濃度的(o-3脂肪酸(如C20:5w3、C22:5w3和C22:6w3)和^f氐濃度的co-6脂肪酸(如C20:4w6和C22:5w6)。具體而言，C20:5w3與C22:6w3脂肪酸的比率為1:1至1:30。C22:5w3與C22:6w3脂肪酸的比率為1:12至最低僅為痕量的C22:5w3。同樣，該微生物產(chǎn)生以重量計占總脂肪酸的0.6至0.72%的DHA、0至5%的DPA和0至18.9%的EPA。Barclay的美國專利No.6,451,567公開了在含有鈉鹽(如為乾酸鈉)的無氯培養(yǎng)基(〈3g/L)中培養(yǎng)破嚢壺菌和裂殖壺菌的方法。該無氯培養(yǎng)基所得到的細胞團大小小于150nm。所公開方法可生產(chǎn)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖用食品的微生物和提取物。該食品的其它組分包括亞麻籽、油菜籽、大豆和鱘梨粉。該微生物每天可產(chǎn)生的co-3脂肪酸為1.08g/L培養(yǎng)基。該'567的公開內(nèi)容進一步描述了各種培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包括海水、葡萄糖(l、3、5或10g/L)、酵母提取物(O.01、0.2、0.4和5g/L)、其它氮源(例如蛋白水解產(chǎn)物(lg/L)、肝臟提取物(lg/L)、谷氨酸(5g/L)、MSG(3g/L))和其它鹽、痕量維生素和礦物質(zhì)(如KH2P0"MgS04和明膠提取物)。Yokochi等人的美國專利No.6,582,9417>開了裂殖壺菌屬種菌林SR21和屬于同一個種的另一裂殖壺菌菌林，所述種具有產(chǎn)生含高濃度co-3DHA和/或co-6DPA和低濃度EPA的脂肪酸組分的能力。同時，公開了培養(yǎng)這類微生物和分離這類脂肪酸的方法。所使用的培養(yǎng)基含有海鹽、酵母提取物(O.2、1.O或IOg/L)、玉米漿(O.5、1.O或IOg/L)、葡萄糖(10-120g/L)和其它鹽(例如NH40Ac、磷酸鹽)。該脂肪酸組合物含有的DHA以重量計占生物量的約15至20%(以重量計占總脂肪酸的約28°/。)。該組合物可用于食品(如嬰兒奶粉)中。Bailey等人的美國專利No.6，607，900公開了培養(yǎng)真核微生物(如裂殖壺菌菌種ATCCNo.20888)的方法，所述真核微生物能產(chǎn)生的多不飽和脂質(zhì)(尤其是co-3和-6脂肪酸)占其生物量的至少20%。該方法包括在含碳源和氮源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)該微生物。還公開了使用低溶解氧水平(小于3%)和低氯離子水平(小于3g/L)來提高產(chǎn)率。該微生物具有的脂質(zhì)產(chǎn)率為至少0.5g/L/h。脂質(zhì)組分的DHA以重量計占生物量的15%至20%(以重量計占總脂肪酸曱酯的約35%)。Komazawa等人的美國專利申請公開文本No.2004/0161831公開了具有產(chǎn)生DHA的能力的破嚢壺菌菌林(LEF1，ATCCNo.FERMBP-08568)。通過在常規(guī)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該微生物可產(chǎn)生具有以重量計至少50%DHA的油脂。該油脂可由脂肪酶處理，然后分離DHA。該油脂可用于食品或飲品中，或者可水解DHA來產(chǎn)生山酸。1.脂肪酸脂肪酸是以末端帶有羧基基團的烴鏈，如果它們含有至少一個碳碳雙鍵，則被稱為不飽和的，而在它們含有多個這樣的雙鍵時則被稱為多不飽和的。由于這些雙鍵的位置，長鏈多不飽和脂肪酸(PUFA)或高度不飽和脂肪酸(HUFA)可被分為(n-3)和(n-6)系列。大量科學(xué)證據(jù)表明，(n-3)高度不飽和脂肪酸例如DHA對心血管疾病、慢性炎癥和腦障礙有積極作用。另一方面，(n-6)脂肪酸被認為是二十酸類固醇例如前列腺素、白三烯等的中間代謝產(chǎn)物。多不飽和脂肪酸可包含l、2、3、4、5、6、7、8、9或10個碳碳雙鍵和/或碳碳三鍵。例如，多不飽和脂肪酸可包含3-8、4-7或5-6個碳碳雙鍵和/或碳碳三鍵。目前，這些高度不飽和脂肪酸的主要來源是魚，已注意到多種深藍色魚類(例如沙丁魚和金槍魚)體內(nèi)的DHA和EPA的量分別為約20%和10%。然而，若要使用魚油作為這些脂質(zhì)的唯一來源尚存在一些缺點，例如串味、在利用度方面存在不可控的波動、天然魚油含量存在差異以及可能累積有害環(huán)境污染物等問題。另外，若想從所述來源獲得高度純化的(n-3)或(n-6)油，優(yōu)先地分離和純化非常困難。具體而言，新出現(xiàn)的高濃度形式DHA在新生兒補品市場上有很好的前景。若魚油為所述產(chǎn)品的來源，那么不得不優(yōu)先地從EPA中大量分離DHA。很顯然的是，需要高度純化的其它來源和生產(chǎn)特定的這些高度不飽和脂肪酸的來源。除了魚油之外，各種微生物(主要是海產(chǎn)的)能產(chǎn)生和/或積累(n-3)系列的二十二碳六烯酸。特別有意義的是這樣一個事實微生物生產(chǎn)不會受制于由外界變化例如季節(jié)、溫度和食品供應(yīng)等引起的波動。例如，已知以下微生物具有產(chǎn)生DHA的能力來自深海的細菌海產(chǎn)弧菌(r/^/o鵬W/7ZA9)(ATCC15381)、弧菌種(f76r/ow，.)T3615、深海細菌(戶力o/o&c/eW咖/ro/7//7￡fefl7)SS9、海洋被孢霉Gl/or〃ere/7a鵬y/"a)MP-1和A/c力ro邁o/7^h/ioae^TCCBAA-363T);微藻種例如寇氏隱曱藻(Cr//^^ecof///7/wz7co力/7//)、隱禾jfr小環(huán)藻cr7/^/ca)和高山被孢霉(#0/"〃"3/^3///'加)(1S-4);以及原生生物破嚢壺菌屬種(ATCC20892)、金黃破嚢壺菌(r力rawWocAr"/w邁awre"邁)(ATCC34304)和粉紅石皮嚢壺菌(r力rai/Woc力7"y〃邊rose"邁)。但是，才艮據(jù)利用這些經(jīng)純化的生物體的方法，每克生物量/每升產(chǎn)生的二十二碳六烯酸的量較低，介于10至500mg之間。一些實例和代表性的產(chǎn)生孩i生物油的生物體示于圖5。已表明co3脂肪酸具有有益效果，并且本文所公開的油和組合物可就其以下作用而得以應(yīng)用對嚢性纖維化病(CochraneDatabaseSystRev.3)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Drugs63:845-53)、哮喘(AnnAllergyAsthmaImmunol90:371-7)和血栓形成性中風(fēng)(PrevCardiol6:38_1)、心臟保護方面的消炎作用，以及對動脈粥樣硬化和心律失常(ProstaglandinsLeukotEssentFattyAcids.63:351_62)的直接作用、在乳腺癌細胞系和前列腺癌細胞系中癌增殖的抑制和在動物實驗中減少癌細胞(AmJClinNutr77:532-43)，對精神分裂癥(JNeuralTransmSuppl64:105-17)和其它精神病(CanJPsychiatry48:195—203)的抗緊張作用；可用于正常新生兒發(fā)育并用于治療新生兒感染(EurJPediatr162:122-8)免疫營養(yǎng)添加劑，并且它可通過直接減弱引起神經(jīng)性疼痛和炎性疼痛的神經(jīng)元病變和神經(jīng)節(jié)病變用于治療病理性疼痛(ProstaglandinsLeukotEssentFattyAcids68:219-24)。2.破嚢壺菌科a)0NC-T18本文所公開的海生生物0NC-T18是作為產(chǎn)生PUFA的微生物分離群體(trip)的一部分而被收集的，從該群體中分離了60種以上的純培養(yǎng)物，詳細參見表7。另外，從加拿大新斯科舍的AdvocateHarbor,BayofFundy的鹽沼草葉片中也分離到了0NC-T18。通過顯樣i檢查和系列培養(yǎng)純化技術(shù)，該菌林被認為是屬于破嚢壺菌屬的單一微生物。所有菌林和兩個ATCC比較培養(yǎng)物(ATCC20891&MYA-1381)均在含0.5%葡萄糖、0.2%蛋白胨、0.2"/。酵母提取物的海水(SW)中生長，并進行GC(脂肪酸曱酯，F(xiàn)AME)分析。圖6示出0NC-T18和其它與其密切相關(guān)的生物體之間推定的關(guān)系系統(tǒng)樹。使用經(jīng)典的松樹花粉誘集(pinepollenbaiting)技術(shù)，然后在選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，最初作為單一微生物分離分離了0NC-T18。具體而言，制備含有5gL—工葡萄糖、2gL—'蛋白胨、2gL—'酵母提取物(在1升0.2nm過濾的海水中)的營養(yǎng)培養(yǎng)基。然后使用Bligh和Dyer提取法以及PUFA氣相色譜技術(shù)確定ONC-T18的脂肪酸生產(chǎn)情況。色謙結(jié)果證實，該菌林能夠產(chǎn)生增加量的TFA、DHA和顯著量的EPA和DPA。如本文所述，所7^開的真核微生物可用于制備包含DHA、EPA和DPA的脂質(zhì)或脂肪的方法中，但不限于上述0NC-T18或PTA-6245菌抹，而是包括所述菌抹的任何衍生物，不論該衍生物是通過遺傳修飾、化學(xué)誘變、發(fā)酵調(diào)節(jié)還是產(chǎn)生所述菌林的突變體的任何其它方式得到，并由此經(jīng)這些修飾的產(chǎn)物具有與真核微生物相似的遺傳或形態(tài)和功能的特征，均包括在上述公開范圍內(nèi)。公開了能產(chǎn)生具有獨特脂質(zhì)類別特征的脂質(zhì)組合物的真核微生物，并公開了維持該真核微生物的具有高度功能性及其它價值的這種脂質(zhì)的穩(wěn)定、可靠和經(jīng)濟的來源問題的技術(shù)方案。因此，本文公開了在產(chǎn)生更多(n-3)系列DHA和(n-6)系列DPA的野生型菌林，以及被設(shè)計為在更大程度上產(chǎn)生這些多不飽和脂肪酸的變種和重組菌林。這類變種或重組微生物包括被設(shè)計為具有如下特征在使用相同條件和培養(yǎng)基培養(yǎng)時，它們具有的所述脂質(zhì)含量較原始野生型菌林產(chǎn)生的那些脂質(zhì)含量更高。另外，還包括具有如下特征的可被篩選的微生物它們與相應(yīng)野生型菌林相比可產(chǎn)生含有相似量的(n-3)系列DHA、EPA和(n-6)系列DPA的脂質(zhì)，但是所述微生物可有效使用具有更高性價比的底物。公開了包括真核微生物破嚢壺菌目的組合物，其中所述真核微生物可產(chǎn)生不飽和脂肪酸。該多不飽和脂肪酸可為例如co3或co6脂肪酸，例如DHA和DPA。公開了包括真核生物在內(nèi)的組合物，其中所述組合物可產(chǎn)生脂質(zhì)。還公開了一類組合物，其中的脂質(zhì)包括本文所公開的脂質(zhì)。還公開了一類組合物，其中所述真核生物包括多個破嚢壺菌目。還公開了一類組合物，其中所述真核生物具有的18S核糖體RM基因序列與SEQIDNO:1具有至少80%的同一性。可以理解的是，本文所述任何形式的特征，例如真核微生物的遺傳學(xué)、脂質(zhì)特征或分類，均可用于表征本文所公開的微生物。真核微生物可包括破嚢壺菌科的一種或多種微生物，它們的實例為ATCC編號為20888、20889、20890、20891和20892的微生物。有4艮多可使用的、與該有機體和它們產(chǎn)生的不飽和脂肪酸相關(guān)的特征?？梢岳斫獾氖牵?，這些特征可以任何組合或排列形式用于限定一個或多個系列的生物體、油或抗氧化劑。例如，一個特征是該生物體自身的類別、該生物體的遺傳學(xué)身份、該生物體的脂質(zhì)和抗氧化劑生產(chǎn)情況以及該生物體的生長條件。b)類別真核微生物可來自網(wǎng)黏菌門(phylumLabyrinthulomycota)。真核孩l生物可來自網(wǎng)l^菌綱(classLabyrinthulomycetes)。真核孩克生物可來自破嚢壺菌亞綱(subclassThraustochytridae)。真核微生物可來自破嚢壺菌目(orderThraustochytriales)。真核孩i:生物可來自石皮嚢壺菌科(familyThraustochytriaceae)。真核微生物可來自破嚢壺菌屬(genusThraustochytrium)。真核孩i:生物可為破嚢壺菌屬種。真核樣吏生物可為金黃石皮嚢壺菌(r力/"a〃Woc力/"/wffa"rezM)。真核樣t生物可為粉紅石皮嚢壺菌(r力ra^^c力7"7z/邁r^ew邁)。真核微生物可為紋狀石皮嚢壺200680029630.5說明書第13/80頁菌(Thraustochytriumstriatum)。真核孩i生物可為裂殖壺菌屬(genusSchizochytrium)。真核微生物可為裂殖壺菌屬種。真核微生物可為任何上面列出真核微生物的修飾形式。真核微生物還可包括所述原核生物綱、目、科或?qū)俚娜魏文壳拔粗蛭唇?jīng)分離的成員。真核微生物的組合可為本文公開的任何生物體的任何組合，包括一個或多個破嚢壺菌屬種、裂殖壺菌屬種、金黃破嚢壺菌、紋狀破嚢壺菌和粉紅破嚢壺菌。來自破嚢壺菌科的真核微生物可為任何上文公開的那些真核微生物。真核微生物可包括ATCC編號為PTA-6245的生物體。c)遺傳學(xué)真核微生物可具有18SrRNA序列SEQIDNO:1。真核微生物可具有與SEQIDNO:1具有約90%的同源性或本文公開的任何其它同一性的18SrRNA序列。真核微生物可具有在嚴格條件或本文公開的任何其它條件下與SEQIDNO:1或SEQIDNO:1的一部分雜交的18SrRNA序列。生物體核酸的序列相似性/同一性和核酸雜交可如本文所述。具體而言，使用BLAST(基本的局部比對搜索工具)算法將SEQIDNO:1與在基因組數(shù)據(jù)庫GenBank(美國國家生物技術(shù)信息中心，美國國家衛(wèi)生研究所，貝塞斯達，馬里蘭，美國)中的核酸序列相比較，將SEQIDNO:1鑒定為與幾個真核破嚢壺菌屬種相關(guān)(91%相似性)、與破嚢壺菌屬種thraustochytriumsp.)CHN-1[AB126669](94.5%相似性)和破嚢壺菌科菌種(thraustochytriidaesp.)N1-27[AB073308](95.5%相似性)密切相關(guān)，并且與紋狀石皮嚢壺菌(thraustochytriumstriatum)[AF265338]最為密切相關(guān)(97.5%相似性)。3.(l)序列相似性可以理解的是，如本文所述，術(shù)語同源性和同一性的使用意味著與相似性具有相同的含義。因此，例如若在兩個非天然序列之間使用單詞同源性，則可以理解的是，這并不一定指示這兩個序列之間的進化關(guān)系，而是著眼于其核酸序列之間的相似性或親緣關(guān)系。許多確定兩個進化相或蛋白，目的是測量序列相似性，而不管它們在進化上是否相關(guān)。一般而言，可以理解的是，確定本文所公開基因和蛋白質(zhì)的任何已知變體和衍生物、或可能出現(xiàn)的那些變體和衍生物的一種方法是通過按照與特定已知序列的同源性來限定變體和衍生物。本文公開的具體序列的這一同一性也在本文其它地方進行了闡述。一般而言，本文7>開的核酸和蛋白質(zhì)的變體通常與指定序列或天然序列具有至少約50、55、60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%的同源性。本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解如何確定兩個蛋白或核酸例如基因的同源性。例如，可在將兩個序列進行比對之后計算同源性，從而使得同源性處于最高水平。計算同源性的另一種方法可通過已公開的算法進行。用于比較的序列的最佳比對可通過如下方法進4亍Smith和Waterman的局部同源性算法Uc^.j/7/7/.他M.2:482，1981)、Needle和Qunsch的同源性比對算法(/.M/.倫7.48:443，1970)、Pearson和Lipinan的相似性搜索方法CProc.^3〃.Jcatf.A/.做J85:2444，1988)、這些算法的計算機化執(zhí)行(WisconsinGenetics軟件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,GeneticsComputerGroup,575SeienceDr.，Madison,WT)或者檢查。核酸的這種同源性可通過例如在如下文獻中公開的算法獲得Zuker，M.5We/ce244:48-52，1989，Jaegeretal.淑/.Jcad.iW.,86:7706-7710，1989，Jaegeretal.183:281-306,1989,至少就其與核酸比對相關(guān)的內(nèi)容通過引用將這些文獻納入本文?？梢岳斫獾氖牵魏畏椒ㄍǔ＞墒褂?，并且在某些情況下，這些不同方法的結(jié)果可能有所不同，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解，若使用這其中的至少一種方法得到了同一性，則認為該序列具有所述同一性，并在本文中被公開。例如，本文所使用被認為與另一序列具有特定百分比同源性的序列指的是這樣一個序列它具有通過上述任何一種或多種計算方法計算得到的所述同源性。例如，如果使用Zuker計算方法計算得到第一個序列與第二個序列具有80。/的同源性，那么即便通過任何其它計算方法計算發(fā)現(xiàn)所述第一個序列與所述第二個序列并沒有80%的同源性，所述第一序列與所述第二序列也具有本文所述80%的同源性。作為另一個實例，如果使用Zuker計算方法和Pearson和Lipman計算方法計算得到第一個序列與第二個序列具有80%的同源性，那么即《更通過Smith和Waterman計算方法、Needleman和Wunsch計算方法、Jaeger計算方法或任何其它計算方法計算發(fā)現(xiàn)所述第一個序列與所述第二個序列并沒有80%的同源性，所述第一個序列也與所述第二個序列具有本文所述80%的同源性。作為又一個實例，如果使用每一種計算方法計算得到第一個序列與第二個序列具有80%的同源性(盡管在實踐中不同的計算方法通常會計算得到不同的同源性百分比)，則所述第一個序列與所述第二個序列具有本文所述80°/。的同源性。(2)雜交/選擇性雜交術(shù)語雜交通常指至少兩個核酸分子例如引物或探針和基因之間的序列驅(qū)動的相互作用。序列驅(qū)動的相互作用指的是在兩個核苷酸或核苷如，G與:相二互作用或者A與T相i作用就是序^列驅(qū)動的相互作用。通常，序列驅(qū)動的相互作用出現(xiàn)在核苷酸的Watson-Crick界面或Hoogsteen界面。兩個核酸的雜交受本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的多個條件和參數(shù)的影響。例如，反應(yīng)的鹽濃度、pH和溫度都會影響到兩個核酸分子是否會雜交。兩個核酸分子之間選擇性雜交的參數(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。例如，在某些實施方案中，選擇性雜交條件可被定義為嚴格雜交條件。例如，雜交的嚴格度受控于雜交和洗滌步驟之一或兩者的溫度和鹽濃度兩者。例如，實現(xiàn)選擇性雜交的雜交條件可包括在高離子強度溶液(6xSSC或6xSSPE)中于較TJ解鏈溫度，在此溫度下有一半分子與其雜交伴侶解離)低約12-25。C的溫度下雜交，然后在選定的溫度和鹽濃度的組合下洗滌，以使得洗滌溫度較L低5-20lC。溫度和鹽條件容易在預(yù)實驗中通過經(jīng)驗確定，在該預(yù)實驗中，固定在濾器上的參照DNA樣本與所研究標記核酸雜交，并隨后在不同嚴格條件下洗滌。對于DM-RNA和RNA-RNA雜交而言，雜交溫度通常較高。如上所述，該條件可用于實現(xiàn)嚴格度，或者為本領(lǐng)域已知(Sambrooketal.，MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork,1989;Kunkeletal.#e^fto^yA/7z7/z70入154:367，1987,至少就其與核酸雜交相關(guān)的內(nèi)容通過援引將其納入本文)。DNA:DNA雜交的優(yōu)選嚴格條件為在約68°C(在水溶液中)于6xSSC或6xSSPE中，然后在68。C洗涂。如若需要，雜交和洗滌的嚴格度可隨所需互補程度的減少而相應(yīng)降低，并且還取決于其中任何變異性被搜索區(qū)域的G-C或A-T的富集度。同樣，如若需要，雜交的嚴格度可隨所需同源性的減少而相應(yīng)降低，并且還取決于其中任何需要高度同源性區(qū)域的G-C或A-T的富集度，這些均為本領(lǐng)域所知。定義選擇性雜交的另一種方法是通過查看一種核酸與另一種核酸結(jié)合的量(百分比)。例如，在某些實施方案中，選擇性雜交條件是指在至少約60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、91、98、99、100%的限量核酸與不限量核酸結(jié)合時的條件。通常，不限量引物為例如IO、100或1000倍過量。這類分析可在如下條件下進行其中限量和不限量引物較其Ka低例如10、100或1000倍，或者其中僅一種核酸分子為10、100或1000倍，或者一種或兩種核酸分子高于其Kd。定義選擇性雜交的另一種方法是在需要雜交以促進所需酶操作的條件下，查看引物實現(xiàn)酶操作的百分比。例如，在某些實施方案中，選擇性雜交條件是在至少約50、55、60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100°/。的引物在促進酶操作的條件下實現(xiàn)酶操作時的條件；例如，若酶操作是DNA延伸，那么選擇性雜交條件是在至少約50、55、60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%的引物分子被延伸時的條件。優(yōu)選的條件還包括制造商所建議的那些條件或者本領(lǐng)域認為適合酶進行操作的夷卩些條件。正如同源性的情況一樣，可以理解的是，本文公開了多種確定兩個核酸分子之間雜交水平的方法。可以理解的是，這些方法和條件可在兩個核酸分子之間給出不同的雜交百分比，但是除非另外指明，否則滿足任一方法的參數(shù)即可。例如，若需要8oy。的雜交，并且只要在這其中的任一種方法中的必需參數(shù)范圍內(nèi)出現(xiàn)了雜交，則認為它由本文所公開?？梢岳斫獾氖?，本領(lǐng)域技術(shù)人員明白，若某一組合物或方法一起或單獨滿足這些確定雜交的標準的的任一標準，則該組合物或方法即為本文所/>開。d)所產(chǎn)生的分子的組合物可以理解的是，本文所公開真核生物能產(chǎn)生多種化合物和組合物。這些化合物和組合物可用作識別標志，即一種鑒定生物體的方式。例如，表征某一生物體的一種方法是通過該生物體產(chǎn)生脂質(zhì)的生產(chǎn)情況。如本文所述，這些不同的脂質(zhì)情況既可用于表征該生物體，也可以用于就各種理由進行純化、操作和收集。(l)脂質(zhì)可以理解的是，每種生物體可產(chǎn)生本文所公開的不飽和脂肪酸的某些生產(chǎn)情況。這些生產(chǎn)情況為該生物體的特征。下面為該生物體的不飽和脂質(zhì)生產(chǎn)情況和其它脂質(zhì)生產(chǎn)情況的一些實例。例如，真核微生物可產(chǎn)生占干細胞生物量至少約4wty。至6wty。(如約5wtW的脂質(zhì)或脂肪酸組分，所述脂質(zhì)或脂肪酸組分包括約0wt%至約2w"的豆蔻酸(如約1wt%)、約16wt。/。至約20wt。/n(如約18wt%)的棕櫚酸、約0w"至約2wt。/。(如約1w"/。)的棕櫚油酸、約4wt。/。至約8wt。/。(如約6wt"/。)的石更脂酸、約30wty。至約34wty。(如約32wtW的油酸、約40wt。/。至約44wt%(如約42wt%)的亞油酸和約0wt。/n至約3wt%(如約2wt"/fl)的n—3EPA。例如，真核微生物還可產(chǎn)生占干細胞生物量至少約1wt。/。至3w"(如約1.25wtW的脂質(zhì)或脂肪酸組分，所述脂質(zhì)或脂肪酸組分包括約2wt。/。至約4wt。/4(如約3wt。/0的豆蔻酸、50wt。/n至約60wt4(如約55wty。)的棕櫚酸、約2w"/。至約4wt。/。(如約3wt。/。)的棕櫚油酸、約16wt。/。至約20wt。/。(如約18wtW的石更脂酸、約9wt"/。至約13wt。/。(如約11wtW的油酸、約1wty。至約3wt。/。(如約2wtW的二十碳二烯酸和約6wt%至約10wt。/n(如約8wtW的n-3EPA。真核^l生物例如ONC-T18可產(chǎn)生占干細胞生物量至少約30wt%、40wt%、50wt%、60wt%、70。/。wt。/n或80wt。/。(如約80wtW)的脂質(zhì)組合物。例如，真核微生物可產(chǎn)生脂質(zhì)組合物，所述脂質(zhì)組合物包含約25%至約40%的w-3脂肪酸如n-3DHA(例如以重量計至少15%、20%、25%、30°/。、35%、40%、45°/。、50%、55°/。或60°/。)、約0%至約3%的(0-3脂肪酸EPA(例如以重量計至少1%或2%)和約4%至約12y。的co-6脂肪酸例如n-6DPA(例如以重量計至少4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%)?？梢岳斫獾氖?，可以基于該真核微生物能夠存在的生長條件，對由真核微生物產(chǎn)生的脂質(zhì)的組合物進行處理。通過改變本文公開的各個參數(shù)可對組合物進行處理，以產(chǎn)生例如產(chǎn)率更高的DHA或DPA。例如，操作不會產(chǎn)生更多的實際克數(shù)，但是該操作可產(chǎn)生更好的DHA或DPA與EPA和其它所需PUFA的比率，從純化的角度來看，該比率是所需的。本文討論了多種處理條件。圖10示出由所公開真核微生物所產(chǎn)生的各種PUFA可能的代謝途徑，這與脂肪酸甲酯代謝產(chǎn)物追蹤結(jié)果一致。使用例如簡并引物研究(Metzetal.(2001)Science293:290-3和Kaulmann&Hertweck(2002)Angew.Chem.Int.Ed.41:1866-9),在本文所公開途徑中可坤皮鑒定的蛋白質(zhì)為聚酮合成酶。使用例如雜交探針，還可鑒定延伸酶和去飽和酶。使用例如雜交探針和/或筒并引物研究，還可鑒定脂肪酸合成酶。4.生長和培養(yǎng)進行了包括碳、氮(肽氮)、磷和硫、滲壓劑和pH在內(nèi)的表型微孔板(phenotypicmicroplate)研究。正交陣列(Taguchi)法用于確定最佳培養(yǎng)基組成和氮、碳和鹽濃度的變'If況(JosephJ&PiganatiellsJR(1998)IJETrans，20:247-254)。若增加攪拌或(102,則會增加生物量產(chǎn)量和TFA，但減少DHA。若減少攪拌或d02，則會減少細胞生物量(g),并減少TFA，但增加DHA,而且會減少C16:0、C16:1和C18:1。若升高溫度，則會增加生物量產(chǎn)量和TFA,但減少DHA。若降低溫度，則會減少細胞生物量(g)，并減少TFA,但增加DHA，而且會減少C16:0、C16:1和C18:1。來源于所公開真核微生物的細胞生物量可通過接種合適的天然或人工海水培養(yǎng)基(含約2%至約100%的海水)獲得。該真核微生物能利用該培養(yǎng)基中的各種營養(yǎng)組分。在該培養(yǎng)基中所使用的碳源的實例為糖類例如葡萄糖、果糖、右旋糖(dextrose)、乳果糖、半乳糖、麥芽三糖、麥芽糖、乳糖、糖原、明膠、淀粉(玉米或小麥)，以及糖衍生物如醋酸鹽、m-肌醇(來源于玉米漿)、半乳糖醛酸(來源于果膠)、L-巖藻糖(來源于半乳糖)、龍膽二糖、葡糖胺、a-D-葡萄糖-l-磷酸鹽(來源于葡萄糖)、纖維二糖(來源于纖維素)、糊精(來源于玉米)和a-環(huán)糊精(來源于淀粉)，和多元醇例如麥芽糖醇、赤藻糖醇、側(cè)金盞糖醇和油酸例如甘油和tween80，和氨基糖例如N-乙?；?D-半乳糖胺、N-乙酰基-D-葡糖胺和N-乙?；?P-甘露糖胺。而氮源的實例為天然氮源如蛋白胨、酵母提取物、麥芽提取物和魚粉，或者為有機氮源例如谷氨酸鈉，但不限于此。另外，如若必要，磷酸鹽例如磷酸鉀和磷酸鈉、無機鹽例如石克酸銨、碳酸氫鈉、原釩酸鈉、鉻酸鉀、鉬酸鈉、亞硒酸鈉、硫酸鎳、硫酸銅、硫酸鋅、氯化鈷、氯化鐵、氯化錳和氯化鈣可僅與螯合劑乙二胺四乙酸一起用作微量養(yǎng)分，或者與該螯合劑以及維生素例如維生素B6、維生素Bl、泛酸鈣、對氨苯曱酸、核黃素、煙酸、生物素、葉酸和維生素B12—起用作微量養(yǎng)分。在配制好培養(yǎng)基后，使用酸或堿將pH調(diào)節(jié)至3.0至10.0之間，恰當(dāng)時，調(diào)節(jié)至例如pH4.0至6.5之間，并且通過例如高壓滅菌對培養(yǎng)基進行滅菌。在溫度為4至3(TC、優(yōu)選18至28'C之間，通過通氣振蕩培養(yǎng)、振蕩培養(yǎng)、靜止培養(yǎng)、分批培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)、滾動分批培養(yǎng)或波動培養(yǎng)等，將培養(yǎng)進行1至30天、1至21天、1至15天、1至12天、l至9天或優(yōu)選3至5天。以下的條件是可產(chǎn)生一系列脂質(zhì)的條件的實例，所述脂質(zhì)在產(chǎn)量方面可用作商品。對0NC-T18的培養(yǎng)條件的研究表明，本文所公開的真核微生物在天然或人工海水、或在含有濃度最低至5%的天然或人工海水的培養(yǎng)基中生長良好。如上所述，加入該培養(yǎng)基中的碳源和氮源可為通常使用的那些碳源和氮源。天然氮源或有機氮源相對而言是等效的，并且該培養(yǎng)基中的總氮濃度保持恒定。將這些碳源或氮源以標準濃度加入培養(yǎng)基中。如本文所公開的那樣，若滿足這些條件，則會對脂質(zhì)含量、累積DHA、DPA和EPA的比例或量稍有影響。對于高濃度發(fā)酵0NC-T18而言，能夠使用幾種方法來增加細胞生物量和脂質(zhì)產(chǎn)率。這些方法包括分別將培養(yǎng)基中碳和氮的濃度(兩者的比率為6:1至15:1、優(yōu)選6:1至13:1之間，溫度為4至30t:、優(yōu)選18至281C之間)兩者分別從5gL—t至60gL—1升高至100gf至160gL—\和從4gL—'至10gL—'升高至40gL—i至60gL—\使用這種方法，所產(chǎn)生的生物量和脂質(zhì)的比例也以相應(yīng)的水平增加。另外，通過將碳源從5gL—'至60gL—'升高至100gL—至160gL^而氮源保持不變，可以增加脂質(zhì)產(chǎn)量。另外，通過將氮源的量從IOgL—i升高至60g1/i而碳源保持不變，可以增加生物量產(chǎn)量，同時維持脂質(zhì)含量。此外，實驗表明生物量和脂質(zhì)產(chǎn)量隨攪拌(范圍在100至1000rpm之間，更好地在350至600rpm之間，并且最佳地在350至450rpm之間)的加快而大大提高，并且脂質(zhì)含量僅有最低限度的降低，脂肪酸生產(chǎn)情況沒有減少，并且攪拌在異養(yǎng)發(fā)酵早期特別有用。實驗還表明，培養(yǎng)基中的溶解氧含量介于1至10%之間、最好是在5%時，可得到最適宜的脂質(zhì)產(chǎn)量。最后，將醋酸鹽、微量元素、金屬和維生素加至生產(chǎn)培養(yǎng)基(如上所述)增加了DHA、EPA和DPA相對于其它脂肪酸的產(chǎn)量，而不降低總脂質(zhì)值。通過進行上述異養(yǎng)發(fā)酵，能持續(xù)產(chǎn)生細胞生物量，所述細胞生物量可產(chǎn)生含(n-3)系列DHA的脂質(zhì)，所述DHA在培養(yǎng)基的濃度較高，不低于5g/升培養(yǎng)基、更優(yōu)選不低于20g/升培養(yǎng)基。另外，實驗表明，在達到最大生物量水平之后，這些脂質(zhì)中有大部分在培養(yǎng)的對數(shù)晚期/過渡期期間累積。然而，在發(fā)酵過程中，脂質(zhì)含量通常不會低于總生物量的25%，通常最大為約80%。上述條件下的培養(yǎng)可使用常規(guī)攪拌發(fā)酵罐進行。還可使用泡罩塔發(fā)酵罐(成批培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng))或波動發(fā)酵罐。進行脂質(zhì)分離之前細胞生物量的收集可使用各種常規(guī)方法例如離心(如離心式固液分離機(solid-ejectingcentrifuge))或過濾(例如交叉流過濾)進行，并且還包括使用加速收集細胞生物量的沉淀劑(例如磷酸鈉、氯化鈉或聚丙烯酰胺(polyacridamide))。5.脂質(zhì)的分離圖7示出隨各個參數(shù)而變化的脂質(zhì)和DHA生產(chǎn)情況圖。所有這些數(shù)據(jù)可用于獲取關(guān)于0NC-T18真核微生物的具體特征。圖13示出所公開真核生物的大體的脂肪酸生產(chǎn)情況圖。含有(n-3)系列DHA和(n-6)系列DPA的脂肪可通過如下步驟獲得例如通過碾磨、超聲處理來破壞或破裂收集到的細胞生物量，然后使用溶劑例如氯仿、己烷、曱醇、乙醇或通過超臨界流體抽提方式進行提取。所得到的含(n-3)系列DHA和(n-6)系列DPA的脂肪在每克干細胞生物量的含量優(yōu)選高于O.25g，更優(yōu)選高于O.6g。所公開真核微生物例如0NC-T18能產(chǎn)生如上述獲得的脂質(zhì)，該真核微生物的各種變種以及各變種的結(jié)合可以產(chǎn)生具有如下組成情況的脂質(zhì)。中性脂質(zhì)的百分比以重量計為總脂質(zhì)的至少95%。真核微生物例如ONC-T18產(chǎn)生的中性脂質(zhì)中脂肪酸的典型組成如下15%的豆蔻酸、8%的十五酸、35%的棕櫚酸、7°/的棕櫚油酸、1%的硬脂酸、2%的油酸、1%的二十碳五烯酸、6%的二十二碳五烯酸和25。/。的二十二碳六烯酸(GC鐠示于圖1)。所公開真核微生物例如0NC-T18能產(chǎn)生如上述獲得的脂質(zhì)，該真核'以及務(wù)艾肝的結(jié)分可以廣j￡異百如下組風(fēng)慣況的脂質(zhì)。0NC-T18的中性脂質(zhì)組分中甘油一酯、甘油二酯和甘油三酯的百分比分別為0%至約2%、0至約2%和96至約100°/。而占脂質(zhì)組分5%至約10%的極性脂質(zhì)組分包括與中性脂質(zhì)結(jié)合和未與之結(jié)合的磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸和磷脂酸(phosphotidicacid)?？梢岳斫獾氖牵@些脂質(zhì)可以任何組合或排列存在于這些生物體內(nèi)。還可以理解的是，如上所述，這些脂質(zhì)的濃度可通過改變生長條件和培養(yǎng)基條件來操控。(1)脂質(zhì)濃度真核微生物可產(chǎn)生含大于等于約4.0gL—i培養(yǎng)基的n-3DHA、EPA和n-6DPA的脂質(zhì)組分。真核微生物可產(chǎn)生含大于等于約20.0gL1培養(yǎng)基的n-3DHA、EPA和n-6DPA的脂質(zhì)組合物。真核微生物可產(chǎn)生含大于等于約14.0gL—'培養(yǎng)基的n-3DHA、EPA和n-6DPA的脂質(zhì)組合物。真核微生物可產(chǎn)生約1.5gL—工至約5.0gL—、如約4.6gL一1)的n-3DHA、約0.5gL—t至約1.5gL—、如約0.22gL—"的n-3EPA和約0.5gL—'至約1.5gL—'的n-6DPA。另外，真核^:生物可產(chǎn)生介于301.2至360.3mgg—i甚至最高達790mgg—工細胞生物量、含有如下物質(zhì)的脂質(zhì)組分豆蔻酸、肉豆蔻稀酸、十五酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、二十碳二烯酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸和二十二碳五烯酸。真核微生物還可產(chǎn)生含有如下物質(zhì)的組分44.3至57mgg—'豆蔻酸(等于1134.5至1458.1mgL—"、0.5至0.65mgg—1肉豆蔻稀酸(等于13.3至16.63mgL-"、33.5至34.6mgg1十五酸(等于856.9至885.1mgL-"、121.9至165.1mgg—i棕櫚酸(等于3118.2至4223.3mgL—^)、7.9至28.5mgg—t棕櫚油酸(等于202.1至729mgL—"、4.38至5.9mgg—^更脂酸(等于112至151mgL—"、6.94至9.9mgg"由酸(等于177.5至253.2mgL—"、0.4至1.3mgg一1亞油酸(等于11.26至33.3mgL—"、0.5至1.0mgg^二十碳二烯酸(等于12.8至25.6mgL-1)、0.4至0.5mgg^花生四烯酸(等于10.2至13mgL—"、75至100mgg^二十二碳六烯酸(等于1918至2560mgL—》、1.9至6mgg—i二十碳五烯酸(等于48.6至153.5mgL1)和17.1至33.7mgg'二十二碳五烯酸(等于437.4至862.1mgL—"，細胞生物量內(nèi)總脂肪酸含量介于301至790mgg—'之間(等于7700至20，209mgL—"。(2)其它分子真核微生物可進一步產(chǎn)生類胡蘿卜素和葉黃素。這類類胡蘿卜素和葉黃素的實例包括P-胡蘿卜素、番茄紅素、壞青素、角黃素、芬尼黃質(zhì)、玉米黃素、海膽酮、P-隱黃素、辣椒紅、黃體素(lutin)、胭脂樹橙、P-脫輔基-8-胡蘿卜素醛和P-脫輔基-8-胡蘿卜素醛-酯。物產(chǎn)生的各種PUFA相綴合。通常，抗氧化劑為與氧反應(yīng)并通常被氧所消耗的化合物。由于抗氧化劑通常與氧反應(yīng)，所以抗氧化劑還通常與自由基生成物和自由基反應(yīng)("TheAntioxidants-TheNutrientsthatGuardYourBody"byRichardA.Passwater,Ph.D.，1985，KeatsPublishingInc.,至少就其與抗氧化劑相關(guān)的內(nèi)容通過援引納入本文)。組合物可包含任何抗氧化劑，非限制性實例可包括但不限于可直接清除自由基的非類黃酮抗氧化劑和營養(yǎng)物，包括綜合胡蘿卜素(multicarotene)、P-胡蘿卜素、cc-胡蘿卜素、Y-胡蘿卜素、番茄紅素、黃體素和玉米黃素、竭、維生素E、包括oc-、P-和Y(生育酚，尤其是ot-生育酚等)維生素E的琥珀酸酯和trolox(—種可溶的維生素E類似物)維生素C(抗壞血栓)和Niacin(維生素B3、煙酸和煙酰胺)、維生素A、13-順式視黃酸、N-乙?；?L-半胱氨酸(NAC)、抗壞血酸鈉、吡咯烷-二硫代-氨基曱酸酯和輔酶Q10;催化破壞自由基的酶類，包括過氧化物酶例如作用于HA和例如有機過氧化物的谷胱甘肽過氧化物酶(GSHPX),包括作用于H202的過氧化氫酶(CAT)、岐化02H202的超氧化物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GSHTx)、谷胱甘肽還原酶(GR)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)以及它們的模擬物、類似物和聚合物(抗氧化酶類的類似物和聚合物例如SOD描述于例如美國專利系列號No.5,171,680,至少就其與抗氧化劑和抗氧化酶類相關(guān)的內(nèi)容通過援引將其納入本文)；谷胱甘肽；血漿銅藍蛋白；半胱氨酸和半胱胺(P-巰基乙胺)和類黃酮和類黃酮樣分子例如葉酸和葉酸鹽?？寡趸讣捌淠M物和抗氧化營養(yǎng)物的綜述可參見Kumaretal，39:301，1988和MachlinL.J.andBendich,尸^S^A/ow/7a/1:441-445,1987，就其與抗氧化劑相關(guān)的內(nèi)容通過援引將這兩篇文獻納入本文。類黃酮也稱為"苯并色酮"，為存在于自然界、具有抗氧化性的水溶性化合物。類黃酮廣泛分布于維管植物中，并存在于大量蔬菜、水果和飲料如茶和酒(特別是紅酒)中。類黃酮為共軛的芳香族化合物。存在最為廣泛的類黃酮是黃酮和黃酮醇(例如楊梅黃酮(3，5，7，3，，4，，5，，-六羥黃酮)、櫟皮黃酮(3，5，7，3，，4，-五羥黃酮)、山奈黃素(3，5,7,4，-四羥黃酮)和黃酮,菜苷配基(5，7，4，-三羥黃酮)和毛地黃黃酮(5，7，3，，4，-四羥黃酮)及其糖苷和櫟皮黃酮)。類胡蘿卜素是由多種微生物和植物所產(chǎn)生的重要天然色素，通常為紅色、橙色或黃色。在過去類胡蘿卜素已被用于飼料、食品和營養(yǎng)制品產(chǎn)業(yè)。已知它們是植物生長和光合作用所必需的，并且為人中維生素A的主要膳食來源。膳食性抗氧化劑例如類胡蘿卜素(P-胡蘿卜素、番茄紅素、蝦青素、角黃素、玉米黃素、辣椒紅、黃體素、胭脂樹橙、P-脫輔基-8-胡蘿卜素醛和p-脫輔基-8-胡蘿卜素醛-酯)展現(xiàn)出顯著的抗癌活性，并且在預(yù)防慢性疾病中起著重要作用。類胡蘿卜素為有效的生物學(xué)抗氧化劑，可將單線態(tài)氧上的激發(fā)能吸收到類胡蘿卜素鏈上，從而導(dǎo)致類胡蘿卜素分子的降解，但是可防止其它分子或組織被損害。氧是代謝功能所必需的，但是它也會攻擊細胞。人體具有大量從其細胞中除去氧產(chǎn)生的分子的代謝酶和抗氧化劑。氧化應(yīng)激被認為是諸多病癥的影響因素，所述病癥例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、缺血性心臟病和中風(fēng)、阿爾茨海默癡呆、癌癥和衰老等。因此，抗氧化劑具有預(yù)防多種疾病的潛能。已從海洋生物來源中分離了幾種抗氧化劑化合物；這些抗氧化劑化合物包括蝦青素、P-胡蘿卜素和其它類胡蘿卜素。類胡蘿卜素是天然存在的一組分布廣泛的色素，有700種以上的天然脂溶性色素主要由微藻、大藻、細菌和真菌種產(chǎn)生，并且蝦青素及其衍生物在商業(yè)上受到特別關(guān)注。蝦青素是極其有效的抗氧化保護劑。然而，與胡蘿卜素不同，蝦青素容易穿過血腦屏障/血視網(wǎng)膜屏障，因此還具有預(yù)防腦病和眼病的潛能。臨床前研究表明了服用蝦青素的各種有益效果，例如(i)抑制膀胱、結(jié)腸、肝臟、乳腺和口腔中的癌形成和生長；(ii)使眼睛的視網(wǎng)膜免受氧化損傷，因此具有抵抗年齡相關(guān)性黃斑疾病的作用；(iii)促進免疫活性提高；(iv)提供免于紫外線損傷的保護；以及(v)提供更好的肌耐力。b)微生物的分離公開了通過以下方法所獲得的來自破嚢壺菌科的微生物，所述方法包括用花粉粒誘集鹽水(天然海水或人工鹽水)中的營養(yǎng)體(vegetative)樣本并進行培養(yǎng)；分離花粉粒并將其轉(zhuǎn)移至異養(yǎng)培養(yǎng)基中并進行培養(yǎng)；鑒定產(chǎn)生脂肪酸的分離株，從鑒定得到的分離抹分離來自破嚢壺菌科的微生物。其它形式的分離包括輔以合適抗生素的培養(yǎng)基和通過如上所述的顯微方式或通過使用18SrRNA基因引物或探針的鑒定。異養(yǎng)培養(yǎng)基可如下文所述。5.由真核微生物產(chǎn)生的脂質(zhì)和其它分子公開了脂質(zhì)組合物，所述脂質(zhì)組合物包含約25w"至約40wt。/o的n-3DHA，約6wt"/。至約10wt。/。的n-6DPA和約0wt。/。至約3wt。/。的n-3EPA。脂質(zhì)組合物可進一步包含約11wty。至約15wt。/。(如約13wt。/。)的豆蔻酸、約7wt。/。至約11wt。/。(如約9wtW的十五酸、約37wt。/。至約41wt。"如約39wtW的棕櫚酸、約3w"/。至約7w"/。(如約5wtW的棕櫚油酸、約0至約3wt/。(如約1wtW的硬脂酸或約1wty。至約4wt。/。(如約2wty。)的油酸。脂質(zhì)組合物可含有濃度大于約400mg生物量的n-3DHA，濃度大于100mg生物量的n-6DPA。脂質(zhì)組合物還可含有類胡蘿卜素。這類類胡蘿卜素的實例包括P-胡蘿卜素、番茄紅素、蝦青素、玉米黃素、角黃素、海膽酮、芬尼黃質(zhì)、辣椒紅、黃體素、胭脂樹橙、脫輔基-8-胡蘿卜素醛和p-脫輔基-8-胡蘿卜素醛-酯。一方面，該組合物可含有至少約24wtW的n-3DHA、約1wtM的n-3DPA、約6wt。/。的n-6DPA和約1w"/。的n-3EPA。6.含有由真核微生物產(chǎn)生的分子的組合物人和動物(包括海生動物)用的食品、添加劑、藥物組合物可包含該組合物(脂質(zhì)、具有抗氧化劑的脂質(zhì)和抗氧化劑自身)。還公開了包含該組合物(脂質(zhì)、具有抗氧化劑的脂質(zhì)和抗氧化劑自身)的嬰兒配方。C.方法1.脂質(zhì)制備方法公開了制備脂質(zhì)組合物的方法，所述方法包括培養(yǎng)包括來自破嚢壺菌科的一種或多種微生物在內(nèi)的真核微生物，并分離該脂質(zhì)組合物?？刹捎枚喾N方法來回收在多種培養(yǎng)基中發(fā)酵得到的細胞生物量，例如通過過濾或離心。然后洗滌、冷凍、冷凍干燥或噴霧干燥細胞，并在無氧環(huán)境下儲存，以消除氧的存在，然后將其摻入經(jīng)加工的食品或飼料產(chǎn)品中。含有(n-3)DHA、EPA和(n-6)DPA等PUFA的細胞脂質(zhì)還可通過諸如超臨界流體抽提等方法、或通過采用溶劑例如氯仿、己烷、曱醇、二氯曱烷或曱醇的抽提法從細胞生物量提取，并且所得到的提取物在負壓條件下蒸發(fā)，以產(chǎn)生經(jīng)濃縮的脂質(zhì)物質(zhì)樣本。co-3和co-6PUFA可通過如下步驟進一步濃縮水解該脂質(zhì)，并通過采用常規(guī)方法例如尿素包合法(ureaadduction)或分餾、柱色i普法或通過超臨界流體分級分離法濃縮高度不飽和組分。還可破裂或裂解細胞并將脂質(zhì)抽提至植物油或動物油(如魚油)中。抽提得到的油可通過通常用于提煉植物油的公知方法(例如通過化學(xué)提煉或物理提煉)來提煉。在抽提得到的油作為食用油使用或出售前，這些提煉方法可將雜質(zhì)從其中除去。提煉之后，該油可直接用作祠料或食品添加劑以產(chǎn)生富含co-3和/或co-6的產(chǎn)品?；蛘?，該油可按如下所述進一步加工和純化，然后用于以上應(yīng)用，并且還可用于制藥。在產(chǎn)生經(jīng)濃縮的co-3或co-6油的另一種方法中，所收集得到的細胞生物量(新鮮的或經(jīng)干燥的)可通過公知技術(shù)例如超聲波處理、液體切力破裂方法、玻珠研磨、高壓擠壓、凍融或細胞壁的酶消化來破裂或滲裂。破裂細胞中的脂質(zhì)可使用某種溶劑或溶劑例如己烷、氯仿、乙醚或曱醇的混合物來萃取。除去溶劑，并通過使用任何公知的將甘油三酯轉(zhuǎn)化為游離脂肪酸或脂肪酸的酯的方法(包括堿性水解、酸性水解或酶解)來水解脂質(zhì)。水解完成之后，不能皂化的化合物被萃取至溶劑例如乙醚、己烷或氯仿中并被除去。然后將剩下的溶液通過加入酸來酸化，并將游離脂肪酸萃取至溶劑例如己烷、乙醚或氯仿中。然后將含有該游離脂肪酸的溶劑溶液冷卻至低到足以使非PUFA化合物結(jié)晶的溫度，隨后所述非PUFA化合物可通過過濾、離心或沉淀來除去。結(jié)果是剩下的PUFA化合物得到了濃縮并被用作人的營養(yǎng)添加劑、用作食品添加劑或用于藥物應(yīng)用。同時，公開了通過上文公開方法制備的脂質(zhì)組合物。來自破嚢壺菌科的微生物可為上文所公開的任何微生物。a)培養(yǎng)基異養(yǎng)培養(yǎng)基可包含(人工的或天然的)海鹽、一種或多種碳源和一種或多種氮源。該海鹽存在的量可為約2.O至約40.0gL—\標準培養(yǎng)條件(并非針對高濃度發(fā)酵，而是針對低成本發(fā)酵)下所使用的碳源和氮源的濃度范圍分別是5gL—:至60gL—'和4g1/至10gL—、對于高濃度發(fā)酵而言，標準培養(yǎng)條件下所使用的碳源和氮源的濃度范圍分別是分別是IOOgL—工至160gL—i和40gL—i至60g1/1。油脂積累的趨勢是真核微生物在(如上所述的那些)培養(yǎng)基中生長，其中在約24至約48小時之后氮的提供受到了限制，而碳的提供依然很富裕。該真核微生物繼續(xù)吸收碳(單糖形式)，但是由于缺乏形成相關(guān)蛋白質(zhì)和核酸的氮而不再進行細胞分裂。結(jié)果是這些糖被轉(zhuǎn)化成儲備油脂，這與RatledgeC.a/;/"7fec力.16:34-39，2004)所描述的方式非常相似，圖9給出該生物體所特有的這一現(xiàn)象。氮源可為蛋白胨、酵母提取物、麥精和谷氨酸鈉中的一種或多種。氮源還可為玉米漿或棉籽提取物。氮源可含有酵母提取物和/或蛋白胨或谷氨酸單鈉。例如，氮源可包括但不限于EMDYE-MSG、EMDYE、EMDTMPeptone-MSG、SigmaYE-MSG、SigmaYE、FermtechYE-MSG、FermtechYE或Fishmeal(62%蛋白質(zhì))。酵母提取物所存在的量可為約2gL—\谷氨酸單鈉存在的量可為約8gL一1。碳源可為如下物質(zhì)中的一種或多種D-海藻糖、甘油、D-葡糖酸、L-乳酸、D,L-蘋果酸、D-核糖、Tween20、D-果糖、乙酸鹽、乙酸、ot-D-葡萄糖、麥芽糖、胸苷、L-天冬酰胺、D-木糖、Tween40、oc-酮基-戊二酸、蔗糖、L-谷氨酰胺、Tween80、p-曱基-D-葡糖苷、麥芽三糖、腺苷、延胡索酸、溴代琥珀酸、L-絲氨酸、D-纖維二糖、L-丙氨?；?甘氨酸、丙酮酸甲酯、L-蘋果酸、甘氨?；?L-脯氨酸、D-palcose、L-來蘇糖、丙酮酸、a-D-乳糖、糊精、D-阿拉伯糖、2-脫氧-D-核糖、明膠、右旋糖、淀粉、3-0-P-D-吡喃半乳糖基-D-阿拉伯糖、D-塔格糖、5-酮基-D-葡糖酸、草酰蘋果酸(oxalomalicacid)、山梨酸、L-鳥氨酸和二羥基乙酸酯。一方面，碳源可為D，L-蘋果酸、D-果糖、D-木糖、延胡索酸、D-纖維二糖、5-酮基-D-葡糖酸、丙酮酸、oc-D-乳糖、玉米糊精、明膠、玉米淀粉或小麥淀粉。碳源存在的量可為約1gl^至60g1/并且最高至約200gL一1。在一個實例中，培養(yǎng)基含有約5gD-葡萄糖、約2g蛋白胨和約2g酵母提取物/升鹽水(天然的或人工的)。在另一實例中，培養(yǎng)基含有約60gD-葡萄糖、約10g酵母提取物/升鹽水(天然的或人工的)。在另一實例中，培養(yǎng)基可含有約8g酵母提取物、32gMSG、24g海鹽(天然的和人工的)和300gD-葡萄糖/升。培養(yǎng)基可進一步含有磷酸鹽(如磷酸鉀和磷酸鈉)。培養(yǎng)基可進一步含有無機鹽(如硫酸銨、碳酸氫鈉、原釩酸鈉、鉻酸鉀、鉬酸鈉、亞竭酸、疏酸鎳、硫酸銅、疏酸鋅、氯化鈷、氯化鐵、氯化鎂)。培養(yǎng)基可進一步含有螯合物(如EDTA)。培養(yǎng)基可進一步含有維生素(如維生素B6、維生素Bl、泛酸鈣、對氨基苯甲酸、核黃素、煙酸、生物素、葉酸和維生素B12)。培養(yǎng)基的pH為約4.0至約6.5。培養(yǎng)可進行約1至約9天(如約3天至約5天)。培養(yǎng)可在約18至約30'C(如約18-25'C)進行。培養(yǎng)可進一步包括振蕩或通氣。分離脂質(zhì)的過程可包括將該微生物與萃取溶劑相接觸。該溶劑可包括選自氯仿、己烷、曱醇或乙醇或超臨界C02的一種或多種溶劑。該方法可產(chǎn)生本文所7>開的任何組合物。該真核微生物可產(chǎn)生含大于等于約20gL—i培養(yǎng)基的n-3DHA的脂質(zhì)組合物。該真核微生物可產(chǎn)生含大于等于40gL—i培養(yǎng)基的n-3DHA的脂質(zhì)組合物。該真核微生物可產(chǎn)生含大于等于80gL—i培養(yǎng)基的n-3DHA的脂質(zhì)組合物。2.篩選和鑒定方法本文所公開的真核微生物可產(chǎn)生含(n-3)系列二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸以及(n-6)系列DPA的脂質(zhì)。這些真核微生物可使用例如以下的篩選方法篩選?？蓪I養(yǎng)體樣本置于裝有10mL無菌(O.2nm過濾)天然海水(含有濃度分別為300和500mgL—i的青霉素和鏈霉素)的20mL小瓶中。然后用無菌花粉粒誘集小瓶，并在18至25'C培養(yǎng)48小時。然后將花粉粒轉(zhuǎn)移至含抗生素(如上所述)的瓊脂板上，并在相同條件下培養(yǎng)。挑選球形或蛞蝓形細胞的單個無規(guī)則透明集落和非典型的酵母或細菌集落，并在與上述相同的培養(yǎng)基和相同的條件下傳代培養(yǎng)。然后使用營養(yǎng)液體培養(yǎng)基根據(jù)生長情況和脂肪酸產(chǎn)生情況對這些分離林進行篩選，所述營養(yǎng)液體培養(yǎng)基由0.2nm過濾的天然海水制備，含5gL—1葡萄糖、2gL—i蛋白胨和2gf酵母提取物，結(jié)果通過對液體培養(yǎng)基進行離心或沉淀收集得到細胞生物量。可使用常規(guī)方法直接對脂肪酸進行酯交換，并且脂肪酸甲酯組合物可通過氣相色鐠分析，篩選產(chǎn)生恰當(dāng)量n-3系列DHA和n-6系列DPA的菌林用于進一步研究中。公開了鑒定真核微生物的方法，所述方法包括用花粉粒誘集海水(天然海水或人工海水)中的營養(yǎng)體樣本并進行培養(yǎng)；將該花粉粒轉(zhuǎn)移至異養(yǎng)培養(yǎng)基中并進行培養(yǎng)；并鑒定產(chǎn)生脂肪酸的分離林。還公開了由上面鑒定得到的真核微生物所產(chǎn)生的脂質(zhì)組合物。的脂質(zhì)組合物。；'、、，、、'、還7>開了ATCC編號為PTA-6245的真核樣￡生物(0NC-T18)。還公開了屬于破嚢壺菌目的真核微生物(0NC-T18)，它們具有例如SEQIDNO:1所示的18SrRNA，并被鑒定為破嚢壺菌屬種。還公開了能產(chǎn)生濃度分別高于400mgL—工和100mgL—1的DHA和DPA的真核微生物破嚢壺菌屬種。還公開了能通過上述異養(yǎng)發(fā)酵產(chǎn)生范圍在50至1250mgkg—i的類胡蘿卜素以及能產(chǎn)生1至20mgkg^的蝦青素、0.25至10mgkg^的玉米黃素、1至20mgkf的角質(zhì)素、1至20mgkg—L的海膽酮和1至200mgkg—工的p-胡蘿卜素的真核微生物破嚢壺菌屬種。還公開了培養(yǎng)真核微生物的方法，該方法包括在某種條件下培養(yǎng)真核微生物，其中所述條件包括含有如下組成的培養(yǎng)基人工海鹽(營養(yǎng)性海水)形式、2.0至15.0gL—i的氯化鈉，酵母提取物形式和谷氨酸單鈉形式、濃度分別為2.0和8.0gL—'的氮源和葡萄糖形式、最高至130gL一的碳。所公開的方法可培養(yǎng)例如0NC-T18，使得總脂肪酸的至少24%重量為DHA、以重量計至少6%為DPA，并且至少1。/4為EPA。所公開的培養(yǎng)方法還可培養(yǎng)例如0NC-T18,從而使得以重量計至少1%為類胡蘿卜素物質(zhì)，其中1至2%并且至少1.2%為蝦青素，0.25至1%并且至少0.45%為玉米黃素，5至16%并且至少9%為角質(zhì)素，1至2%并且至少1.2%為海膽酮以及以重量計12至16%并且14。/。p-胡蘿卜素。3.核酸多種本文公開的分子均為基于核酸的分子，包括例如編碼例如rRNA以及任何其它本文公開的蛋白質(zhì)的核酸，以及各種功能性核酸。所^Hf的核酸由例如核苷酸、核苷酸類似物或核苷酸替代物構(gòu)成。這些和其它分子的非限制性實例在本文中有述?？梢岳斫獾氖牵巛d體在細胞中表達時，所表達的mRNA通常由A、C、G和U/T構(gòu)成。同樣可以理解的是，例如若反義分子通過例如外源送遞被引入細胞或細胞環(huán)境，則有利的是，反義分子由可減少反義分子在細胞環(huán)境中降解的核苷酸類似物構(gòu)成。a)核苷酸和相關(guān)分子核苷酸是含有堿基部分、糖部分和磷酸部分的分子。核苷酸可通過其形成核苷間鍵合的磷酸部分和糖部分連接在一起。核普酸的堿基部分可為腺噤呤-9-基(A)、胞嘧啶-l-基(C)、鳥嘌呤-9-基(G)、尿嘧咬-1-基(U)和胸腺嘧啶-1-基(T)。核苷酸的糖部分為核糖或脫氧核糖。核苷酸的磷酸部分為五價磷酸。核苷酸的非限制性實例為3，-AMP(3，-單磷酸腺苷)或5'-GMP(5，-單磷酸鳥苷)。核苷酸類似物為含有對堿基、糖或磷酸部分作出某類修飾的核苷酸。對核苷酸的修飾為本領(lǐng)域所熟知，包括例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羥曱基胞嘧啶、黃噤呤、次黃嘌呤和2-氨基腺噤呤，以及在糖或磷酸部分作出的修飾。核苷酸替代物為與核苷酸具有相似功能性，但是不含磷酸部分的分子，例如肽核酸(PM)。核苷酸替代物為以Watson-Crick或Hoogsteen方式識別核酸、但通過非磷酸部分的部分連接在一起的分子。核普酸替代物在與恰當(dāng)?shù)镊昂怂嵯嗷プ饔脮r也能形成雙螺旋型結(jié)構(gòu)。還能將其它形式的分子(綴合物)與核苷酸或核苷酸類似物連接起來以增強例如細胞攝入。綴合物可通過化學(xué)方式連接核苷酸或核苦酸類似物。這類綴合物包括但不限于脂質(zhì)部分，例如膽固醇部分(Letsingeretal.，Proc.Nat1,Acad,Sd.USA，86:6553-6556，1989)。Watson-Crick相互作用為與核普酸、核苷酸類似物或核苷酸替代物的Watson-Crick界面的至少一種相互作用。核香酸、核苷酸類似物或核苷酸替代物的Watson-Crick界面包括基于嘌呤的核苷酸、核苷酸類似物或核苷酸替代物的Cl、N1和C6位以及基于嘧啶的核苷酸、核苷酸類似物或核苷酸替代物的C2、N3和C4位。Hoogsteen相互作用為發(fā)生在核苷酸或核苷酸類似物的Hoogsteen界面的相互作用，該界面暴露于雙螺旋DNA的大溝中。Hoogsteen界面包括噤呤核苷酸C6位的活性基團(冊2或0)和N7位。b)序列有多個序列與例如SEQIDNO:1以及本文公開的任何其它核酸和蛋白質(zhì)(在Genbank公開)相關(guān)，并且這些序列和其它序列以及其中所含有的各個子序列通過援引全部納入本文。本文提供了多個序列，并且這些序列和其它序列可參見Genbank(www.pubmed.gov)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員明白如何分辨序列偏差和差異，并明白如何調(diào)整與某一具體序列相關(guān)的組合物和方法，使其適應(yīng)其它相關(guān)序列。根據(jù)本文所公開信息和本領(lǐng)域已知信息，可設(shè)計任何序列的引物和/或探針。c)引物和探針公開了包括引物和探針在內(nèi)的組合物，它們能與本文所公開的基因相互作用。在某些實施方案中，引物用于支持DNA擴增反應(yīng)。通常引物能以序列特異方式被延長。序列特異方式的引物延長包括任何方法，其影:通過引物i長所產(chǎn)生-到的產(chǎn)物的組合物或序列。一因此，序列特^方式的引物延長包括但不限于PCR、DM測序、DNA延長、DNA聚合、RNA轉(zhuǎn)錄或反轉(zhuǎn)錄。優(yōu)選以序列特異方式擴增引物的技術(shù)和條件。在某些方面，引物可用作本文提及的破嚢壺菌或桿菌的種特異性或?qū)偬禺愋蕴结?。在這種情況下，引物可設(shè)計來特異性針對真核微生物，并在隨后進行PCR反應(yīng)。然后可通過成功形成PCR產(chǎn)物來確定靶標種的存在。在某些方面，引物還可用于DM擴增反應(yīng)，例如PCR或直接測序?？梢岳斫獾氖?，在某些方面，引物還可使用非酶促技術(shù)來延長，其中例如用于延長引物的核苷酸或寡核苷酸被修飾，從而使得它們可以發(fā)生化學(xué)反應(yīng)來以序列特異方式延長引物。通常，所公開的引物可與核酸或核酸的某一區(qū)域雜交，或者它們可與核酸的互補序列或核酸某一區(qū)域的互補序列雜交。d)核酸送遞正如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的那樣，在包括將外源DNA給予并被攝入受試者的細胞內(nèi)的上述方法(即基因轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染)中，所公開核酸可為棵露DM或RM形式，或者該核酸可存在于將該核酸送遞至細胞的載體內(nèi)，藉此編碼抗體的DNA片段受到啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。載體可為商購制劑，例如腺病毒載體(QuantumBiotechnologies,Inc.(Laval,Quebec,Canada)。核酸或載體至細胞的送遞可通過多種機制。作為一個實例，送遞可通過脂質(zhì)體進行，可使用商購脂質(zhì)體制劑例如LIPOFECTIN、LIPOFECTAMINE(GIBC0-BRL,Inc.,Gaithersburg，MD)、SUPERFECT(Qiagen，Inc.Hilden，德國)和TRANSFECTAM(PromegaBiotec，Inc.,Madison,WT)，以及4艮據(jù)本領(lǐng)域的標準方法開發(fā)出來的其它脂質(zhì)體。另外，所公開核酸或載體可通過電穿孔(由Genetronics公司(SanDiego,CA)提供的技術(shù))以及通過SONOPORATION機器(ImaRxPharmaceuticalCorp.,Tucson,AZ)進行體內(nèi)送遞。作為一個實例，載體送遞可通過病毒系統(tǒng)，例如可包裝重組逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)進行(參見例如Pastanetal.，Jcad.i^ZA85:4486，1988;Milleretal.,Ce//.A/o/.6:2895，1986)。該重組逆轉(zhuǎn)錄病毒隨后可用于感染細胞，并由此將編碼主要中和抗體(或其活性片段)的核酸送遞至該感染細胞中。當(dāng)然，將有所改變的核酸引入哺乳動物細胞的確切方法并不限于使用逆轉(zhuǎn)錄病毒。對于該方法，還廣泛存在其它技術(shù)，包括使用腺病毒載體(Mitanietal.，腸.Ce/e5:941-948，1994)、腺伴隨病毒(AAV)載體(Goodmanetal.，AA^d84:1492-1500，1994)、慢病毒載體(Naidinietal.,^c/e/ce272:263-267，1996)和假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(Agrawaletal.，^r/er.^e邁a"人24:738-747，1996)。還可4吏用物理轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)，例如通過脂質(zhì)體送遞和受體介導(dǎo)的送遞以及其它胞吞機制進行(參見例如Schwartzenbergeretal.，A/oM87:472-478,1996)。該公開的組合物和方法可與任何這些或其它通常使用的基因轉(zhuǎn)移方法一起使用。4.表達系統(tǒng)被送遞至細胞的核酸通常含有表達調(diào)控系統(tǒng)。例如，病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)中的插入基因通常含有啟動子和/或增強子，以幫助調(diào)控所需基因產(chǎn)物的表達。啟動子通常為在距離轉(zhuǎn)錄起始位點相對固定的位置時起作用的一個或多個DNA序列。啟動子含有RNA聚合酶和轉(zhuǎn)錄因子之間發(fā)生基本相互作用所必需的核心元件，并且可含有上游元件和應(yīng)答元件?？梢岳斫獾氖?，除了下文討論的通用系統(tǒng)之外，還有多種可用于本文所公開生物體中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)?？梢岳斫獾氖?，本文所公開生物體可用本文所闡述的多種基因例如標記基因、或者具有其它所需屬性例如增強或獨特的生長特征的基因進行轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)化。a)病毒啟動子和增強子哺乳動物宿主細胞中控制從載體轉(zhuǎn)錄的優(yōu)選啟動子可獲自多種來源例如諸如以下的病毒的基因組多瘤病毒、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙肝病毒，并且最優(yōu)選巨細胞病毒，或者來自異源哺乳動物啟動子如3-肌動蛋白啟動子。SV40病毒的早期和晚期啟動子通常以還含有SV40病毒復(fù)制起點的SV40限制性酶切片段形式獲得，(Fiersetal.，^"re，273:113,1978)。人巨細胞病毒的立即早期啟動子通常以E限制性酶切片段形式獲得(Greenway,PJ.etal，fe/e18:355-360，1982)。當(dāng)然，來自宿主細胞或相關(guān)種的啟動子也可用于本申請。增強子通常指在距轉(zhuǎn)錄起始位點不固定距離起作用的DNA序列，并且可在轉(zhuǎn)錄單位的5，端(Laimins，L.etal.，5W.78:993,1981)或3，端(Lusky，MX.，etal.，M/Ce//A/o.3:1108,1983)。另外，增強子可位于內(nèi)含子內(nèi)(Banerji，J.L.etal.，Ce//33:729，1983)以及編碼序列自身內(nèi)(0sborne，T.F.，etal.，淑6W/A/o.4:1293，1984)。它們通常長10至300bp，并且它們以順式方式起作用。增強子起提高從鄰近啟動子開始的轉(zhuǎn)錄的作用。增強子通常還含有介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的應(yīng)答元件。啟動子還含有介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的應(yīng)答元件。增強子通常對基因表達的調(diào)控起決定作用。盡管現(xiàn)在已知很多增強子序列來自哺乳動物基因(珠蛋白、彈性酶、白蛋白、曱胎蛋白和胰島素)，但是通常會使用來自真核細胞病毒的增強子進行總體表達。優(yōu)選的實例為復(fù)制起點(100-270bp)晚期側(cè)的SV40增強子、巨細胞病毒早期啟動子增強子、復(fù)制起點晚期側(cè)的多瘤病毒增強子、和腺病毒增強子。啟動子和/或增強子可被激發(fā)其功能的特定化學(xué)事件或光特異性地激活。系統(tǒng)可受諸如四環(huán)素和地塞米松等試劑調(diào)節(jié)。還存在通過暴露于輻照例如Y輻照或烷化化療藥劑來增強病毒載體基因表達的方法。在某些實施方案中，啟動子和/或增強子區(qū)域可作為組成型啟動子和/或增強子，以最大限度表達待轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄單位區(qū)域。在某些構(gòu)建體中，即便啟動子和/或增強子區(qū)域僅在特定時間在特定類型的細胞中表達，它在所有真核細胞類型中也均是具有活性的。這種類型的優(yōu)選啟動子為CMV啟動子(650bp)。其它優(yōu)選的啟動子為SV40啟動子、巨細胞病毒(全長啟動子)和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體LTE。已表明，所有特定調(diào)節(jié)元件均可被克隆并用于構(gòu)建在特定細胞類型如黑素瘤細胞等中選擇性表達的表達載體。膠質(zhì)細胞原纖維酸性蛋白(GFAP)啟動子已被用于在膠質(zhì)來源的細胞中選擇性表達基因。在真核宿主細胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人或有核細胞)中使用的表達載體還可含有終止影響mRNA表達的轉(zhuǎn)錄所必需的序列。這些區(qū)域被轉(zhuǎn)錄為mRNA編碼組織因子蛋白的非翻譯部分中的多腺苷酸化區(qū)段。3，非翻譯區(qū)域也可包括轉(zhuǎn)錄終止位點。優(yōu)選轉(zhuǎn)錄單位也含有多腺苷酸化區(qū)域。該區(qū)域的一個優(yōu)點在于它增加了轉(zhuǎn)錄單位如mRNA那樣被加工和運輸?shù)膸茁?。表達構(gòu)建體中多腺苷酸化信號的鑒定和使用已為本領(lǐng)域公知。優(yōu)選將同源多腺苷酸化信號用于轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體中。在某些轉(zhuǎn)錄單位中，多腺苷酸化區(qū)域來源于SV40早期多腺苷酸化信號，并由約400個堿基組成。還優(yōu)選轉(zhuǎn)錄單位僅含有其它標準序列，或者同時含有上述序列，以提高構(gòu)建體的表達或穩(wěn)定性。b)標記病毒載體可包括編碼標記產(chǎn)物的核酸序列。該標記產(chǎn)物用于確定該基因是否被送遞至細胞，并且一旦被送遞則被表達。優(yōu)選的標記基因為大腸桿菌"cZ基因(編碼P-半乳糖苷酶)和綠色焚光蛋白。在某些實施方案中，標記可為選擇性標記。合適的用于哺乳動物細胞的選擇性標記的實例為二氫葉酸還原酶(DHFR)、胸苷激酶、新霉素、新霉素類似物G418、潮霉素和嘌呤霉素。當(dāng)這類選擇性標記被成功轉(zhuǎn)移至哺乳動物宿主細胞中時，若將經(jīng)轉(zhuǎn)化的哺乳動物細胞置于選擇壓力下則它可存活。存在兩類不同的廣泛使用的選擇方案。第一類以細胞代謝和突變細胞系的使用為基礎(chǔ)，所述突變細胞系缺乏不依賴補給性培養(yǎng)基而生長的能力。兩個實例為CHODHRF細胞和小鼠LTK細胞。這些細胞缺乏在不添加諸如胸普或次黃噤呤等營養(yǎng)物的情況下生長的能力。由于這些細胞缺乏完整的核普酸合成途徑所必需的某些基因，因此若沒有在補給性培養(yǎng)基中提供所缺少的核苷酸，則它們不能存活。補給培養(yǎng)基的另一途徑是將完整的DHFR或TK基因引入缺乏相應(yīng)基因的細胞中，由此改變其生長需求。未能由DHFR或TK基因轉(zhuǎn)化的各個細胞在非補給性培養(yǎng)基中不能存活。第二類為顯性選擇，所述顯性選擇指用于任一細胞類型中并且不需要使用突變細胞系的選擇方案。這些方案通常使用藥物來阻止宿主細胞的生長。具有新基因的這些細胞會表達傳送藥物抗性的蛋白質(zhì)，并且會在經(jīng)歷選擇之后存活。這種顯性選擇的實例使用藥物新霉素(SouthernP.andBerg，P.,/M7ec場Ato".1:327，1982)、麥考酚酸(Mul1igan，R.C.andBerg,P.5We/ce209:1422，1980)或潮霉素(Sugden，B.etal.，Ce//.A/o入5:410-413，1985)。這三個實例采用受真核生物基質(zhì)控制的細菌基因，以分別賦予對合適的藥物G418或新霉素(遺傳霉素)、xgpt(麥考酚酸)或潮霉素的抗性。其它實例包括新霉素類似物G418和噤呤霉素。5.肽類a)蛋白變體如本文所述，本文所公開生物體蛋白的多個變體都是已知的并在本文中被考慮。另外，對于功能已知的破嚢壺菌目的菌林而言，存在很多同樣可用于所公開方法和組合物的破嚢壺菌目蛋白的衍生物。蛋白變體和衍生物為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知，并且可包括氨基酸序列修飾物。例如，氨基酸序列修飾物通常包括以下三類中的一類或多類置換變體、插入變體或缺失變體。插入包括氨基端和/或羧基端融合以及單個或多個氨基酸殘基的序列間插入。插入通常是比氨基端或羧基端融合的那些插入更小的插入，例如數(shù)量級為一至四個殘基的插入。免疫原性融合蛋白衍生物，例如那些在實施例中描述的免疫原性融合蛋白衍生物，可通過如下方法制備得到通過體外交聯(lián)或通過轉(zhuǎn)化有編碼融合物的DM的重組細胞培養(yǎng)，將大到足以賦予免疫原性的多肽與靶序列融合在一起。缺失的特征在于將一個或多個氨基酸殘基從蛋白序列中除去。通常，蛋白分子內(nèi)任一位置有不超過約2至6個的殘基缺失。這些變體通?？赏ㄟ^編碼蛋白質(zhì)的DNA中核香酸的位點專一誘變制備得到，由此產(chǎn)生編碼變體的DNA,并在隨后于重組細胞培養(yǎng)物中表達DNA。在序列已知的DNA中預(yù)定位點進行置換突變的技術(shù)是公知的，例如M13引物誘變和PCR誘變。氨基酸置換通常為一個殘基，但是也可同時在多個不同位置出現(xiàn)；插入的數(shù)量級通常為約1至10個氨基酸殘基；并且缺失的范圍為約1至30個殘基。缺失或插入優(yōu)選在相鄰殘基對進行，即缺失2個殘基或插入2個殘基。置換、缺失、插入或它們的任一組合可聯(lián)合起來獲得最終的構(gòu)建體。突變不能將序列置于讀碼框之外，并優(yōu)選不會形成可產(chǎn)生mRNA二級結(jié)構(gòu)的互補區(qū)域。置換變體為其中至少一個殘基被除去并且一個不同殘基被插入該位置的那些變體。這類置換通?？梢罁?jù)下表l和2進行，并被認為是保守置換。功能或免疫性方面的顯著改變可通過選擇保守性不如表2的那些置換的置換來實現(xiàn)，即選擇在對保持下述結(jié)構(gòu)或性質(zhì)的影響方面差異更顯著的殘基(a)置換區(qū)域多肽骨架的結(jié)構(gòu)，例如作為片層或螺旋構(gòu)象，(b)靶位點的分子的電荷或疏水性或者(c)側(cè)鏈大小。通常被預(yù)計會在蛋白性質(zhì)方面產(chǎn)生的變化最大的置換為以下的這些置換(a)用親水殘基如絲氨?；蛱K氨?；脫Q疏水殘基如亮氨?；?、異亮氨?；⒈奖滨；⒗i氨?；虮滨；?，(b)用半胱氨酸或脯氨酸置換任何其它殘基，(c)用帶有正電側(cè)鏈的殘基如賴氨?；?、精氨?；蚪M氨?；脫Q負電殘基如谷氨酰基或天冬氨?；脫Q，或者(d)用具有大側(cè)鏈的殘基如苯丙氨酸置換不具有側(cè)鏈的殘基如甘氨酸，在這種情況下，(e)通過增加疏酸化和/或糖基化位點的數(shù)目。表l:氨基酸縮寫<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>*其它為本領(lǐng)域已知例如，一個氨基酸殘基由在生物學(xué)和/或化學(xué)上相似的另一氨基酸殘基所替換被本領(lǐng)域的技術(shù)人員稱為保守置換。例如，保守置換將用一個疏水殘基來替換另一個疏水殘基，或者用一個極性殘基來替換另一個極性殘基。上述置換包括以下組合，例如Gly，Ala;Val，lie,Leu;Asp，Glu;Asn，Gin;Ser,Thr;Lys，Arg和Phe，Try。每個明確^>開序列的這些保守置換變體包括在本文所提供的嵌合(mosaic)多肽范圍內(nèi)?？刹捎弥脫Q誘變或缺失誘變來插入N-糖基化(Asn-X-Thr/Ser)或0-糖基化(Ser或Thr)位點。半胱氨酸或其它不穩(wěn)定殘基的缺失也可能是所需的。潛在的蛋白酶解位點如Arg的缺失或置換通過例如使堿性殘基之一缺失來實現(xiàn)，或通過用谷氨酰胺?；蚪M氨?；鶜埢脫Q一個殘基來實現(xiàn)。某些翻譯后的衍生化作用是由于重組宿主細胞對所表達多肽的作用所致。谷氨酰胺?；吞於０孵；鶜埢ǔＴ诜g后脫去酰胺基成為相應(yīng)的谷氨?；吞於滨；鶜埢；蛘?，這些殘基在溫和的酸性環(huán)境下脫去酰胺基。其它翻譯后修飾包括脯氨酸和賴氨酸的羥基化，絲氨?；蛱K氨?；鶜埢牧u基基團的磷酸化，賴氨酸、精氨酸和組氨酸側(cè)鏈的o-氨基基團的曱基化(T.E.Creighton，Proteins:StructureandMolecularProperties,W.H.Freeman&Co"SanFranciscopp79-86，1983)，N端氨基的乙?；约霸谀承┣闆r下C端氛基的酰胺化?？梢岳斫獾氖牵x本文所公開蛋白質(zhì)的變體和衍生物的一種方法是通過根據(jù)其與具體已知序列的同源性/同一性來定義該變體和衍生物。特別公開的是本文公開蛋白質(zhì)的變體，所述變體與所述序列具有至少60%、70%或75%或80%或85%或90°/?；?5%的同源性。本領(lǐng)域的凈支術(shù)人員容易理解如何確定兩種蛋白質(zhì)的同源性。例如，同源性可在比對這兩個序列之后計算得到，從而使得該同源性處于最高水平。計算同源性的另一種方法可通過已經(jīng)公布的算法來進行。比較序列的最佳比對可通過以下方法進行局部同源性算法(SmithandWaterman,1981，J///.yJ/af力2:482)、同〉原'性t匕對算'法(NeedlemanandWunsch，1970，/.扁.48:443)、相似性搜尋方法(PearsonandLipman，1988,Jcad.Sc/.85:2444)、由計算機完成的這些算法(如Wisconsin遺傳學(xué)軟件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,GeneticsComputerGroup,Madison,WI，U.S.A)或人工檢查。相同類型的核酸同源性可通過例如在以下文獻中公開的算法來獲得Zuker，M.6We，244:48-52，1989，Jaegeretal.淑/.hcT.咖86:7706-7710，1989,Jaegeretal.f/z，/.183:281-306，1989,至少就其與核酸比對相關(guān)的內(nèi)容通過援引將這些文獻納入本文?？梢岳斫獾氖牵瑢ΡＪ赝蛔兒屯葱缘拿枋隹梢匀魏谓M合結(jié)合起來，例如與具體序列具有至少70%的同源性的具體實例，其中所述變體為保守突變。由于本說明書闡述了各種蛋白和蛋白序列，因此要理解的是，編碼這些蛋白序列的核酸同樣被公開。這將包括與特定蛋白序列相關(guān)的所有簡并序列，即具有編碼一個具體蛋白序列的序列的所有核酸，以及編碼所公開的該蛋白序列的變體和衍生物的所有核酸(包括簡并核酸)。因此，盡管各個具體核酸序列并未在本文中寫出，但是應(yīng)理解的是，實際上每一個序列均通過所公開的蛋白質(zhì)序列在本文中被公開和被描述。還要理解的是，當(dāng)本文中公開了所公開蛋白的具體變體時，盡管沒有氨基酸序列表明是哪種具體的DNA序列在生物體內(nèi)編碼該蛋白，，但是編碼產(chǎn)生該蛋白的具體菌林中此種蛋白的已知核^列同樣是已知的，并且在本文中得以公開和描述?？梢岳斫獾氖牵嬖谠S多可被引入所公開組合物的氨基酸和肽類似物。例如，存在許多D-氨基酸或者具有與表1和表2的所示氨基酸不同的官能取代基的氨基酸。公開了天然存在的肽的對應(yīng)立體異構(gòu)體以及肽類似物的立體異構(gòu)體。這些氨基酸可很容易地通過以下方式被引入多肽鏈用所選氨基酸使tRNA分子帶電，并利用例如琥珀密碼子以位點特異方式將氨基酸類似物插入肽鏈來對遺傳構(gòu)建體進行基因工程改造(Thorsonetal.，//A/o厶77:43—73，1991,Zoller,Cw/r.^/n.,3:348-354,1992;Ibba，"/WecAoo/.toe/.13:197-216，1995，Cahilletal.，7>e"^^A/oc/e邁.&/，14:400-403，1989;Benner,7>e/^AA/o&c力/70厶，12:158-163,1994)至少就其與氨基酸類似物相關(guān)的內(nèi)容通過援引將所有這些文獻納入本文)?？僧a(chǎn)生與肽相似但不通過天然肽鍵連接的分子。例如，連接氨基酸或氨基酸類似物的鍵可包括CH2冊一、--CH2S--、--CH2-CH2—、--CH-CH--(順式和反式)、一C0CH2—、--01(010(^2—和一CHH2S0--(這些鍵和其它鍵可參見Spatola，A.F.inChemistryandBiochemistryofAminoAcids,Peptides,andProteins,B.Weinstein，eds.，MarcelDekker，NewYork,p.267，1983;Spatola,A.F.，VegaData(March1983)，Vol.1，Issue3，PeptideBackboneModifications(概述)；Morley，7>e/7^y,力ar瓜463-468,1980;Hudson,D.etal.，M/.戶抓/Voties.14:177-185，1979(—CH2NH—、CH2CH2-);Spatolaetal."尸e38:1243-1249，1986(—CHH2-S);HannJ.C力e瓜尸e,h./rraas.I307-314，1982(--CH—CH--，順式和反式)；Almquistetal./艦23:1392-1398，1980(—C0CH2—);Jennings-Whiteetal.7Wra力^/ro/7，23:2533，1982(—C0CH2-);Szelkeetal.^，ea/7J/;//.,EP45665CA:97:39405，1982(--CH(OH)CH2—);Hoiladayetal.7"em力ecT,0/724:4401—4404，1983(—C(0H)CH2—)和HrubyZ//eiW.31:189-199,1982(—CH2—S—),每一篇文獻均通過引用納入本文。特別優(yōu)選的非肽鍵是一CH2NH—。可以理解的是，肽類似物可在上述鍵兩端的原子之間具有一個以上的原子，例如b-丙氨酸、g-氨基丁酸等。氨基酸類似物和肽類似物通常具有增強或所需的屬性，例如生產(chǎn)更為經(jīng)濟、化學(xué)穩(wěn)定性更高、藥理性質(zhì)(半衰期、吸收情況、效價、效力等)增強、特異性發(fā)生改變(如生物活性范圍更廣)、抗原性降低等。D-氨基酸可用于形成更穩(wěn)定的肽，原因在于D-氨基酸不會被肽酶等所識別。用相同類型的D-氨基酸來對保守序列的一個或多個氨基酸進行全面置換(例如用D-賴氨酸來置換L-賴氨酸)可用來形成更穩(wěn)定的肽。半胱氨酸殘基可用來環(huán)化或連接兩個或多個肽。這對于迫使肽形成特定構(gòu)象是有益的(RizoandGieraschj/w.A/oc力e邁.61:387，1992,通過援引納入本文)。6.添加劑本文還公開了營養(yǎng)添加劑。營養(yǎng)添加劑為可通過給予受試者或由受試者服用，以提供、供給或增加營養(yǎng)物質(zhì)(如維生素、礦物質(zhì)、必需微量元素、氨基酸、肽、核酸、寡核苷酸、脂質(zhì)、膽固醇、類固醇、糖類等)。一方面，本文公開了含有本文所公開任何一種化合物的營養(yǎng)添加劑。例如，營養(yǎng)添加劑可包括本文所公開的任何一種脂質(zhì)。這些脂質(zhì)的脂肪酸殘基可為本文所公開的任何脂肪酸(如不飽和或飽和脂肪酸殘基)。營養(yǎng)添加劑可含有任何量本文所公開的化合物，但是通常含有確定可提供給受試者所需劑量的苯二醇衍生物(如CoQj和/或脂肪酸的合適量。營養(yǎng)添加劑中所需要的化合物的確切量因受試者而異，這取決于受試者的物種、年齡、體重和整體狀況，被治療的飲食缺陷的嚴重程度，具體的給藥模式等。因此，不能對每一營養(yǎng)添加劑的具體量進行規(guī)定。但是，合適的量可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在考慮本文的教導(dǎo)的情況下僅使用常規(guī)實驗就能確定。在一個具體的實例中，營養(yǎng)添加劑可含有以重量計約0.05至約20%、約1至約7.5%或約3至約5%的化合物。在另一個實例中，營養(yǎng)添加劑可含有以重量計約0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.95、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5或20.0%的化合物，在合適時任一所述數(shù)值可形成終點或起點。在另一方面，當(dāng)為營養(yǎng)添加劑時，該添加劑可由最高至100%的添力口劑構(gòu)成。營養(yǎng)添加劑還可含有其他營養(yǎng)物質(zhì)如維生素、微量元素、礦物質(zhì)等。此外，營養(yǎng)添加劑可含有其他組分例如防腐劑、抗^L生物劑、抗氧^f匕劑、螯合劑、增稠劑、調(diào)味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑和/或粘合劑。營養(yǎng)添加劑通?？煽诜?，并且可為任何適于口服給藥的形式。例如，營養(yǎng)添加劑通?？蔀槠瑒⒛z膠嚢、膠嚢、液體、嚢劑或糖漿形式。7.送遞裝置本文所述任何化合物均可摻入送遞裝置。送遞裝置的實例包括但不限于孩吏嚢、孩￡球、納米球或納米顆粒、脂質(zhì)體、noisome、納米紅質(zhì)體、固體-液體納米顆粒、凝膠、凝膠膠嚢、片劑、洗劑、膏劑、噴霧劑或乳劑。適合非口服給藥的送遞裝置的其他實例包括多孔微粒pulmosphere。用于本文的具體送遞裝置的實例如下所述。可將所公開化合物摻入脂質(zhì)體中。正如本領(lǐng)域所知，脂質(zhì)體通常來源于磷脂或其他脂質(zhì)物質(zhì)。脂質(zhì)體由分散于水性介質(zhì)中的單層或多層含水液晶形成。任何能形成脂質(zhì)體的無毒、生理上可接受并且可代謝的脂質(zhì)均可使用。脂質(zhì)體形式的所公開組合物除含有本文公開的化合物外，還含有穩(wěn)定劑、防腐劑、賦形劑等。合適的脂質(zhì)的實例為天然的和合成的磷脂和磷脂酰膽堿(卵磷脂)。制備脂質(zhì)體的方法為本領(lǐng)域所知。參見例如Prescott，Ed.，MethodsinCellBiology，VolumeXIV，AcademicPress,NewYork,p.33etseq.，1976,就其對脂質(zhì)體及其制備方法的教導(dǎo)通過援引納入本文。在其他實例中，脂質(zhì)體可為陽離子型脂質(zhì)體(如DOTMA、DOPE、DC膽固醇)或陰離子型脂質(zhì)體。如若需要，脂質(zhì)體可進一步包含有助于耙向具體細胞的蛋白質(zhì)。含有化合物和陽離子型脂質(zhì)體的組合物的給藥可給予至流入耙器官的血液或者^皮吸入至呼吸道從而耙向呼吸道的細胞。關(guān)于脂質(zhì)體，參見例如Brigham，e"/,血"e577謝A/o/1:95_100，1989、Feigner,etal.,戶roc淑/咖84:7413-7，1987和美國專利No.4,897,355，就其對脂質(zhì)體的教導(dǎo)通過引用納入本文。作為一個實例，送遞可經(jīng)由脂質(zhì)體進行，并且可使用商購脂質(zhì)體制劑例如LIPOFECITN、LIPOFECTAMINE(GIBC0-BRL,Inc.，Gaithersburg，MD)、SUPERFECT(Qiagen，Inc.Hilden，Germany)和TRANSFECTAM(PromegaBiotec，Inc.,Madison,WI)以及才艮據(jù)本領(lǐng)域的標準方法開發(fā)的其它脂質(zhì)體等。還可使用其中化合物自脂質(zhì)體的擴散或送遞是針對特定速率或劑量來設(shè)計的脂質(zhì)體。本文所述的noisome是可用來送遞本文公開組合物的送遞裝置。Noisome是包含非離子型表面活性劑的多室或單室嚢泡。溶質(zhì)的水溶液被由表面活性劑大分子組裝形成的雙分子層所包裹。與脂質(zhì)體類似，noisome也用于靶向送遞例如抗癌藥，包括氨曱喋呤、多柔比星和免疫佐劑。通常認為它們與transferosome、由兩親糖類制備的嚢泡和含有氨基基團的聚合物如殼多糖并不相同。本文所述的納米紅質(zhì)體是可用于送遞本文公開組合物的送遞裝置。納米紅質(zhì)體是由紅細胞經(jīng)由通過確定孔徑的濾器的透析而制備得到的納米嚢泡。這些嚢泡可被裝載上各種生物活性分子的陣列，所述生物活性分子包括本文所公開的蛋白質(zhì)和組合物。它們通常作為抗腫瘤劑例如博來霉素、放線菌素D等的理想載體，但是也可用于送遞類固醇和其他脂質(zhì)等。本文所述的人工紅細胞是可用于送遞本文7>開組合物的另一類送遞裝置。人工紅細胞可通過界面聚合法和復(fù)合乳化法形成。通常，"細胞"壁由polyphtaloylL-賴氨酸聚合物/聚苯乙烯構(gòu)成，內(nèi)部由來自綿羊紅細胞裂解液的血紅蛋白溶液構(gòu)成。微球所負載血紅蛋白的顆粒大小通常為約l至約10mm。它們的大小、柔韌度和攜氧能力與紅細胞相似。本文所述固體-液體納米顆粒是可用于送遞本發(fā)明組合物的另一類送遞裝置。固體-液體納米顆粒是納米顆粒，它們分散于表面活性劑水溶液中。它們由具有單分子層磷脂包被物的固體疏7jc核心構(gòu)成，通常由高壓勻漿技術(shù)制備得到。免疫刺激復(fù)合物(ISCOMS)是固體-液體納米顆粒的實例。它們是40nm籠形超分子裝置，含有脂質(zhì)、膽固醇和疏水抗原，主要用作免疫佐劑。例如，ISCOM可用于延長皮下注射的環(huán)孢霉菌A的血漿水平。本文所述的微球和微嚢是可用于送遞本文公開組合物的又另一類送遞裝置。與脂質(zhì)體送遞系統(tǒng)不同，微球和微嚢通常并不具有水性核心，而是具有固體聚合物基質(zhì)或膜。這些送遞裝置通過以下方法獲得聚合物的控制沉淀法、可溶聚合物的交聯(lián)法和兩種單體的界面聚合法或高壓勻漿技術(shù)。這些被包封的化合物通過蝕解或自顆粒擴散從儲庫逐漸釋放。已成功開發(fā)出短效肽類制劑，例如諸如亮丙瑞林和曲語瑞林(triptoreline)等的LHRH激動劑。聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)微球目前以每月一次和每月三次的劑型形式用于治療晚期前列腺癌、子宮內(nèi)膜異位癥和其他激素響應(yīng)病癥。亮丙瑞林是一種LHRH超拮抗劑，使用溶劑萃取法/蒸發(fā)法可將其摻入多種PLGA基質(zhì)中。正如所描述的那樣，全部這些送遞裝置均可用于本文所7〉開方法中。Pulmosphere是可用于本發(fā)明的送遞裝置的又一類其他實例。Pulmosphere為密度較低(小于約0.1mmL—"的中空多孔顆粒。Pulmosphere通常具有良好的再分散性，通常通過超臨界液體濃縮(supercriticalfluidcondensation)技術(shù)制備。采用某些基質(zhì)如糖類、人血清白蛋白等的同步噴霧干燥法可提高用于肺部送遞的蛋白質(zhì)和肽(如胰島素)和其他生物分子的穩(wěn)定性。這類送遞還可由微型乳劑和脂質(zhì)乳劑完成，這兩類乳劑為無需大量輸入機械能即能自發(fā)形成的超細、超薄、透明的水包油(o/w)乳劑。在該技術(shù)中，乳劑可在某一溫度下制備，該溫度必須較系統(tǒng)的相轉(zhuǎn)移溫度要高。在較高溫度條件下，該乳劑為油包水(w/o)形式，而在相轉(zhuǎn)移溫度下冷卻時，該乳劑則反轉(zhuǎn)為o/w。由于其內(nèi)相非常小，所以它們極其穩(wěn)定，可用于類固醇和疫苗的緩釋。脂質(zhì)乳劑包含中性脂質(zhì)核心(即甘油三酯)，所述核心通過表面活性劑如卵磷脂甘油三酯和miglyol而被兩親脂質(zhì)(即磷脂)的單分子層穩(wěn)定化。它們適合被動乾向和主動耙向。也研究了其它口服送遞系統(tǒng)，所述系統(tǒng)以滲透壓調(diào)整、pH調(diào)整、溶漲調(diào)整、改變的密度和浮動系統(tǒng)(densityandfloating),粘附性(mucoadhesiveness)等為基礎(chǔ)。當(dāng)前正在使用或研究的依據(jù)疾病的晝夜規(guī)律送遞藥物的這些制劑和緩釋制劑菌可用來送遞本文公開的組合物。在一個本文公開的具體方面，所公開化合物(包括營養(yǎng)添加劑及其藥物制劑)可如本文所述被摻入微嚢中。在本文公開的一個方面，所公開化合物可被摻入微嚢中。一方面，微嚢含有基本(primary)微嚢的聚集物(agglomeration)和本文所述的鉻化合物，每個基本微嚢個體具有一個主殼(primaryshell),其中所述鉻化合物被所述主殼包封，其中所述聚集物被外殼包封。這些微嚢在本文中被稱為"多核孩史嚢"。另一方面，本文描述了包括鉻化合物、主殼和輔殼的微嚢，其中所述主殼包封鉻化合物，而所述輔殼包封負載物質(zhì)和主殼。這些微嚢在本文中被稱為"單核微嚢"。任選地，其它負載物質(zhì)可與鉻化合物一起被包封。負載物質(zhì)可為在水性混合物中不完全溶解的任何物質(zhì)。一方面，負載物質(zhì)為固體、疏水液體或固體和疏水液體的混合物。另一方面，負載物質(zhì)含有脂肪、油類、脂質(zhì)、藥物(如小分子)、生物活性物質(zhì)、營養(yǎng)添加劑(如維生素)、香味化合物或它們的混合物。油類的實例包括但不限于動物油(如魚油、海生哺乳動物油等)、植物油(如油菜籽油或菜籽油)、礦物油、其書f生物或它們的混合物。負栽物質(zhì)可為純化的或部分純化的油性物質(zhì)如脂肪酸或其酯、甘油三酯、或它們的混合物。另一方面，負載物質(zhì)可為類胡蘿卜素(如番茄紅素)、填充劑(satietyagent)、香"未化合物、藥物(如非7JC溶性藥物)、顆粒、農(nóng)用化合物(如除草劑、殺蟲劑、肥料)或水產(chǎn)養(yǎng)殖成分(如飼料、色素)。一方面，負載物質(zhì)可為co-3脂肪酸。(o-3脂肪酸的實例包括但不限于a-亞麻酸(18:3n3)、十/\碳四烯酸(18:4n3)、二十碳五烯酸(20:5n3)(EPA)、二十二碳六烯酸(22:6n3)(DHA)、二十二碳五烯酸(22:5n3)(DPA)、二十碳四烯酸(20:4n3)、二十一碳五烯酸(21:5n3)、二十二碳五烯酸(22:5n3),以及它們的衍生物及它們的混合物。co-3脂肪酸的多類衍生物為本領(lǐng)域所熟知。合適的衍生物的實例包括但不限于酯類例如植物甾醇酯、支鏈或直鏈d-C3。烷基酯、支鏈或直鏈C2-C3。烯基酯、或者支鏈或直鏈C3-C3。環(huán)烷基酯(如植物甾醇酯)和C廣C6烷基酯。油源可來自水生物(如沙丁魚、毛鱗魚、大西洋鱈、大西洋緋、大西洋鯖、大西洋鯡魚、鮭魚、沙丁魚、鯊魚、鮪魚等)和植物(如亞麻、蔬菜等)和微生物(如真菌和藻類)。一方面，負栽物質(zhì)可含有抗氧化劑?？寡趸瘎┑膶嵗ǖ幌抻诰S生素E、CoQw、生育酚、極性更強的抗氧化劑的脂溶性衍生物如抗壞血酸脂肪酸酯(如抗壞血酸棕櫚酸酯)、植物提取物(如迷迭香油、鼠尾草油和牛至油)、海藻提取物和合成抗氧化劑(如BHT、TBHQ、乙氧喹、烷基沒食子酸酯、氫醌、生育三烯酸)。許多不同的聚合物可用于生產(chǎn)單核微嚢和多核微嚢的殼層。這類聚合物的實例包括但不限于蛋白質(zhì)、聚磷酸酯、多糖或它們的混合物。另一方面，用于制備單核微嚢和多核微嚢的殼材進一步包括A型明膠、B型明膠、聚磷酸酯、阿拉伯膠、藻酸鹽、殼多糖、角叉菜膠、果膠、淀粉、變性淀粉、a-乳清蛋白、p-乳球蛋白(lactoglobumin)、卵清蛋白、聚山梨酯(polysorbiton)、麥芽糊精、環(huán)糊精、纖維素、甲基纖維素、乙基纖維素、羥丙曱基纖維素(hydropropylmethylcellulose)、羧甲基纖維素、乳蛋白質(zhì)、乳清蛋白、大豆蛋白、油菜籽蛋白、白蛋白、曱殼質(zhì)、聚丙交酯、聚-丙交酯-共-乙交酯、衍生的曱殼質(zhì)、殼多糖、聚賴氨酸、各種無機-有機復(fù)合材料、或它們的任何混合物。同樣慮及的是這些聚合物的衍生物也可使用。另一方面，聚合物可為kosher明膠、non-kosher明膠、Halal明膠或non-Halal明膠。一方面，單核微嚢和多核微嚢中一層或多層殼層含有Bloom值小于50的明膠。該明膠在本文中被稱為"低Bloom明膠，，。Bloom值描述了6.67%的溶液在IOX:膠化18小時時形成的凝膠強度。一方面，低Bloom明膠的Bloom值低于40、低于30、低于20或低于10。另一方面，明膠的Bloom值為45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、l或0，其中任何兩個數(shù)值可用來形成一個范圍。另一方面，低Bloom明膠存在于多核微嚢的主殼和外殼兩者之中。一方面，低Bloom明膠為A型明膠。另一方面，寸氐Bloom明膠為Kenney&RossLtd.,R.R.#3Shelburne，NSCanada生產(chǎn)的A型明膠。另一方面，在多核微嚢的主殼和外殼之中均存在Bloom值為零的明膠。一方面，用于制備單核微嚢或多核微嚢的殼層的材料為由兩類不同聚合物的混合物所制備得到的二組分系統(tǒng)。一方面，該材料為聚合物組分之間的復(fù)合凝聚層。復(fù)合凝聚作用是由于兩種帶有相反電荷的聚合物之間的相互作用所致。一方面，用于生產(chǎn)單核^t嚢和多核孩i:嚢的殼材由以下物質(zhì)構(gòu)成(1)低Bloom明膠和(2)B型明膠、聚磷酸酯、阿拉伯膠、藻酸鹽、殼多糖、角叉菜膠、果膠、羧曱基纖維素、乳清蛋白、大豆蛋白、油菜籽蛋白、白蛋白或它們的任何混合物。不同聚合物的摩爾比可有所變化。例如，低Bloom明膠和其它聚合物組分的摩爾比為1:5至15:1。例如，在使用低Bloom明膠和聚磷酸酯時，低Bloom明膠和聚磷酸酯的摩爾比為約8:1至約12:1;在使用低Bloom明膠和B型明膠時，摩爾比為2:1至1:2;而在使用低Bloom明膠和藻酸鹽時，摩爾比為3:1至8:1。殼材(如主殼或外殼)中可包含有操作助劑。操作助劑的使用可有多種原因。例如，它們可用于促進基本^t嚢的凝聚、穩(wěn)定乳液系統(tǒng)、改善外殼的性質(zhì)、控制微嚢大小和/或用作抗氧化劑。一方面，操作助劑可為乳化劑、脂肪酸、脂質(zhì)、蠟、微生物細胞(如酵母細胞系)、粘土或無機化合物(如碳酸鈉)。并不希望受綽于理論，但是這些操作助劑可促進微嚢的屏障性。一方面，可將一種或多種抗氧化劑加入殼材中。抗氧化性在加工期間(如在凝聚和/或噴霧干燥期間)以及在形成之后的微嚢中均是有用的(即延長殼壽命等)。優(yōu)選使用起多種作用的少量操作助劑。一方面，抗氧化劑可為酚化物、植物提取物或含硫氨基酸。一方面，抗壞血酸(或其鹽例如抗壞血酸鈉或抗壞血酸鉀)可用來促進基本微嚢的凝聚、控制微嚢大小和用作抗氧化劑。抗氧化劑可使用的量為約100卯m至約12,000ppm，或者約1，000ppm至約5，000ppm。其它操作助劑例如金屬螯合物也可使用。例如，乙二胺四乙酸可用來結(jié)合金屬離子，該金屬離子可降低負載物質(zhì)的催化氧化作用。一方面，基本微嚢(主殼)的平均直徑為約40nm至約10jam、0.1|im至約10pm、1pm至約10jim、1iLim至約8ym、1jum至約6jum、1ym至約4jim或ljim至約2jam,或者1jim。另一方面，多核孩吏嚢的平均直徑為約ljam至約2000Mm、20pm至約1000lim、約20pm至約100jim或約30jLim至約80pm。另一方面，單核微嚢的外徑為約1pm至2，000jim。本文所述的微嚢通常同時具有高的有效負荷和結(jié)構(gòu)強度。例如，負載物質(zhì)的有效負荷以重量計占單核^L嚢或多核^:嚢的20%至90%、50%至70%或者以重量計占60%。一方面，美國專利申請公開文本No.2003/0193102(通過援引全文納入)所公開的方法可用來包封本文所述鉻化合物。同樣考慮到的是在單核微嚢或多核微嚢的外殼上可擱置一層或多層額外的殼層。一方面，國際申請公開文本No.WO2004/041251Al(通過援引全文納入)所述的技術(shù)可用于將額外的殼層附加至單核微嚢和多核微嚢。a)藥物組合物和營養(yǎng)組合物這些脂質(zhì)和抗氧化劑旨在用于動物飼料、藥物制劑、營養(yǎng)制品(尤其是嬰兒配方)以及用于工業(yè)生產(chǎn)中。這也同樣包括營養(yǎng)制品的送遞形式如凝膠膠嚢和常見的微嚢化等。如上所述，組合物也可以以可藥用載體形式用于體內(nèi)給藥。"可藥用，，指的是某種物質(zhì)并不會在生物學(xué)上或其它方面引起不良反應(yīng)，即該物質(zhì)可與核酸或載體一起給予受試者，而不會引起任何不良生物學(xué)影響或以有害方式與含有該物質(zhì)的藥物組合物的任何其它組分相互作用。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的那樣，必然會對載體進行選擇，從而使得活性成分降解最少，并使其對于受試者的不良副作用最小化。組合物可通過口服、胃腸外(如靜脈內(nèi))途徑、肌內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射、經(jīng)皮、體外、局部途徑等給藥，包括局部鼻內(nèi)給藥或通過吸入器給藥。本文所使用的"局部鼻內(nèi)給藥，，指的是通過一個或兩個鼻孔將組合物送遞至鼻內(nèi)或鼻道，可包括通過噴霧機制或滴注機制或通過霧化核酸或載體來送遞。通過吸入器給予組合物可經(jīng)由通過噴霧或滴注機制的送遞通過鼻或嘴進行。送遞還可經(jīng)由插管法直接到達呼吸系統(tǒng)(如肺)的任何區(qū)域。所需要的組合物的確切量因受試者而異，這取決于受試者的物種、年齡、體重和整體狀況、被治療的變態(tài)性紊亂的嚴重程度、所使用的具體核酸或載體、其給藥模式等。因此，不能對每種組合物的確切量進行規(guī)定。但是，合適的量可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在考慮本文的教導(dǎo)的情況下僅使用常規(guī)實驗就能確定。若使用組合物的胃腸外給藥，那么其特征通常在于通過注射給藥。注射劑可制備為常規(guī)形式(液體溶液或懸液)、適合在注射前配制成懸浮于液體中的溶液的固體形式或乳液形式。新近作出改進的胃腸外給藥方法包括使用緩釋系統(tǒng)以維持恒定劑量。參見例如美國專利No.3,610,795,通過援引將其納入本文。該物質(zhì)可存在于溶液、懸液(例如被摻入至微粒、脂質(zhì)體或細胞中)中。這些物質(zhì)可經(jīng)由抗體、受體或受體配體靶向特定的細胞類型。以下參考文獻是利用該技術(shù)來將特定蛋白靶向肺瘤組織的實例(Senter，etal.，feC力e邁.，2:447-451，1991;Bagshawe，LD"Br./Ca/7cer，60:275-281,1989;Bagshawe，etal.,/.Ca/cer，58:700-703,1988;Senter，etal.，A/oco/7j^"eC力e邁.,4:3-9，1993;Battelli，etal.，Ca刀cer7izazw/70厶//aaw/7c^力er.，35:421—425,1992;PieterszandMcKenzie，齡/ew，129:57-80,1992和Roffler，etal"A/oc力e瓜戶力ar邁aco/.,42:2062-2065,1991)。運載體例如"Stealth"和其它抗體綴合的脂質(zhì)體(包括介導(dǎo)藥物靶向結(jié)腸癌的脂質(zhì))、通過細胞特異性配體介導(dǎo)DNA靶向的受體、引導(dǎo)腫瘤靶向的淋巴細胞和鼠體內(nèi)M瘤(glicoma)細胞的高度特異性治療性反轉(zhuǎn)錄病毒靶向。以下參考文獻是利用該技術(shù)來將特定蛋白靶向腫瘤組織的實例(Hughesetal.,Ca/cerbearc力，49:6214-6220，1989);和LitzingerandHuang,"/oc力/邊/ca"A/opAm'caJc&，1104:179-187,1992)。總之，受體以組成型方式或配體誘導(dǎo)方式參與到胞吞途徑中。這些受體密集于網(wǎng)格蛋白小窩中，經(jīng)由籠形蛋白包裹的小泡進入細胞，穿過酸化內(nèi)體(受體在其中被分選)，隨后或者再循環(huán)至細胞表面被儲存于細胞內(nèi)，或者在溶酶體中被降解。內(nèi)化途徑起著多種作用，例如營養(yǎng)物質(zhì)的攝入、活化蛋白的除去、大分子的清除、病毒和毒素的機會性進入、配體的解離和降解以及受體水平的調(diào)節(jié)。很多受體遵循一種以上的胞內(nèi)途徑，這取決于細胞類型、受體濃度、配體類型、配體效價和配體濃度。受體介導(dǎo)的胞吞作用的分子和細胞機制已有綜述(BrownandGreene,細a/^/Ce//"/o/柳10:399-409,1991)。(l)可藥用載體包含抗體的組合物可與可藥用載體聯(lián)合用于治療。合適的載體及其制劑描述于We/z//^^o/7.'7Xe5t/e/cea/cT尸rac〃ceoT/^r鵬C7(19thed.)ed.A.R.Geimaro，MackPublishingCompany,Eastern,PA1995。通常，可在制劑中使用恰當(dāng)量的可藥用鹽以確保制劑等滲?？伤幱幂d體的實例包括但不限于鹽水、Ringer's溶液和葡萄糖溶液。溶液的pH優(yōu)選為約5至約8，更優(yōu)選約7至約7.5。其它載體包括緩釋制劑例如含有抗體的固態(tài)疏水聚合物的半透性基質(zhì)，該基質(zhì)為具有一定形狀的顆粒形式，例如薄片、脂質(zhì)體或微粒形式等。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見的是，某些載體更為優(yōu)選，這取決于例如給藥途徑和被給藥組合物的濃度。藥物載體為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。它們最通常為將藥物給予人的標準載體，包括溶液例如無菌水、鹽水和生理pH的緩沖溶液。組合物可經(jīng)肌內(nèi)或皮下途徑給藥。其它化合物可依據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員所使用的標準方法給予。除了所選分子之外，藥物組合物還可包含載體、增稠劑、稀釋劑、緩沖劑、防腐劑、表面活性劑等。藥物組合物還可包含一種或多種活性成分例如抗微生物劑、抗炎劑、麻醉劑等。藥物組合物可以多種方式給藥，這取決于是需要局部治療還是全身治療以及待治療區(qū)域?？赏ㄟ^局部途徑(包括眼部途徑、陰道途徑、直腸途徑)、口服途徑、吸入途徑或腸胃外途徑給藥，例如通過靜脈內(nèi)滴注、皮下注射、腹膜內(nèi)注射或肌內(nèi)注射給藥。所公開抗體可通過靜脈內(nèi)途徑、腹膜內(nèi)途徑、肌內(nèi)途徑、皮下途徑、腔內(nèi)或經(jīng)皮途徑給藥。胃腸外給藥制劑包括無菌水溶液或非水溶液、懸液和乳液。非水溶劑的實例為丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄欖油)和可注射的有機酯(如油酸乙酯)。水性載體包括水、酒精溶液/水溶液、乳液或懸液，包括鹽水和緩沖介質(zhì)。胃腸外運載體包括氯化鈉溶液、Ringer，s葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉、乳酸Ringer's或不揮發(fā)性油。靜脈內(nèi)運載體包括流體和營養(yǎng)補充劑、電解質(zhì)補充劑(例如以Ringer，s葡萄糖為基礎(chǔ)的那些電解質(zhì)補充劑)等。也可存在防腐劑和其它添加劑，例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體等。局部給藥制劑可包含軟膏劑、洗劑、膏劑、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體和粉劑。常規(guī)藥物載體、水性基質(zhì)、粉劑基質(zhì)或油性基質(zhì)、增稠劑等可能是必不可少的或需要的?？诜o藥組合物包含溶于水或非水介質(zhì)中的粉劑或顆粒劑、懸液或液體、膠嚢、嚢劑或片劑。增稠劑、調(diào)味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或粘合劑可能是需要的。一些組合物有可能以可藥用酸加成鹽或堿加成鹽形式給藥是有效的，所述加成鹽通過與無機酸(如鹽酸、氳溴酸、高氯酸、硝酸、辟u氰酸、減<酸和磷酸等)和有機酸(如曱酸、乙酸、丙酸、羥乙酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、馬來酸和富馬酸等)反應(yīng)形成，或通過與無;tM^(如氫氧化鈉、氫氧化銨、氫氧化鐘等)和有機堿(如單烷基胺、二烷基胺、三烷基胺和芳基胺以及取代的乙醇胺等)反應(yīng)形成。(2)治療用途有效劑量和組合物的給藥方案可依據(jù)經(jīng)驗確定，并且做出這類決定是在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍內(nèi)的。組合物給藥的劑量范圍為大到足以產(chǎn)生其中癥狀紊亂得到治療的所需療效的那些劑量范圍。劑量不應(yīng)大到引起不良副作用，例如不良交叉反應(yīng)、過敏性反應(yīng)等。通常，劑量會隨以下因素而異患者年齡、病癥、性別和疾病嚴重程度、給藥途徑，或者給藥方案中是否包含其它藥物，并且可由本領(lǐng)域技術(shù)人員來確定。若出現(xiàn)任何禁忌癥，則該劑量可由各個醫(yī)師來調(diào)整。劑量可有所變化，并且可每日以單劑或多劑給藥形式給予，持續(xù)一天或幾天。指定類別藥劑的合適劑量的指南可參見文獻。例如，選擇合適的抗體劑量的指南可參見關(guān)于抗體的治療用途的文獻，如HandbookofMonoclonalAntibodies,Ferroneetal,,eds.，NogesPublications,ParkRidge,NJ"(1985)ch.22andpp.303-357;Smithetal"AntibodiesinHumanDiagnosisandTherapy,Haberetal.,eds.，RavenPress,NewYork(1977)pp.365-389。單3蟲4吏用的抗體的典型每日劑量為每天約1/ag/kg至最高至100mg/kg體重或更多，這取決于上述因素。b)乾向送遞所公開脂質(zhì)體和微嚢可經(jīng)由抗體、受體或受體配體被乾向至特定細胞類型如胰島細胞。以下的參考文獻是為利用該技術(shù)來靶向特定組織的實例(Senter，etal,"2'oco/7j7/g"eC力e/s2:447-51，1991;Bagshawe，/C腐e/"60:275-81，1989;Bagshawe，etal，Ar/Ca/7cer58:700-3，1988;Senter，etal，"/oco/7力g"eC力e邁4:3_9，1993;Battelli，etal，Ca/7cer/咖w/o/i/ffizw//70^e_r35:421—5，1992;PieterszandMcKenzie，/腳,/。g129:57-80，1992和Roffler，etal，A/oc力e/z戶力ar邁aco/42:2062-5，1991)。這些技術(shù)可用于各種其它特定的細胞類型。8.食品本文還公開了含有本文所公開的任一微嚢和乳液的食品。"食品"指的是可由受試者服用(如吃、喝或攝取)的任何物質(zhì)。一方面，微嚢可用作食品的營養(yǎng)添加劑。例如，微嚢和乳液可裝載有維生素、co-3脂肪酸和對健康有益的其它化合物。一方面，食品可為烘焙食品、面食、肉制品、冷凍乳制品、乳制品、奶酪制品、蛋制品、調(diào)味品、湯粉、點心、堅果制品、植物蛋白制品、硬糖、軟糖、家禽產(chǎn)品、經(jīng)加工的果汁、砂糖(如白砂糖或赤砂糖)、醬油、肉汁、糖漿、營養(yǎng)飲品、飲料、飲料干粉、果醬或果凍、魚制品或?qū)櫸锇閭H食品。另一方面，食品為面包、玉米餅、谷類食品、香腸、雞肉、冰淇淋、酸奶、牛奶、沙拉調(diào)味料、米糠、果汁、飲料干粉、面包巻、餅干、薄脆餅干、快餐、水果餡餅或蛋糕。9.芯片和微陣列公開了其中至少有一部分地址為本文所公開任一核酸序列中所列出的序列或序列的一部分的芯片。還公開了其中至少有一部分地址為本文所公開任一肽序列中所列出的序列或序列的一部分的芯片。還公開了其中至少有一部分地址為本文所公開任一核酸序列中所列出的序列或序列的一部分的變體的芯片。還公開了其中至少有一部分地址為本文所公開任一肽序列中所列出的序列或序列的一部分的變體的芯片。10.計算機可讀介質(zhì)可以理解的是，所公開的核酸和蛋白質(zhì)可表示為由氨基酸的核苦酸組成的序列。存在多種方法來顯示這些序列，例如，核苷酸鳥香可表示為G或g。同樣，氨基酸纈氨酸可表示為Val或V。本領(lǐng)域的技術(shù)人員明白如何以所存在的多種方式中的任何一種方式(每種方式均被認為在本文中公開)顯示和表達任一核酸或蛋白序列。在本文中特別考慮的是將這些序列顯示于計算機可讀介質(zhì)，例如可商購的軟盤、磁帶、芯片、硬盤、光盤和視盤或其它計算機可讀介質(zhì)。還公開了所公開序列的二進制代碼表示方法。本領(lǐng)域的技術(shù)人員明白是何種計算機可讀介質(zhì)。因此，這種計算機可讀介質(zhì)記錄、儲存或保存了核酸或蛋白序列。公開了記載有本文所列出的序列和與這些序列相關(guān)的信息的計算機可讀介質(zhì)。11.試劑盒文所爿>開組合物的試劑的試劑盒。該試劑盒可包含本文所討論的或者,皮認如，該試劑盒可包括本文所公開的一種或多種真核微生物以及例如用于培養(yǎng)它們的培養(yǎng)基。該試劑盒還包括例如脂質(zhì)或抗氧化劑以及使用或者給予這些物質(zhì)的工具。12.具有相似功能的組合物可以理解的是，本文所公開組合物具有某些功能，例如產(chǎn)生一定比率的脂質(zhì)。本文公開了實現(xiàn)所公開功能的某些結(jié)構(gòu)方面、遺傳方面和功能方面的要求，并且可以理解的是，存在多種能實現(xiàn)與所公開結(jié)構(gòu)相關(guān)的相同功能的結(jié)構(gòu)、遺傳背景以及的功能背景，并且這些結(jié)構(gòu)最終會獲得相同的結(jié)果，例如產(chǎn)生一定比率的脂質(zhì)。D.制備組合物的方法除非另外明確指明，否則本文所公開組合物和進行所公開方法必不可少的組合物，可通過使用采用該具體試劑或化合物的本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法制備得到。1.核酸合成例如，核酸例如預(yù)備用作引物的寡核苷酸可使用標準化學(xué)合成法制備得到，或者使用酶促法或任何其它已知方法產(chǎn)生。這類方法包括在標準的酶消化之后進行核苷酸片段分離(參見例如Sambrooke,a/，C7o/7//7fJZa6orafor/#a/"a/，2ndEdition(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y"1989)Chapters5，6)和純粹的合成法，例如通過采用Milligen或BeckmanSystemlPlusDNA合成4義(例如Milligen-Biosearch的型號為8700的自動合成儀，Burlington,MA或ABI380B型)的氰乙基磷酰胺酸法。用于制備寡核普酸的合成法同樣描述于Ikutae"/"j肌齡.A/oc力e瓜53:323-356，1984,(磷酸三酯法和亞磷酸三酯法)和Naranga/.,#e^o&i>7Z7270,,65:610-620，1980,(磷酸三酯法)。蛋白核酸分子可使用已知方法例如由Nielsena/.,》/oco/y塔.5:3-7，1994所描述的那些方法來制備。2.肽合成產(chǎn)生所公開蛋白質(zhì)的一種方法是通過蛋白化學(xué)技術(shù)將兩個或多個肽或多肽連接起來。例如，肽或多肽可使用現(xiàn)有的實騶4殳備、采用Fmoc(9-芴曱氧羰基)或Boc(叔丁氧羰基)化學(xué)制品(AppliedBiosystems，Inc.,FosterCity,CA)化學(xué)合成。本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，與所公開蛋白質(zhì)相對應(yīng)的肽或多肽可通過例如標準化學(xué)反應(yīng)合成。例如，可合成某種肽或多肽并且不將其從其合成樹脂上切割下來，而可合成其它的肽或蛋白片段并在隨后將其從樹脂上切割下來，由此暴露出在其它片段上功能被阻斷的末端基團。通過肽縮合反應(yīng)，這兩個片段可經(jīng)由肽鍵分別在其羧基末端和氨基末端共價連接，從而形成抗體或其片段(GrantGA(1992)SyntheticP印tides:AUserGuide.W.H.FreemanandCo"N.Y.(1992);BodanskyMandTrostB.，Ed.(1993)PrinciplesofPeptideSynthesis.Springer-VerlagInc.,NY(至少就其與肽合成相關(guān)的內(nèi)容將其納入本文))?；蛘撸幕蚨嚯娜绫疚乃鲈隗w內(nèi)獨立合成。在分離后，這些相互獨立的肽或多肽可經(jīng)由相似的肽縮合反應(yīng)被連接起來形成肽或其片段。例如，克隆得到或合成的肽區(qū)段的酶學(xué)連接使得相對較短的肽片段可被連接起來產(chǎn)生較大的肽片段、多肽或全部蛋白結(jié)構(gòu)域(AbrahmsenLetal.,A/oc力e巡/5^r7,30:4151，1991)?；蛘?，可利用合成肽的天然化學(xué)連接由較短的肽片段合成構(gòu)建大的肽或多肽。這種方法由兩步化學(xué)反應(yīng)組成(Dawsonetal.Sc/e/2ce，266:776-779，1994)。第一步是沒有保護的合成肽-硫酯與另一種沒有保護的含氨基端Cys殘基的肽區(qū)段之間發(fā)生化學(xué)選擇反應(yīng)，從而產(chǎn)生作為初始共價產(chǎn)物、與硫酯連接的中間產(chǎn)物。在不改變反應(yīng)條件的情況下，該中間產(chǎn)物會經(jīng)歷自發(fā)的、快速的分子內(nèi)反應(yīng)，從而在連接位點形成天然肽鍵(BaggioliniMetal.Z^A9Ze".307:97-101，1992;Clark-LewisIetal.，/."2.0/.C力e邁.，269:16075，1994jClarkHLewisIetal"A/oc力e巡/"/y，30:3128，1991jRajarathnamKetal.，"/oc力e邁/'"/y33:6623-30，1994)。或者，沒有保護的肽區(qū)段可以化學(xué)方式連接，其中由于化學(xué)連接而在肽區(qū)段之間形成的鍵是非天然(非肽)鍵(Schnolzer，Metal.5t/e/ce，256:221，1992)。該技術(shù)已被用于合成蛋白結(jié)構(gòu)域的類似物以及大量相對較純、具有完全生物活小生的蛋白質(zhì)(deLisleMilton-RC-etinProteinChemistryIVTAcademicPress,NewYork,pp.257-267，1992)。3.制備組合物的方法公開了制備組合物以及制備獲得該組合物的中間產(chǎn)物的方法。例如，公開了可產(chǎn)生所需脂質(zhì)和抗氧化劑的真核微生物以及分離和純化所需脂質(zhì)和抗氧化劑的方法。存在多種可用于制備這些組合物的方法，例如合成化學(xué)法和標準分子生物學(xué)方法?？梢岳斫獾氖?，制備這些和其它所公開組合物的方法被具體公開。公開了通過用任一核酸轉(zhuǎn)化細胞的方法產(chǎn)生得到的細胞。公開了通過用任一非天然存在的所公開核酸轉(zhuǎn)化細胞的方法產(chǎn)生得到的細胞。公開了由所公開真核微生物產(chǎn)生得到的任何一種脂質(zhì)。公開了通過在所公開生物體中表達肽的方法產(chǎn)生得到的任何一種肽。公開了使用組合物的方法4.將組合物用作研究工具的方法所公開組合物可以各種方式被用作研究工具，并且用于產(chǎn)生例如脂質(zhì)和抗氧化劑。如本文所述，所公開組合物既可用作微陣列中的試劑，也可用作研究或分析現(xiàn)有微陣列的試劑。所公開組合物可用于分離或鑒定單核苷酸多態(tài)性的任何已知方法中。組合物還可用于確定例如本文所公開生物體菌林的任何等位基因分析方法中，尤其是等位基因分析，原因在于它與脂質(zhì)和抗氧化劑的產(chǎn)生相關(guān)。組合物還可用于與芯片/微陣列相關(guān)的任何已知的篩選分析方法中。組合物還可用于使用所公開組合物的計算機可讀裝置的任何已知方法，從而例如研究相關(guān)性或進行與所7>開組合物相關(guān)的分子建模分析。5.基因修飾和基因破壞方法所公開組合物和方法在可經(jīng)歷這些事件的任何動物中用于靶向的基因破壞和基因修飾?；蛐揎椇突蚱茐闹傅氖且赃x擇性除去或改變生物體例如本文所公開真核生物中的基因或一段染色體為目的的方法、技術(shù)和組合物，其方式是通過生物體的復(fù)制來延續(xù)這種修飾作用。通常，例如，用被設(shè)計為可與細胞內(nèi)所包含的具體染色體或核酸的某一區(qū)域同源重組的載體來轉(zhuǎn)化例如本文所述的細胞。該同源重組事件可產(chǎn)生含有被導(dǎo)入至讀碼框的外源DM并且具有周圍DNA的染色體。這種類型的實驗方案4吏得可以將特異性很高的突變(例如點突變)導(dǎo)入細胞中所包含的基因組中。進4亍這種類型的同源重組的方法也在本文7>開。實施方案本文公開了具有18S序列的真核微生物，其中所述18S序列與SEQIDN0:1列出的序列具有至少94%的同一性。該真核微生物可產(chǎn)生具有圖2所示生產(chǎn)情況的不飽和脂肪酸。該真核微生物來自網(wǎng)黏菌門、網(wǎng)黏菌綱、破嚢壺菌亞綱、破嚢壺菌目、破嚢壺菌科和/或破嚢壺菌屬。該真核微生物可為破嚢壺菌屬種、金黃破嚢壺菌、粉紅破嚢壺菌或紋狀破嚢壺菌。該真核微生物還可來自破嚢壺菌科并且具有ATCC編號20888、20889、20890、20891或20892。本文還公開了具有18S序列的真核微生物，其中所述18S序列與SEQIDN0:1列出的序列具有至少94°/的同一性，其中所述微生物來自裂殖壺菌屬。該真核微生物可為裂殖壺菌屬種。本文還公開了具有18S序列的真核微生物，其中所述18S序列與SEQIDNO:l列出的序列具有至少94%的同一性，其中該真核孩吏生物含有co-3或(o-6脂肪酸。該真核^t生物還可含有DHA或DPA。本文還公開了具有18S序列的真核微生物，其中所述18S序列與SEQIDN0:1列出的序列具有至少94°/。的同一性，其中該微生物所產(chǎn)生的脂質(zhì)或脂肪酸組分為至少約4wt。/。至6wt%。所述脂質(zhì)可含有DHA。脂質(zhì)組合物還可含有占約25wt。/。脂肪酸組分至約40wt。/。脂肪酸組分的n-3DHA、占約6wt。/。脂肪酸組分至約10w"/。脂肪酸組分的n-6DPA以及占約0wt%脂肪酸組分至約3wt"/。脂肪酸組分的n-3EPA。還公開了包含具有18S序列的真核微生物的組合物，其中所述18S序列與SEQIDNO:1列出的序列具有至少94%的同一性。該組合物可進一步包含有培養(yǎng)基和/或營養(yǎng)物質(zhì)。還公開了包含具有18S序列的真核微生物的組合物，其中所述18S序列與SEQIDNO:1列出的序列具有至少94°/。的同一性，其中所述組合物為生物量。組合物中的真核微生物可來自網(wǎng)勦菌門、網(wǎng)翁菌綱、破嚢壺菌亞綱、破嚢壺菌目、破嚢壺菌科或破嚢壺菌屬。該真核微生物可為破嚢壺菌屬種、金黃破嚢壺菌、粉紅破嚢壺菌或紋狀破嚢壺菌。該真核微生物還可來自破嚢壺菌科并且具有ATCC編號20888、20889、20890、20891或20892。還公開了包含具有18S序列的真核微生物的組合物，其中所述18S序列與SEQIDN0:1列出的序列具有至少94%的同一性，其中所述真核樹:生物來自裂殖壺菌屬。該真核微生物可為裂殖壺菌屬種。還公開了包含具有18S序列的真核微生物的組合物，其中所述18S序列與SEQIDNO:1列出的序列具有至少94%的同一性，該真核微生物可產(chǎn)生具有圖2所示生產(chǎn)情況的不飽和脂肪酸。該不飽和脂肪酸含有co-3或w-6脂肪酸。該不飽和脂肪酸還含有DHA或DPA。還公開了包含具有18S序列的真核微生物的組合物，其中所述18S序列與SEQIDNO:1列出的序列具有至少94%的同一性，其中該真核^:生物所產(chǎn)生的脂質(zhì)或脂肪酸組分為至少約4w"至6wt、所述脂質(zhì)可含有DHA。脂質(zhì)組合物還可含有占約25w"/。脂肪酸組分至約40wt。/。脂肪酸組分的n-3DHA、占約6wt。/。脂肪酸組分至約10wt。/。脂肪酸組分的n-6DPA以及占約0wt。/。脂肪酸組分至約3wt"/。脂肪酸組分的n-3EPA。還公開了包含具有18S序列的真核微生物的組合物，其中所述18S序列與SEQIDNO:1列出的序列具有至少80%的同一性。還公開了組合物，所述組合物含有占約25wty。脂肪酸組分至約40wt%脂肪酸組分的n-3DHA、占約6wt。/。脂肪酸組分至約10w"脂肪酸組分的n-6DPA以及占約0wt。/n脂肪酸組分至約3wt。/。脂肪酸組分的n-3EPA。還公開了制備脂質(zhì)組合物的方法，所述方法包括在異氧培養(yǎng)基中培養(yǎng)本文所述的真核微生物，并分離該脂質(zhì)組合物。還公開了根據(jù)該方法制備得到的脂質(zhì)組合物。還公開了包含有上述任一組合物的送遞裝置。例如，公開了一種送遞裝置，所述送遞裝置包含有具有18S序列的真核微生物的組合物，其中所述18S序列與SEQIDN0:1列出的序列具有至少94%的同一性。該送遞裝置可包括樣t嚢、微球、納米球或納米顆粒、脂質(zhì)體、noisome、納米紅質(zhì)體、固體-液體納米顆粒、亮丙瑞林、凝膠、凝膠膠嚢、片劑、洗劑、膏劑、噴霧劑、乳劑或粉劑。還公開了包含基本微嚢的聚集物和負載物質(zhì)的微嚢，各個基本微嚢個體均具有主殼，其中所述負載物質(zhì)含有任一上述組合物，并被主殼包封，并且其中所述聚集物被外殼包封。主殼和/或外殼可包含表面活性劑、明膠、聚磷酸酯、多糖或它們的混合物。主殼和/或外殼還可包含B型明膠、聚磷酸酯、阿拉伯膠、藻酸鹽、殼多糖、角叉菜膠、果膠、淀粉、變性淀粉、ot-乳清蛋白、p-乳球蛋白(lactoglobumin)、卵清蛋白、聚山梨酯(polysorbiton)、麥芽糊精、環(huán)糊精、纖維素、曱基纖維素、乙基纖維素、羥丙曱基纖維素(hydropropylmethylcellulose)、羧曱基纖維素、乳蛋白質(zhì)、乳清蛋白、大豆蛋白、油菜籽蛋白、白蛋白、kosher明膠、non-kosher明膠、Halal明膠或non-Halal明膠、或它們的混合物。主殼和/或外殼還可包含復(fù)合凝聚層、A型明膠、魚明膠、Bloom值為約0至約300的明膠、Bloom值為約0至約50的明膠、Bloom值為約51至約300的明膠、Bloom值為約O、約210、約220或約240的明膠、明膠和聚磷酸酯的凝聚層。所公開微嚢的裝載物質(zhì)可包含來自破嚢壺菌、裂殖壺菌或它們的混合物的油。該裝載物質(zhì)以重量計為微嚢的約20%至約90°/?；?0%至約70%。所公開^L嚢的外殼其平均直徑為約lpm至約2000pm、約20pm至約1000ym、約30ym至約80ym、約40jum至約10jum或約0.1jum至約5jum。還公開了包含任一上述組合物、送遞裝置或微嚢的營養(yǎng)添加劑。所7>開營養(yǎng)添加劑為片劑、凝膠膠嚢、膠嚢、液體或糖漿形式。還公開了包含任一上述組合物、送遞裝置或微嚢的食品。該食品可為烘丈咅食品、面食、肉制品、冷凍乳制品、乳制品、奶酪制品、蛋制品、調(diào)味品、湯粉、點心、堅果制品、植物蛋白制品、硬糖、軟糖、家禽產(chǎn)品、經(jīng)加工的果汁、砂糖、醬油、肉汁、糖漿、營養(yǎng)飲品、飲料、飲料干粉、果醬或果凍、嬰兒配方或嬰兒食品。該食品還可為魚肉制品、寵物伴倡食品、家畜飼料或水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料。食品還可為面包、玉米餅、谷類食品、香腸、雞肉、冰洪淋、酸奶、牛奶、沙拉調(diào)味料、米糠、果汁、飲料干粉、面包巻、餅干、薄脆餅干、快餐、水果餡餅或蛋糕。還公開了將組合物送遞給受試者的方法，包括給予該受試者任一上述組合物、送遞裝置、微嚢或食品。該受試者可為哺乳動物。該受試者還可以為人。還公開了任一上述微嚢用于制備將負載物質(zhì)送遞給受試者的藥物的用途。還公開了降低受試者體內(nèi)膽固醇水平、甘油三酯水平或它們的組合的方法，包括給予該受試者有效量的任一上述組合物、送遞裝置、微嚢、營養(yǎng)添加劑或食品的步驟。還公開了補充受試者體內(nèi)必需微量元素的方法，所述方法包括給予該受試者有效量的任一上述組合物、送遞裝置、微嚢、營養(yǎng)添加劑或食品的步驟，其中所述組合物、送遞裝置、微嚢、添加劑和食品含有必需微量元素。還公開了提高受試者體內(nèi)胰島素敏感度的方法，包括給予該受試者有效量的任一上述組合物、送遞裝置、微嚢、營養(yǎng)添加劑或食品的步驟。還公開了減輕受試者高血糖癥的方法，包括該受試者有效量的任一上述組合物、送遞裝置、微嚢、營養(yǎng)添加劑或食品的步驟。還公開了減輕受試者高膽固醇血癥的方法，包括該受試者有效量的任一上述組合物、送遞裝置、微嚢、營養(yǎng)添加劑或食品的步驟。還公開了減少受試者體內(nèi)脂肪的方法，包括該受試者有效量的任一上述組合物、送遞裝置、#1嚢、營養(yǎng)添加劑或食品的步驟。還公開了促進受試者減肥的方法，包括該受試者有效量的任一上述組合物、送遞裝置、微嚢、營養(yǎng)添加劑或食品的步驟。還公開了治療或預(yù)防受試者糖尿病的方法，包括該受試者有效量的任一上述組合物、送遞裝置、微嚢、營養(yǎng)添加劑或食品的步驟。還公開了一種藥物制劑，包含任一上述組合物、送遞裝置或微嚢以及藥物載體。還公開了包含有某種組合物的食品，所述組合物包含有具有18S序列的真核微生物，其中所述18S序列與SEQIDN0:1列出的序列具有至少94%的同一性。該食品可為烘焙食品、面食、肉制品、冷凍乳制品、乳制品、奶酪制品、蛋制品、調(diào)味品、湯粉、點心、堅果制品、植物蛋白制品、硬糖、軟糖、家禽產(chǎn)品、經(jīng)加工的果汁、砂糖、醬油、肉汁、糖漿、營養(yǎng)飲品、飲料、飲料干粉、果醬或果凍、嬰兒配方或嬰兒食品。該食品還可為魚制品、寵物伴侶食品、家畜銅料或水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料。食品還可為面包、玉米餅、谷類食品、香腸、雞肉、冰洪淋、酸奶、牛奶、沙拉調(diào)p未料、米糠、果汁、飲料干粉、面包巻、餅干、薄脆餅干、快餐、水果餡餅或蛋糕。還公開了降低受試者體內(nèi)膽固醇水平、甘油三酯或它們的組合的方法，包括給予有效量的組合物、營養(yǎng)添加劑、送遞裝置或食品的步驟，所述組合物含有具有18S序列的真核微生物，其中所述18S序列與SEQIDNO:1列出的序列具有至少94%的同一性，所述營養(yǎng)添加劑含有組合物，該組合物含有具有18S序列的真核微生物，其中所述18S序列與SEQIDNO:1列出的序列具有至少94%的同一性，所述送遞裝置含有組合物，該組合物含有具有18S序列的真核微生物，其中所述18S序列與SEQIDN0:1列出的序列具有至少94%的同一性，所述食品含有組合物，該組合物含有具有18S序列的真核微生物，其中所述18S序列與SEQIDN0:1列出的序列具有至少94%的同一性。還公開了補充受試者體內(nèi)必需微量元素的方法，所述方法包括給予有效量的組合物、營養(yǎng)添加劑、送遞裝置或食品的步驟，所述組合物含有具有18S序列的真核^:生物，其中所述18S序列與SEQIDNO:1列出的序列具有至少94"/。的同一性，所述營養(yǎng)添加劑含有組合物，該組合物含有具有18S序列的真核孩吏生物，其中所述18S序列與SEQIDN0:1列出的序列具有至少94%的同一性，所述送遞裝置含有組合物，該組合物含有具有18S序列的真核^L生物，其中所述18S序列與SEQIDN0:1列出的序列具有至少94%的同一性，所述食品含有組合物，該組合物含有具有18S序列的真核微生物，其中所述18S序列與SEQIDNO:1列出的序列具有至少94%的同一性。還公開了提高受試者體內(nèi)胰島素敏感度的方法，所述方法包括給予有效量的組合物、營養(yǎng)添加劑、送遞裝置或食品的步驟，所述組合物含有具有18S序列的真核微生物，其中所述18S序列與SEQIDN0:1列出的序列具有至少94%的同一性，所述營養(yǎng)添加劑含有組合物，該組合物含有具有18S序列的真核微生物，其中所述18S序列與SEQIDN0:1列出的序列具有至少94%的同一性，所述送遞裝置含有組合物，該組合物含有具有18S序列的真核微生物，其中所述18S序列與SEQIDN0:1列出的序列具有至少94°/的同一性，所述食品含有組合物，該組合物含有具有18S序列的真核微生物，其中所述18S序列與SEQIDNO:1列出的序列具有至少94%的同一性。還公開了減輕受試者高血糖癥的方法，所述方法包括給予有效量的組合物、營養(yǎng)添加劑、送遞裝置或食品的步驟，所述組合物含有具有18S序列的真核^:生物，其中所述18S序列與SEQIDN0:1列出的序列具有至少94%的同一性，所述營養(yǎng)添加劑含有組合物，該組合物含有具有18S序列的真核微生物，其中所述18S序列與SEQIDN0:1列出的序列具有至少94%的同一性，所述送遞裝置含有組合物，該組合物含有具有18S序列的真核微生物，其中所述18S序列與SEQIDNO:1列出的序列具有至少94%的同一性，所述食品含有組合物，該組合物含有具有18S序列的真核微生物，其中所述18S序列與SEQIDN0:1列出的序列具有至少94%的同一性。還公開了減輕受試者高膽固醇血癥的方法，所述方法包括給予有效量的組合物、營養(yǎng)添加劑、送遞裝置或食品的步驟，所述組合物含有具有18S序列的真核微生物，其中所述18S序列與SEQIDN0:1列出的序列具有至少94%的同一性，所述營養(yǎng)添加劑含有組合物，該組合物含有具有18S序列的真核微生物，其中所述18S序列與SEQIDNO:1列出的序列具有至少94%的同一性，所述送遞裝置含有組合物，該組合物含有具有18S序列的真核微生物，其中所述18S序列與SEQIDN0:1列出的序列具有至少94%的同一性，所述食品含有組合物，該組合物含有具有18S序列的真核微生物，其中所述18S序列與SEQIDNO:1列出的序列具有至少94%的同一性。還公開了減少受試者體內(nèi)脂肪的方法，所述方法包括給予有效量的組合物、營養(yǎng)添加劑、送遞裝置或食品的步驟，所述組合物含有具有18S序列的真核孩i生物，其中所述18S序列與SEQIDN0:1列出的序列具有至少94/的同一性，所述營養(yǎng)添加劑含有組合物，該組合物含有具有18S序列的真核微生物，其中所述18S序列與SEQIDN0:1列出的序列具有至少94%的同一性，所述送遞裝置含有組合物，該組合物含有具有18S序列的真核^:生物，其中所述18S序列與SEQIDNO:1列出的序列具有至少94%的同一性，所述食品含有組合物，該組合物含有具有18S序列的真核微生物，其中所述18S序列與SEQIDN0:1列出的序列具有至少94%的同一性。還公開了促進受試者減肥的方法，所述方法包括給予有效量的組合物、營養(yǎng)添加劑、送遞裝置或食品的步驟，所述組合物含有具有18S序列的真核孩i生物，其中所述18S序列與SEQIDNO:1列出的序列具有至少94%的同一性，所述營養(yǎng)添加劑含有組合物，該組合物含有具有18S序列的真核樣i生物，其中所述18S序列與SEQIDN0:1列出的序列具有至少94%的同一性，所述送遞裝置含有組合物，該組合物含有具有18S序列的真核微生物，其中所述18S序列與SEQIDN0:1列出的序列具有至少94%的同一性，所述食品含有組合物，該組合物含有具有18S序列的真核微生物，其中所述18S序列與SEQIDN0:1列出的序列具有至少94%的同一性。還公開了治療或預(yù)防受試者糖尿病的方法，所述方法包括給予有效量的組合物、營養(yǎng)添加劑、送遞裝置或食品的步驟，所述組合物含有具有18S序列的真核^:生物，其中所述18S序列與SEQIDN0:1列出的序列具有至少94%的同一性，所述營養(yǎng)添加劑含有組合物，該組合物含有具有18S序列的真核^:生物，其中所述18S序列與SEQIDN0:1列出的序列具有至少94%的同一性，所述送遞裝置含有組合物，該組合物含有具有18S序列的真核^:生物，其中所述18S序列與SEQIDNO:1列出的序列具有至少94%的同一性，所述食品含有組合物，該組合物含有具有18S序列的真核微生物，其中所述18S序列與SEQIDNO:1列出的序列具有至少94%的同一性。還公開了含有組合物的藥物制劑，所述組合物含有具有18S序列的真核微生物，其中所述18S序列與SEQIDNO:1列出的序列具有至少94%的同一性。VI實施例給出以下的實施例旨在為本領(lǐng)域的技術(shù)人員提供本申請所要求保護的化合物、組合物、物品、裝置和/或方法如何制備和評估的完整公開和描述，純粹是為了舉例說明，而無意于對公開內(nèi)容作限制。已努力確保數(shù)字(如量、溫度等)方面的準確性，但是還是應(yīng)該考慮到會存在某些誤差和偏差。除非另外指明，否則份數(shù)為重量份數(shù)，溫度為'C或者室溫，壓力為大氣壓或接近大氣壓。1.實施例1:0NC-T18破嚢壺菌屬種菌林的分離采用了經(jīng)典的細菌學(xué)菌林純化技術(shù)，目的在于從在AdvocateHarbor,NovaScotia收集到的紅樹樹葉分離0NC-T18。在營養(yǎng)培養(yǎng)基(lL0.2jam過濾的海水中含有5gL—1葡萄糖、2gL—t蛋白胨、2g1^酵母提取物和15.0gL—4京脂)中于25X:連續(xù)培養(yǎng)0NC-T18,直至獲得足夠的純度。隨后，配制含有15%人工海水(營養(yǎng)型海水)、添加有氮源和碳源(分別為60gL—工葡萄糖和10gL—i酵母提取物)的液體培養(yǎng)基。用0NC-T18接種該培養(yǎng)基(250ml燒瓶中裝有50ml),然后在25C培養(yǎng)，并通過于120rpm振蕩來充氣。通過離心自培養(yǎng)基分離0NC-T18,然后洗滌細胞生物量，再次離心并徹底冷凍干燥。然后對細胞生物量進行稱重，目的在于通過所記錄的生物量/升培養(yǎng)基的數(shù)值來確定培養(yǎng)效率。使用Bligh&Dyer方法從生物量提取脂質(zhì)組分，隨后分離脂肪酸甲酯。通過以下步驟進行酯交換將冷凍干燥的細胞物質(zhì)轉(zhuǎn)移至10ml帶有螺旋蓋的試管中，并將10%曱醇HC1和二氯甲烷加入該試管，使該混合物在90。C反應(yīng)2小時。然后通過加入己烷氯仿來提取脂肪酸甲酯，并通過氣相色鐠(FID)來測量甲酯組分，目的是確定各種微生物和共生群落(0NC-T18)的脂肪酸生產(chǎn)情況。通過比較在酯交換過程的開始(C23:0)和結(jié)束(C19:0)時以確定量加入的兩個內(nèi)標(C19:0和C23:0)的GC峰面積，測定了各種脂肪酸曱酯(C14:0至C22:6)的濃度。使用這種方法計算得到的總脂肪酸量/克干細胞生物量以及每種脂肪酸的百分含量示于圖2。通過對這些結(jié)果的分析并結(jié)合示于圖1中的那些結(jié)果，可發(fā)現(xiàn)ONC-T18表現(xiàn)出產(chǎn)生增加量的DHA以及顯著量EPA和DPA的能力。0NC-T18在該非最佳發(fā)酵培養(yǎng)基中產(chǎn)生了大約25%DHA、8.0W(n-6)DPA和1.0%EPA。隨后基于以下經(jīng)濟所需特征的組合來選擇0NC-T18:(l)能最大程度地進行異養(yǎng)生長(與對照菌林相比較)；(2)含有高百分比的co-3高度不飽和脂肪酸；(3)能在便宜的營養(yǎng)物質(zhì)中生長；(4)具有耐熱性以及(5)具有廣耐鹽性。另外，將產(chǎn)油微生物的多種不同菌林與0NC-T18進行了比較。這其中的每種微生物均被認為包含有破嚢壺菌，并產(chǎn)生表3所示量的油。表3,<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>可以理解的是，如本文所述的0NC-T18—樣，通過例如DHA與油總產(chǎn)量的百分比或通過DHA總產(chǎn)量，公開了用通過本文所公開產(chǎn)油力所表示的一系列產(chǎn)油微生物。2.實施例2:使用遺傳技術(shù)鑒定真核破嚢壺菌屬種0NC-T18使用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)技術(shù)和靶向于18S核糖體RNA基因的引物(所有真核生物物種的通用引物)，能產(chǎn)生自0NC-T18分離得到的真核微生物結(jié)構(gòu)基因的PCR產(chǎn)物(如實施例l所述)。然后對PCR產(chǎn)物進行測序，并將該對于真核生物物種的序列命名為SEQIDNO:l(參見圖2)。使用BLAST(基本的局部比對搜索工具)算法，將SEQIDNO:1與在基因組數(shù)據(jù)庫GenBank(美國國家生物技術(shù)信息中心，美國國家衛(wèi)生研究所，貝塞斯達，馬里蘭，美國)中的核酸序列相比較，鑒定發(fā)現(xiàn)SEQIDNO:1與紋狀破嚢壺菌[AF265338]關(guān)系最為密切(97.5%相似性)。ONC-T18破嚢壺菌屬種的BLAST結(jié)果如下所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>gigi3i9丄gigigigigig丄gigigigigigigigig丄gigigigigig土gig丄g丄gigigigigigigigigigigigi463127|gbjli27634,liLADDIjRRNALabyrinthuloidesminutaISS-like.39S818393998182418026024180260221802SQ14180260081802598018025969180258013998186114349249202189621802578S30144548213810S|'5382818687343S06873475068734239981870399818441802S046180260391802603142412527735334253457S227301445223014452130144518301444732195424S4139302753693111536931085369310553693104585318S2gbAY38i:L71.gbAY04S848,gbAY0"832.dbjAB19:U24,1gblM381208.1！dbj|AB073307,11AY04678419bAY04SS133b1gb1gb1gb:lgbAY38:i217iAY381211li沖AY381191iAY046870igfaigbigbigbDQ103828gbAY1290S4iAY256310ligbigbiigbiemb|AJ53Sl75-AT742759igbAY74275SiAY742755igbAY742748lgbAY7427471gbAY742745iAY882508504e-139UnculturedeukaryotecloneOR000415.1...502e-138UnculturedeukaryotecloneHE001005.:L…502e-138UnculturedeidcaryoteisolateC3—E019...502e-138Uncu工tuiredeukaryoteisolateC3一E017.,.502e-138UnculturedeukaryoteisolateC3一E008...502e-138UnculturedeukaryoteisolateC3二E002...502e-138UnculturedeukaiyoteisolateC2—E014*.,502e-138UnculturedeukaryoteisolateC2:E002...502e-138UnculturedeukaryoteisolateC1二3S024...502e-138Unculturedeukaryotegene￡orsmall...502e-138Unculturedeukaryotegeneforsmall...502e-138Unculturedeukaryotegeneforsmall.*.502e-138Unculturedeu)caryotecloneBIj010320.1…500e-138Thoratistociiytriumsp.KK17-3genefor...500e-138Thraustochytriidaesp.M4-103genef…498e-137Uncultu;redeuJcaryoteclone2euk7S18S,..496e-13SUnculturedeukaryoteisolateA3—E043,.,496e-13SUnculturedeukaryoteisolateC1二E009...496e-136UnculturedeukaryoteisolateD278sma,..496Scybaliumjamaicense18Sxibosomal…496e-13SPhytophthorapalmivoraisolate88108,..494e-136UnculturedoomycetecloneCVl—B2—5sm...494e-13SUnculturedPhytophthora-likeoomycete.,.494e-13SUnculturedoomycetecloneCV1—Bl—49s...494e-136UnculturedeukaryotecloneBIi01025丄…494e-136UnculturedeukaryotecloneBIj010320丄..494e-136UnculturedeukaryotecloneBM10320,S...494UnculturedeukaryotecloneBIj00092;i.1.…494e-136UnculturedeukatyoteisolateC3一E044...494e-136UnculturedenkaryoteisolateC3二E035.-.494UnculturedeukaryoteisolateC3—E026*.，494e-l36Pythiuminsidiosum18SribosomalRNA...494UnculturedmarineeukaryotecloneM2_...494e-136UnculturedmarineeukaryoteUEPAC45p4.,,494e-13SUnculturedeukaryoteisolateD85smal,..494UnculturedeukaryoteisolateD84smal...494e-136UnculturedeukaryoteisolateD79smal,*-494e-136UnculturedeukaryoteisolateE106sma..*494e-136UnculturedeukaryoteisolateE94smal...494UnculturedeukaryotecloneANT12-2S494|XjMI53S176Leptocylindrusminimum18S...494e-136Phytopht:lio:tratropicalisisolate.129F-.-.494e*"136PythiumvexansisolatePyvS-218Srib.,.494e-13SPytliiutnsplendensisolate117ISSrib…494Pythium叩hanidermatum18Sribosotnal...494Phytophthoracapsiciisolate9811018…494e*136Phytophtlio:ratropicalisisolate23047,,.494e-136Phytophthorapalmivoraisolate88291...494Unculturedmarine，ukaryotecloneT53,,.494e-1363.實施例3:使用菌林0NC-T18最優(yōu)化生物量的生產(chǎn)來源于微生物的(或單細胞的)油的生產(chǎn)取決于多個過程變量，例如初始接種物水平、底物類型、培養(yǎng)基組成、溫度和pH。具體而言，使用破嚢壺菌菌林、以微生物為基礎(chǔ)的高度不飽和脂肪酸的生產(chǎn)表明生物量和脂肪酸生產(chǎn)之間有直接關(guān)系。因此，對基本需求的理解或者對參數(shù)的最優(yōu)化是獲得最大產(chǎn)量的重要因素。因此，為確定產(chǎn)生增加的脂肪酸量的最佳培養(yǎng)基，進行了初始的生物量最優(yōu)化實驗。具體而言，使用新近開發(fā)的以正交陣列為基礎(chǔ)的Taguchi法(JosephJandPiganatiellsJR，7>a/7<y20:247-254,1998)，目的在于確定使光密度(與生物量產(chǎn)生直接相關(guān))增加的最佳培養(yǎng)基組成。在這種情況下，使用Taguchi法來理解對生物量產(chǎn)生有影響的變量的累積效應(yīng)。氮(酵母提取物、蛋白胨、L-谷氨酸鹽)、碳(葡萄糖)和鹽濃度(人工海鹽)的改變對生物量產(chǎn)生有影響。因此，配制了多種液體培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基中含有各種量的酵母提取物、蛋白胨和L-谷氨酸鹽(O、4、10、20、50gL—》和各種量的葡萄糖和鹽水溶液(分別為5、40、100、160、200gL—!和0、6、20、30、40gL—"。依據(jù)L"正交陣列以下述方式計算濃度利用下面的公式，通過使用在48小時和120小時時的信噪比(SNL)辨別所選擇的氮培養(yǎng)基《肌=—lOlog其中，n-水平數(shù)目，y-產(chǎn)量(來自三個平行實驗的OD嗣平均值)。這些實驗(特別針對考慮因素生物量)的結(jié)果(如附圖2所示)表明，與光密度(OD咖)最相關(guān)的ONC-T18的氮利用率為蛋白胨，然后是酵母提取物，隨后是L-谷氨酸鹽。但是，以最快生長為基礎(chǔ)，則提高生物量產(chǎn)量的最佳氮源是酵母，然后是蛋白胨，隨后是L-谷氨酸鹽。另外，通過以葡萄糖和鹽度(海鹽濃度)為變量的相似實驗，用于生產(chǎn)ONC-T18生物量的最佳和最便宜的培養(yǎng)基組成為培養(yǎng)基含有2gL酵母提取物、8gL—1MSG、60gL^葡萄糖和6g1/海鹽。4.實施例4:用菌抹ONC-T18最優(yōu)化二十二碳六烯酸(DHA)的生產(chǎn)制備由氮源(蛋白胨、酵母提取物、L-谷氨酸鹽(MSG)或它們的組合)和碳源(葡萄糖)(溶解在鹽水(人工海水)溶液中)組成的培養(yǎng)基，以與實施例3所描述方式相似的方式確定能最優(yōu)化生物量和DHA產(chǎn)生的最佳培養(yǎng)基組成(示于表4)。在25。C和130rpm培養(yǎng)三天后，依據(jù)實施例1和此處所述的方法，通過氣相色鐠測定生物量、每升培養(yǎng)基中的總脂肪酸、脂肪酸的重量百分含量、DHA占總脂肪酸的百分含量以及每升培養(yǎng)基中DHA的量，結(jié)果示于表4。在這種情況下，通過使用氣相色鐠聯(lián)合質(zhì)譜和峰值鎖定(peaklocking)法，與已知的DHA標準品相比較，測定了DHA。實驗系列(experimentalpackage)錄的結(jié)果(其中對天然和有機兩種形式的氮的變化均進行了研究)表明，對于生物量和DHA的最佳生產(chǎn)而言，最佳培養(yǎng)基1丄，"!.=1乂'—組成中應(yīng)含有的酵母提取物和L-谷氨酸鹽的量均為4.0至6.0gL人另一方面，實驗系列翁(研究了加至培養(yǎng)基的鈉組分的變化)表明，使用人工海鹽可產(chǎn)出最佳的生物量和DHA。此外，實驗系列翁(其中培養(yǎng)基中鈉的濃度有所不同)表明，在使用5至15%人工海水1/^H20時出現(xiàn)DHA和生物量的最大生產(chǎn)量。實驗系列鈔(其中對葡萄糖水平的變化進行了評估)的結(jié)果表明，40至少于160gL—工的葡萄糖范圍可以得到最佳的生物量和DHA的生產(chǎn)。最后，實驗系列的結(jié)果表明，在葡萄糖或丙三醇用作碳源時，0NC-T18所產(chǎn)生的細胞生物量和DHA濃度數(shù)值是等價的。表4:培養(yǎng)基組成不同的情況下，DHA生產(chǎn)最優(yōu)化實驗的結(jié)果。<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>5.實施例5:0NC-T18產(chǎn)生最大量DHA的最佳收集時間在與實施例1中示出的那些培養(yǎng)基組成和條件相同的培養(yǎng)基組成和條件下培養(yǎng)0NC-T18。在此具體情況中，所研究的是為獲得最大量DHA、DPA和EPA，0NC-T18應(yīng)被收集的時間，同時還考慮了獲得所述的量必需的時間(參見圖3)。時程實驗結(jié)果表明，0NC-T18在燒瓶和生物反應(yīng)器中最優(yōu)化生產(chǎn)DHA的最佳收集時間分別介于3至5天之間。6.實施例6:對來源于ONC-T18的脂質(zhì)進行的分析使用改進的Bligh&Dyer法提取0NC-T18的總脂質(zhì)組分。具體而言，在4'C于8ml蒸餾水中將2.0g干細胞生物量過夜復(fù)水。將30ml甲醇氯仿(2:1體積/體積)加入混合物中并在120rpm溫和振蕩20min,輕輕倒出所得到的上清。然后將沉淀重懸于曱醇氯仿1120(2:1:0.8體積/體積/體積)，重復(fù)該過程，收集上清并將其轉(zhuǎn)移至分離漏斗中。然后將5ml氯仿和5ml仏0加入漏斗，從而形成兩相液體系統(tǒng)。在分離漏斗內(nèi)充分混合之后，棄去氯仿層，氮氣條件下濃縮，重懸于氯仿中并于-20iC保存，直至分析。將大約lpl的總脂質(zhì)組分點樣于多個色語棒上，使用IatroscanMK6TLC/FID4義器來分離和分析。結(jié)果分析表明，異養(yǎng)發(fā)酵條件下由0NC-T18產(chǎn)生的脂肪酸組分本質(zhì)上幾乎全部是甘油三酯(至少95%)。除了上述中性脂肪酸組分外，0NC-T18還產(chǎn)生可辨別的類胡蘿卜素和磷脂組分。通過隨后對磷脂組分的分離(首先經(jīng)過50。/。Burn，隨后經(jīng)過75°/Burn，緊接著通過以溶劑為基礎(chǔ)的分離)，可確定存在大量復(fù)雜的磷脂組分。結(jié)果表明，在樣本中存在磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸和磷脂酸組分。7.實施例7:使用菌林0NC-T18生產(chǎn)抗氧化劑使用前述條件和培養(yǎng)基來培養(yǎng)真核生物0NC-T18。異養(yǎng)發(fā)酵后所得到的細胞生物量經(jīng)由離心、過濾或沉淀來收集。細胞通過在3800xg離心收集，并用磷酸鹽緩沖鹽溶液洗滌。將細胞生物量(剛產(chǎn)生得到的或冷凍干燥的)懸浮于10x體積的丙酮中，200rpm攪拌5分鐘，3800xg離心5分鐘，并在氮氣條件下蒸發(fā)濃縮至干燥。然后將該色素立即重懸于極少量的10%丙酮(溶于己烷)，并在-20C保存，直至進行HPLC分析。然后在配備有設(shè)定在470nm的可變波長檢測器的Agilent1100HPLC(Agilent,PaloAlto,CA，USA)上鑒定類胡蘿卜素提取物。樣本通過SymmetryC18保護柱(Waters,Milford，MA，USA)被注射至BondcloneC18反相柱(Phe纖enex,Torrance,CA，USA)顆粒為10jam)內(nèi)徑為3,9x300mm)。注射體積為10jil，所使用的流動相為10%的丙酮(溶于己烷)，流速為1.00ml/min，進行25分鐘。將類胡蘿卜素的峰面積與已知的標準品(在此情況下為蚱青素、角質(zhì)素、玉米黃素、玉米黃素、海膽酮和P-胡蘿卜素；ChromaDex，SantaAna，CA，USA)相比較，獲得類胡蘿卜素的定量數(shù)據(jù)。在不存在已知標準品例如類胡蘿卜素、芬尼黃質(zhì)的情況下，用奸青素的峰面積來計算其濃度。類胡蘿卜素特征的進一步確認通過使用配備有引入MicromassESI-Q-Tof質(zhì)i普儀(Waters,Milford，MA，USA)的光敏二才及管陣列(Watersmodel996)的WatersHPLC經(jīng)由HPLC-MS進行。隨后對0NC-T18的HPLC分析表明，在細胞生物量中存在幾種抗氧化劑化合物(50至1250mg/kg)。這些化合物包括范圍分別為1至20mg/kg、0.25至10mg/kg、1至20mg/kg、1至20mg/kg和1至200mg/kg的抗氧化劑類胡蘿卜素蝦青素、玉米黃素、角質(zhì)素、海膽酮和P-胡蘿卜素，以及幾種性質(zhì)尚未^皮鑒定的類黃酮多酚化合物(flavenoidpolyphenoliccompound)。8.實施例8:與已知微生物的比較將0NC-T18產(chǎn)生DHA、EPA和DPA的能力與已知微生物的這一能力相比較。通過培養(yǎng)金黃破嚢壺菌ATCC34304、破嚢壺菌屬種ATCC20891、破嚢壺菌屬種ATCC20892、粉紅破嚢壺菌ATCC28210、破嚢壺菌屬種ATCC26185、裂殖壺菌屬種ATCC20888、集生裂殖壺菌Wc力/zocAr"2'咖鄉(xiāng)reg""邁)ATCC28209和Jc力2.雄力7m'咖//鵬ci'/7咖MYA-1381,測定了培養(yǎng)上述菌抹時產(chǎn)生的每升培養(yǎng)基中細胞生物量的量，每克干細胞生物量中脂肪或脂肪酸的百分含量，總脂肪酸中DHA、EPA和DPA的百分含量，和DHA、EPA和DPA的量，還測定了培養(yǎng)本發(fā)明的0NC-T18時所獲得的DHA、EPA和DPA的產(chǎn)量。表5.對幾種代表性破嚢壺菌菌林的脂質(zhì)生產(chǎn)和生物量特征的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>如表5所示，很顯然的是，在使用本發(fā)明的0NC-T18進行培養(yǎng)時，與被測試的其它菌抹相比，每升培養(yǎng)基中細胞生物量數(shù)值極高。此外，根據(jù)本發(fā)明，0NC-T18與上述其它菌林相比具有非常高百分含量的脂質(zhì)。另夕卜，根據(jù)本發(fā)明，0NC-T18內(nèi)DHA和DPA的百分含量極高，并且EPA水平表現(xiàn)出與全部被篩選的菌林相當(dāng)。因此，顯然0NC-T18具有在實施例1所述發(fā)酵條件下產(chǎn)生大量DHA、EPA和DPA的能力。9.實施例9:替代碳源的信息已表明ONC-T18優(yōu)先在這樣一種培養(yǎng)基上生長，其中主要氮源為酵母提取物、谷氨酸鈉和/或蛋白胨，主要碳源為D-葡萄糖?；?NC-T18的詳細代謝分布信息，注意到甘油(碳源)同樣是可行的替代物質(zhì)。另夕卜，還對魚油加工廢液(含有甘油)作為成本低廉的營養(yǎng)替代物質(zhì)的可應(yīng)用性進行了測試。對甘油的情況進行了如下實驗使用裝于500ml燒瓶中的200ml培養(yǎng)基，在25。C、120rpm生長3天。兩種魚油加工廢物GWW(甘油水性洗液)和GAW(甘油酸性洗液)的甘油含量占200ml培養(yǎng)基(調(diào)節(jié)至pH6.5)的40°/。(體積體積)，并將6。/甘油加入200ml培養(yǎng)基(重量體積)作為對照。表6.替代碳源研究的脂肪酸、生物量和甘油含量脂肪酸占總脂質(zhì)含量的重量百分比(％)TFA(mgg")<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>對這些結(jié)果的分析證實，將魚油廢液組分例如副產(chǎn)品甘油用作0NC-T18的大規(guī)模發(fā)酵的碳源時，盡管導(dǎo)致微生物細胞內(nèi)的總脂肪酸量減少，但是其中的DHA含量保持不變(圖10)。10.實施例10:細胞干重的擴大培養(yǎng)可在最大至100,000L的多種反應(yīng)器結(jié)構(gòu)中培養(yǎng)破嚢壺菌屬種ONC-Tl8來生產(chǎn)co-3油。所有的發(fā)酵過程均開始于配制占終體積的10-20%的接種物，它可用于形成發(fā)酵培養(yǎng)物。初始培養(yǎng)基組成包含有最高至6g/L海鹽、10g/L氮源和60g/L碳源，并在初始發(fā)酵24至36小時后進行補料，分批加入另外75g/L碳源，再持續(xù)72至96小時，并且溫度范圍為18-25°C。例如，使用含有6g/L海鹽、2g/L酵母提取物、8g/LL-谷氨酸鹽和60g/LD-葡萄糖(36小時后再加入75g/L)的培養(yǎng)基在25。C培養(yǎng)96小時，ONC-T18能產(chǎn)生40g/L細胞干重(dcw)、占細胞干重(dcw)80%的總脂肪酸(TFA)/脂質(zhì)組分(介于C14:0至C24:0之間)和30%的(TFA)DHA。同樣，在不影響TFA或DHA含量的情況下，能通過成倍增加氮和碳培養(yǎng)基組分的含量，使得生物量也有相似倍數(shù)的增加，從而增加細胞干重。例如，使用含有24g/L海鹽、8g/L酵母提取物、32g/LL-谷氨酸鹽和300g/LD-葡萄糖的培養(yǎng)基在25t:培養(yǎng)312小時，ONC-T18能產(chǎn)生80g/L的細胞干重(dcw)、占細胞干重(dcw)60。/。的總脂肪酸(TFA)/脂質(zhì)組分(介于C14:0至C24:0之間)和38%的(TFA)DHA。11.實施例11:破嚢壺菌屬種0NC-T18在各種替代的碳(C)源和氮(N)源中的生長情況以及對細胞干重和脂質(zhì)的影響對破嚢壺菌屬種0NC-T18在各種成本低廉的氮源和碳源中的生長情況進行了研究。將50mlONC-T18在裝有6g/L人工海鹽的250ml燒瓶中于25'C培養(yǎng)72小時。碳源和氮源濃度如下所示，與8g/LL-谷氨酸鹽聯(lián)合使用的所列各氮源為2g/L(使用魚粉的情況例外，該魚粉用量為4g)。碳源如所示那樣變化。全部實驗平行進行三次；用于脂肪酸曱酯分析的所有提取均平行進行三次，同時平行進行三次GC注射。結(jié)果表明，破嚢壺菌屬種0NC-T18在氮源EMD酵母提取物和魚粉中生長時，可產(chǎn)生優(yōu)化的細胞干生物量(即比兩種對照培養(yǎng)基要高)。相反，使用玉米漿和EMD蛋白胨時，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)含量比對照低，而DHA含量得到優(yōu)化。最后，發(fā)現(xiàn)碳源右旋糖會增加脂質(zhì)含量，而果糖和右旋糖會產(chǎn)生比對照更高的DHA含量。表7:破嚢壺菌屬種0NC-T18的生長情況<table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table>縮寫msg=l-谷氨酸鹽(鈉)ye-酵母提取物12.實施例12:用于分離總脂質(zhì)和各組分的提取技術(shù)對多種分離所選co-3油的方法進行了測試，目的是確定最佳的分離效率。這些方法包括標準的Bligh&Dyer法(Bligh&Dyer,Ca//.尸Af;A/.，37:912-917，1959)、專門用于破嚢壺菌種的聯(lián)合提取和酯交換法(可對樣本進行加工用于快速GCFAME分析)(Lewisetal.:/#/cro6/o/.#e^o^^，43:107-116，2000)、采用同時皂4b的提取法(Cartensetal.，/血C力e瓜紋73:1025-1031，1996)和使用可選擇性分離甘油三酯、甘油二酯和甘油單酯的硅膠柱的固相提取法(Pinkartetal.,,#/croW.34:9-15，1998;Bateman&Jenkins,/.J^r/c.，45:132-135，1997)。具體而言，將在單次發(fā)酵操作(參見實施例l)中產(chǎn)生的40g細胞干重破嚢壺菌屬種生物量分為0.44g的多個組，并使用各種技術(shù)進行分離。所有技術(shù)均平行進行三次，并使用通過FID-GC的脂肪酸曱酯確定法來分析效率，同樣平行進行三次，并且每個樣本平行進行三次。結(jié)果表明，各種方法所獲得的總脂肪酸含量有所不同，這種波動最可能是由于溶劑化N.B:以上列出的各數(shù)值為使用用于FAME分析的FID-DC的三次平行實驗的平均值13.實施例13:a)材料和方法(l)破嚢壺菌的分離和培養(yǎng)2002年七月和/\月期間，在NovaScotia,PrinceEdwardIsland,NewBrunswick,Newfoundland和Labrador的加拿大東部沿海地區(qū)收集了70個海洋樣本，包括互花米草(S/7ar〃加a〃e/7n77ora)、大葉藻(ZoWera鵬r/za)和泥沙。將樣本置于裝有如下物質(zhì)的20mL小瓶中10mL無菌的0.2ym過濾的天然海水和300mgL—i青霉素和500mgL—鏈霉素。依據(jù)Bremer,他/7/e妙co/0^7-J/Va"/ca/J/7/7roac力，F(xiàn)ungalDiversityPress,HongKong,pp49-61(2000)所述，將懸液用無菌花粉(槭樹04cw.))誘集，并在181C孵育48小時。然后通過接種環(huán)轉(zhuǎn)移花粉粒并在含有抗生素的Bl瓊脂板(lL天然海水含有1gL—'酵母提取合物的飽和狀況、生物量破壞情況和其它物理條件(如溫度和時間)等考慮因素。表8:分離總脂質(zhì)和各組分的提取技術(shù)Bligh&DyerDHAEPAC14:0C14:lC15:0C16:0C16:lC18:lC20:0C20:4mgomega"3/克生物量(mg/g)1104.394.2536.285.82113.9477.274.9244.01U31.67-2136.755.4546.517.40142,9698.386.0756.491.402.193134.594.7842.516.91128.5487.015,2051-101.302.10Av.12S.244.8341.776.71128.4887-555.4050.531.281.99直接酯交換DHAEPAC14:0C15:0C16:0C16:lmgomega-3/克生物量1104.394.2436.395.42112.9475.27289.834.5434.815.60103.0473.433101.644.2537.165.98106.9475.98Av.98.654.3436.125.67107.6474,89C18:0C18:lC20:0C20:4C22:5TFA(mg/g)5.4244.011.131.6728.86420.995.5642.850.981.8725,35392.885.35'43.951.111.7826.46410.655.4443.601.071.7726.89408.17同時皂化DHAEPA1204.856.752188.516.173198.256.12Av.197,206.35固相提取DHAEPA1169.170.422172.260.443173.650.43Av.171.690.43C15:0C16:0C16:1C1S:0Ci8:lC20:0，om，g^pZ克豐，黨1特)8.56m.269.32208.299.65207.79.18199.42134.81121.25136.51130.8610,359.589.55105.0495.8098.5099.782.162.532.412.37C15:0C16:0C16:lC18:0C18:lC20:0mgomega"3/克生物量(mg/g)10.83204.43140.148.0976.971,7511.01207.01143,748-1178.721.7411.31208.97146.648.1677.641.7311.05206.80143.518.1277.781.74C20:4C22:53.2066說2.8961.413.1063.583.0663.89C20:4C22:5TFA785.25770.14782.54779.31TFA748.33819.04785.64784.34C22:5TFAC14:0C14:09813353o45556285233354134444.191iRsQ.I_666-5600o44440740f*sc^sc<i**5物、1gL—i蛋白胨、10gL—、京脂)上劃線并培養(yǎng)。挑選球形或錄蝓形細胞的單個無規(guī)則透明集落和非典型的酵母或細菌集落，并在Bl板上至少傳代培養(yǎng)三次以進行純化。(2)用于脂肪酸篩選的生物量生產(chǎn)為篩選用于培養(yǎng)和脂肪酸生產(chǎn)的分離林，使用0.2jiim過濾的天然海水配制液體培養(yǎng)基，該液體培養(yǎng)基含有2g1/蛋白胨(BD，F(xiàn)ranklinLakes:NJ，USA)和2gL—1酵母提取物(80，F(xiàn)ranklinLanes，NJ，USA),通過高壓滅菌對培養(yǎng)基滅菌，然后加入5gL—10.2ym濾器過濾除菌的葡萄糖(Sigma-Aldrich，St.Louis,MO，USA)(Bowlesetal.，/A/o/ec力"o/70:193-202(1999))。通過接種環(huán)從瓊脂板上接種體積為30mL的培養(yǎng)物，并在設(shè)定為100RPM的振蕩器上于18。C培養(yǎng)4天。然后將5mL該培養(yǎng)物接種于95ml培養(yǎng)基，并再培養(yǎng)4天(穩(wěn)定期)。通過在4，500RPM離心收集細胞，用5mL蒸餾水洗滌并再次離心。將細胞沉淀冷凍干燥、稱重并在-8(TC保存，然后進行脂肪酸的衍生作用分析。(3)脂肪酸曱酯(FAME)的制備可通過從Lewis等人(/43:107-116(2000))的直接酯交換方法改進而得的方法進行脂肪酸曱酯(FAME)的提取。具體而言，加入20mg冷凍干燥的物質(zhì)和3ml酯交換反應(yīng)混合物(曱醇鹽酸氯仿(10:1:1體積/體積))。將細胞渦旋振蕩10秒鐘，以確保生物量均勻分散，并于90。C放置120分鐘。在完成酯交換后取出樣本并將其冷卻至室溫。然后加入水(lml)并渦旋振蕩10秒鐘。然后通過如下步驟提取FAME:加入3x2ml等份的己烷氯仿(4:1),渦旋振蕩10秒鐘，靜置，直至獲得澄清的液體分離物。(4)FAME的氣相色語(GC)分析使用兩個內(nèi)標(各200jul)進行FAME的GC分析。一個是二十六酸(hexacosaenoicacid)(C23:0),在酯交換之間加入；另一個是十九酸(C19:0)，在分析之前直接加入。使用Agilent6890GC(AgilentTechnologies,PaloAlto，CA，USA)進行分析，該儀器配備有內(nèi)徑為30mx0.32m的OMEGAWAX320熔融石英毛細管柱(Sigma-Aldrich，St.Louis,M0，USA)和火焰離子化檢測器(注射體積為l|il，載氣為H2，恒定流速為5.0mlmin1，設(shè)定在250C在275C時FID檢測器的分流比為50:1)。通過使用TraceGC-DSQ質(zhì)語儀(ThermoElectron,Boston,MA，USA)并與實驗標準品的滯留時間相比較，進行FAME特征的確認。(5)遺傳鑒定使用MoBioUltraCleanMicrobialDNAIsolationKit(MoBioLaboratories,Carlsbad,CA，USA),才艮據(jù)制造商的說明書來提取基因組DNA。用于擴增18SrRM基因的寡核苷酸引物是從Honda等人(/^hr/W46:631-641(1999))所用的引物改進而來，即T18S1F5，-CAACCTGGTTGATCCTGCCAGTA-3，和T18S5R5，-TCACTACGGAAACCTTGTTACGAC-3，。20p1的PCR反應(yīng)混合物含有2UBiolaseTMDNA聚合酶(Bioline，Boston,MA，USA)、lx冊4反應(yīng)緩沖液、3mMMgCl2、1M甜菜堿(Sigma-Aldrich，StLouis,M0，USA)、200pM混合的PCR核苷酸(Promega，Madison，WI，USA)、各lpM的正向引物和反向引物(MWGBiotech.,HighPoint,NC，USA)以及100ng基因組DM模板。在首先于94。C變性3分鐘之后，使用EppendorfMasterCycleGradient基因擴增4義(Eppendorf,Westbury，NY，USA)進4亍PCR擴增，其程序為94*C45秒、64°C30秒、72*C2分鐘，此程序進行30個循環(huán)，最后在72。C延長10分鐘。使用MoBioUltraCleanPCRClean-upKi"MoBioLaboratoriesInc，Carlsbad,CA，USA)來純化PCR產(chǎn)物，以便使用引物FA2、FA3、RA1、R(Moetal."140:883-8892002)、T18S1F和T18S5R來進行直接測序(匿GBiotech.，HighPoint,NC，USA)。使用DSGene(Accelrys,SanDiego,CA,USA)來對所得到的序列進行比對，并將其與保存在GenBank(Bensonetal.，We<y33:D34-38(2005))的相似微生物的核苷酸序列相比較。然后使用鄰接法(Neighbor-Joiningmethod)(SaitoandNei，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage83</formula>4:406-425(1987))形成系統(tǒng)樹，并使用1000個自舉模擬取樣樣本(Felsenstein，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage83</formula>(1985))來評估統(tǒng)計學(xué)意義。(6)類胡蘿卜素的鑒定通過在3800xg離心來收集細胞，并用磷酸鹽緩沖鹽溶液洗滌。然后重懸于10x體積的丙酮(Sigma-Aldrich,StLouis,M0，USA)中，200RPM攪拌5分鐘，3，800xg離心5分鐘，并通過N2蒸發(fā)濃縮至干。之后重懸于極少量的10°/丙酮(溶于己烷)中，隨后進行HPLC分析。在配備有設(shè)定在470nm的可變波長檢測器的Agilent1100HPLC(Agilent,PaloAlto,CA,USA)上進《亍鑒定。樣本通過SymmetryC18保護柱(Waters,Milford，MA，USA)被注射至BondcloneC18反相柱(Phenomenex,Torrance,CA,USA;顆粒為lOjum;內(nèi)徑為3.9x300mm)。注射體積為10yl，所使用的流速為1ml/min10%的丙酮(溶于己烷)，進行25分鐘。類胡蘿卜素特征的進一步確認通過質(zhì)諉分析法(MicromassESI-QTofMS，Waters,Milford,MA，USA)進行。各種類胡蘿卜素的定量數(shù)據(jù)以使用標準品(奸青素、玉米黃素、角質(zhì)素、海膽酮和p-胡蘿卜素)來形成校正曲線并將峰面積與確定濃度相比較為基礎(chǔ)。(7)發(fā)酵最優(yōu)化通過在250mlErlenmeyer瓶中進行分批培養(yǎng)(130RPM振蕩，于25。C培養(yǎng)3天)來檢測碳、氮和海鹽對脂肪酸和DHA生產(chǎn)的影響。使用BiostatBplusTwin5L生物反應(yīng)器(SartoriusBBISystemsInc.,Betlehem，PA，USA)進行進一步的培養(yǎng)研究。將100ml的接種物接種于裝在生物反應(yīng)器中的4.9L培養(yǎng)基。使用Glucose(HK)AssayKit(Sigma-Aldrich，StLouis,M0，USA)，才艮據(jù)制造商的說明書來測量葡萄糖濃度。在生物反應(yīng)器中所采用的培養(yǎng)基組分和條件在相關(guān)結(jié)果部分進行了詳細闡述。b)結(jié)果開發(fā)了收集和篩選方法，藉此，使用花粉誘集法和選擇性細菌培養(yǎng)基對多種原生生物盤根足蟲目(familyLabyrinthulida)尤其是裂殖壺菌屬和石皮嚢壺菌屬進行了分離。該研究涵蓋分布于整個AtlanticCanada的20個不同的采集地點，并獲得了經(jīng)顯微鑒定的68個純的菌株。根據(jù)Lewisetal.，/軀力43:107-116(2000)的方法，產(chǎn)油菌林(其細胞干重的20%以上均為脂肪酸)的篩選基于以下結(jié)果GCPUFA生產(chǎn)情況、生物量產(chǎn)率、最高TFA、DHA,其次是EPA濃度(圖11)。生物量、TFA以及DHA和EPA產(chǎn)率的數(shù)值范圍分別為100至2300mgL—\27.1至321.14、5.18至83.63和2.97至21.25mgg—1(圖14)。在液體培養(yǎng)基中生長(68個中的54個)的所有分離林均產(chǎn)生了大量co-3多不飽和脂肪酸尤其是DHA，該DHA占這些細胞C20至C22總含量的22至80%(圖11)。這肯定了之前的結(jié)果，即從寒溫帶環(huán)境中分離出來的破嚢壺菌具有生產(chǎn)的DHA占所存在總脂肪酸的最高至53%的脂肪酸生產(chǎn)情況(Bowlesetal.，/A/"ec細/70:193-202(1999)和Huangetal.，他r^/o"c力/o/5:450-457(2003))。特別值得關(guān)注的是0NC-T18,它可產(chǎn)生占其C20至C22含量最高至90%的DHA,該DHA大約為細胞內(nèi)總脂肪酸的35%。已表明該DHA含量與幾種用于商業(yè)化生產(chǎn)的菌林例如裂殖壺菌屬種ATCC20888(32%)和S.1imacinumMYA-1381/SR21(34%)的DHA含量相同(Barclayetal，/J///戶力/co/6:123-129(1994)和Yokochietal.，W"oWo/Wo/ec力/70/49:72-76，(2003))。此外，所有分離林均合成占所鑒定總PUFA的2。/。至20。/。w/w的二十碳五烯酸(EPA)(圖11)。除了所產(chǎn)生的co-3油之外，全部分離株中約80°/能合成0)-6PUFA、花生四烯酸(AA)或二十二碳五烯酸(DPA)，其濃度分別介于1至18%和3至7%w/w之間(圖11)。Huang等人(他r5/Wec力"o/5:450-457(2003))認為，對于自日本和斐濟的熱帶沿海水域分離的破嚢壺菌而言，可描述的有五種不飽和脂肪酸生產(chǎn)情況，即DHA/DPA(n-6)、DHA/DPA/EPA、DHA/EPA、DHA/DPA/EPA/AA和DHA/DPA/EPA/AA/二十二碳四烯酸(Huangetal.,"/0&c/w20/5:450-457(2003))。就此破嚢壺菌(自AtlanticCanada的溫帶水域分離得到)收集物而言，可確定有四種PUFA生產(chǎn)情況，其中三種與上述的那些相同，即占收集物7.4%的DHA/DPA/EPA、占收集物13%的DHA/EPA和74%的DHA/DPA/EPA/AA，第四種包括5.6%的DHA/EPA/AA的混合物。通過對18SrDM基因進行直接測序，0NC-T18被肯定地鑒定為破嚢壺菌目(Thraustochytrid)的一員(GenBank編號DQ374149)。系統(tǒng)進化分析表明，0NC-T18與紋狀破嚢壺菌T91-6形成了單獨的一組(同一性為97.5%)(圖12)(LeanderandPorter,Mycologia93:459-464(2001))。而自日本沿海溫帶水域收集、并被發(fā)現(xiàn)是DHA的重要生產(chǎn)者(Carmonaetal.,A/"ec力加/A/oc力e/z67:884-888(2003)和Huangetal.，#ar"2'WecA/o/5:450-457(2003))的石皮嚢壺菌牙+菌種MBIC11093、Nl-27和破嚢壺菌屬種CHN-1分別表現(xiàn)出與0NC-T18具有96、95.5和94.5%的相似性。圖12所示破嚢壺菌科的全部成員之間遺傳多樣性相當(dāng)?shù)?，所有菌種之間的相似性介于97.5-91.0%之間。然而，這些菌種遍布全球，并且有三分之二分離自日本、中國和以色列的熱帶沿海水域，而剩下的分離自美國、歐洲和加拿大的溫帶水域。與破嚢壺菌屬種KH105或S.limacinumSR21的脂肪酸生產(chǎn)情況相似，0NC-T18的脂肪酸生產(chǎn)情況包括高含量的C22PUFA、極低水平的C18和C20FA，并且出現(xiàn)奇數(shù)碳鏈的飽和脂肪酸(15:0和17:0)。此外，對菌林ONC-T18、SR21和KH105的碳和氮利用情況的分析給出了相似的吸收才莫式。菌林ONC-T18中n-6DPA的含量介于6-10%之間，在考慮到n-6DPA在生物圏中存在有限時，該含量看起來非常高。然而，據(jù)Nakahara等人(/J邁^7C力e邁Soc73:1421-1426(1996))才艮道在裂殖壺菌屬種SR21(6-10%)中、Ellenbogen等人(Co邁/7A/oc力咖29:805-81(1969))才艮道在金黃破嚢壺菌(9.5%)和粉紅破嚢壺菌(6.6W中有著相似水平的n-6DPA。對ONC-T18在三種不同的培養(yǎng)裝置((l)瓊脂板、(2)錐形燒瓶和(3)生物反應(yīng)器)并在相同培養(yǎng)基上生長的脂肪酸生產(chǎn)情況(圖13)的分析表明，從瓊脂板到生物反應(yīng)器，所存在的PUFA的多樣性有所減少，并且TFA總體上升高。具體而言，瓊脂板展現(xiàn)出PUFA陣列(array)，而在燒瓶和生物反應(yīng)器中生長的培養(yǎng)物主要為一種或兩種中間產(chǎn)物(圖13)。金黃破嚢壺菌在培養(yǎng)燒瓶中比在攪拌發(fā)酵罐中生長更為旺盛(Ildaetal.，/尸er加//A/oe/7g81:76-78(1996)，與^目比，ONC-T18在生物反應(yīng)器中生長更佳。該結(jié)果與Nakahara等人(Nakaharaetal.，/^zC力e邁5oc73:1421-1426(1996))的結(jié)果一致，他們發(fā)現(xiàn)裂殖壺菌屬種SR21對機械攪拌表現(xiàn)出高的抗性，從而在生物反應(yīng)器條件下生長旺盛。此夕卜，發(fā)現(xiàn)在破嚢壺菌屬種ONC-T18的平板、燒瓶和生物反應(yīng)器發(fā)酵期間產(chǎn)生類胡蘿卜素色素，導(dǎo)致褪為淺橙色。這些抗氧化劑的生產(chǎn)在生物反應(yīng)器發(fā)酵中最活躍，并與脂肪酸生產(chǎn)相伴。另外，通過使用HPLC質(zhì)語法，確定這些抗氧化劑化合物被鑒定為與各種PUFA綴合的壞青素、玉米黃素、角質(zhì)素、海膽酮和P-胡蘿卜素(圖14)。據(jù)報道在原生生物的thraustochytid群的各成員中有著相似的結(jié)果。具體而言，已表明集生裂殖壺菌可生產(chǎn)海膽酮和角質(zhì)素(Valadon，7>a/^Ar#7"/Soc67:1-15(1976))，而Carmona等人Cff/os"'A/ofec力/o/A/oc力e巡67:884—888(2003))和Huang等人(#ar》/0"c力/70/5:450-457(2003))證實，奸青素、海膽酮、角質(zhì)素、芬尼黃質(zhì)(并非0NC-T18中的玉米黃素)和p-胡蘿卜素由破嚢壺菌屬種CHI-1(0NC-T18的近親菌種)生產(chǎn)(圖12)。在該研究中，發(fā)現(xiàn)這些類胡蘿卜素的濃度的數(shù)量級比其在CHN-1中的要低，并且主要化合物為P-胡蘿卜素而非蝦青素。因此，在破嚢壺菌某些種內(nèi)，PUFA和類胡蘿卜素生產(chǎn)可聯(lián)合起來，從而使得所生產(chǎn)的儲存脂肪可免于被氧化。之前已確定，通過改變培養(yǎng)物的生長條件，主要脂肪酸組分(豆蔻酸、棕櫚酸和油酸)的相對量可得到某種程度的改變(Ildaetal.，/,er邁e/^A/oe/7g81:76-78(1996))。通過這種方式，可操縱最終的脂肪酸組分，由此可在發(fā)酵期間以可控方式操縱所需PUFA的物理性質(zhì)(Sijtsmaetal.:Wece/^M"ere/2:219-232(1998))。在確定0NC-T18中抑制生物量和co-3PUFA兩者產(chǎn)生的因素的嘗試中，對營養(yǎng)培養(yǎng)基中的碳、氮和海鹽組分(表9)以及培養(yǎng)時間(圖15)進行了控制。表9:破嚢壺菌屬種ONC-T18的平均生物量產(chǎn)量(SD〈15。/。)、總脂肪酸(TFA)和■含量'雄翁:::',:畫,^雄人認,:,華a;i繊縱.;gfg暴g，虔嫩,微輔:rjg準歐j512.135.2129.180.182013.7329.5924.010.984016.6959.3923.882.376021.0851.0126.172.8110018.4069.4931.554.0316010.689.4030.010.30r賦:;浙雜K,氣'^》pF氛錄;:,:ifp'i■mn，，"《oonon1《/;10022.3334.5320.201.568222.8144.0017.521.726422.6450.6916.231.864624.4669.0724.194.092826.0981.7320.994.470107.501.9728.810.04:f,效':224.7059.2331.444.60621.0851.0126.172.811522.9069.3225.324.023017.7661.0225.252.744017.2768.2124.022.835018.7759.6322.562.53在該研究中，由于氮濃度下降，總脂肪酸含量升高，并且在酵母提取物或谷氨酸單鈉濃度為1°/。(w/v)時獲得的總脂肪酸含量最高(約80%)。然而，低氮濃度的培養(yǎng)物同樣限制了細胞生長，并由此限制了總脂肪酸的產(chǎn)生。在該實驗中，使用8gL—i谷氨酸單鈉和2gL—i酵母提取物可獲得最佳產(chǎn)量產(chǎn)生26.1gL^生物量和4.5gL1DHA(表9)。此外，碳升高到最高至100gL—i有效地提高了DHA產(chǎn)量，這與破嚢壺菌屬種SR21獲得的結(jié)果(Yokochietal.，場/腸i"o6A/A/"ec力/o/49:72_76，(2003))一致，而與金黃破嚢壺菌所給出的結(jié)果相反，在金黃破嚢壺菌中，高于10gL—1的葡萄糖濃度是抑制性的(Ildaetal.，/尸er巡e/^A'oe/^81:76-78(1996))。在葡萄糖培養(yǎng)基中獲得了高于4.0gL一'的最高DHA產(chǎn)量，并且產(chǎn)量比金黃石皮嚢壺菌(Bajpaietal.，/J巡。//C力e邁ibc68:509-514(1991))和粉紅石皮嚢壺菌(LiandWard,/ZocT13:238-241(1994))的高出五倍，并與裂殖壺菌屬種SR21和KH105(Akietal.，/j巡C力e巡5bc80:789-794(2003))的相當(dāng)。最后，0NC-T18展現(xiàn)出典型的廣耐鹽能力，能耐受的鹽度范圍為2.0至50.0gL—、產(chǎn)生的生物量產(chǎn)率在25-30%之間變化(表9)。在同一實驗中，發(fā)現(xiàn)DHAgL—1值在最佳值(4.6gL—"和最小值(2.5gL力之間的變化最高達到了45%(表9)。由0NC-T18在168h期間于5L生物反應(yīng)器中產(chǎn)生得到的生物量、TFA和DHA示于圖15。所繪出的生長曲線是在相同條件下獲得的幾條典型曲線。120h之后獲得了最大生物量產(chǎn)量，此時接近碳源(將葡萄糖)耗盡時間點。這也是生物量中的總脂肪酸含量達到最大值(約占生物量的70%)時間點。有意義的是，在培養(yǎng)僅24h之后，DHA含量達到峰值，占總脂肪酸的30%，此后始終維持在20-25%。這些結(jié)果與其它產(chǎn)生脂肪酸的破嚢壺菌菌林的一致，然而在這些反應(yīng)出現(xiàn)速度方面有所不同。c)討論此前，大部分對Labyrinturomycota的研究識別到的菌林都不能以高于20%的生物量的量儲存脂肪酸。例如，在分離出能累積最高占生物量50%的脂肪的裂殖壺菌屬種SR21之前，金黃破嚢壺菌是最好的累積者(20%)(Bajpaietal.，/J邁0/7Soc68:509—514(1991))。然而，0NC-T18能累積最高占其生物量80%的脂質(zhì)。對于累積油的產(chǎn)油〕微生物例如0NC-T18，通常應(yīng)該在具有一定量氮(通常在24至36h之后耗盡)和足量碳源的培養(yǎng)基中生長。一旦氮被耗盡，產(chǎn)油微生物會繼續(xù)吸收碳源，但是由于缺少氮(由此阻止了蛋白和核酸的合成)而不再能進行細胞分裂。結(jié)果是這些碳源(即糖類如葡萄糖)被轉(zhuǎn)化成為儲存油。在這方面，認為0NC-T18比其它破嚢壺菌菌林例如G13生長更為緩慢(Bowlesetal.，/"/WecAoo/70:193-202Q999)和Huangetal.，胞"/Wec力加/5:450-457(2003)),然而它以更快速率產(chǎn)生DHA，并表現(xiàn)出合成更高量總脂肪酸的獨特能力。最后，值得注意的是0NC-T18能在極低的鹽濃度下生長、且具有高的生物量和總脂肪酸產(chǎn)率的能力。這使得它可以在大規(guī)模生產(chǎn)時減少了鹽水對工業(yè)發(fā)酵設(shè)備的腐蝕性。權(quán)利要求1.一種具有18S序列的真核微生物，其中所述18S序列與SEQIDNO:1列出的序列具有至少94％的同一性。2.權(quán)利要求1的微生物，其中所述微生物產(chǎn)生的不飽和脂肪酸具有圖2所示的特征。3.權(quán)利要求1的微生物，其中所述微生物來自網(wǎng)黏菌門(phylumlabyrinthulomycetes)。4.權(quán)利要求1的微生物，其中所述微生物來自網(wǎng)黏菌綱(classlabyrinthulomycetes)。5.權(quán)利要求l的微生物，其中所述微生物來自破嚢壺菌亞綱(subclassthraustochytridae)。6.權(quán)利要求1的微生物，其中所述微生物來自破嚢壺菌目(orderthraustochytriales)。7.權(quán)利要求1的微生物，其中所述微生物來自破嚢壺菌科(familythraustochytriaceae)。8.權(quán)利要求1的微生物，其中所述微生物來自破嚢壺菌屬(genusSchizochytrium)。9.權(quán)利要求1的微生物，其中所述微生物為破嚢壺菌屬種(SchizochytriumSp.)。10.權(quán)利要求1的微生物，其中所述微生物為金黃破嚢壺菌(Thraustochytriumaureum)。11.權(quán)利要求1的微生物，其中所述微生物為粉紅破嚢壺菌(Thraustochytriumroseum)。12.權(quán)利要求1的微生物，其中所述微生物為紋狀破嚢壺菌(Thraustochytriumstriatum)。13.權(quán)利要求1的微生物，其中所述微生物來自裂殖壺菌屬(genusSchizochytrium)。14.權(quán)利要求1的微生物，其中所述微生物為裂殖壺菌屬種(SchizochytriumSp.)。15.權(quán)利要求l的微生物，其中所述微生物含有w-3或w-6脂肪酸。16.權(quán)利要求1的微生物，其中所述微生物含有DM或DPA。17.權(quán)利要求1的微生物，其中所述微生物產(chǎn)生的脂質(zhì)或脂肪酸組分為至少約4Wt。/n至6Wt°/n。18.權(quán)利要求17的微生物，其中所述脂質(zhì)包括DHA。19.權(quán)利要求17的微生物，其中所述脂質(zhì)組合物含有占約25w"/。脂肪酸組分至約40w"/。脂肪酸組分的n-3DHA、占約6wt。/。脂肪酸組分至約10wt^脂肪酸組分的n-6DPA以及占約0w"/n脂肪酸組分至約3wt°/o脂肪酸組分的n-3EPA。20.權(quán)利要求1的微生物，其中所述微生物來自破嚢壺菌科并且具有ATCC編號20888、20889、20890、20891或20892。21.—種包含具有18S序列的真核微生物的組合物，其中所述18S序列與SEQIDNO:1列出的序列具有至少94%的同一性。22.權(quán)利要求21的組合物，其中所述組合物進一步包含有培養(yǎng)基。23.權(quán)利要求21的組合物，其中所述組合物進一步包含有營養(yǎng)物質(zhì)。24.權(quán)利要求21的組合物，其中所述組合物為生物量。25.權(quán)利要求21的組合物，其中所述真核微生物來自網(wǎng)黏菌門(phylumlabyrinthulomycota)。26.權(quán)利要求21的組合物，其中所述真核微生物來自網(wǎng)黏菌綱(classlabyrinthulomycetes)。27.權(quán)利要求21的組合物，其中所述真核微生物來自破嚢壺菌亞綱(subclassthraustochytridae)。28.權(quán)利要求21的組合物，其中所述真核微生物來自破嚢壺菌目(orderthraustochytriales)。29.權(quán)利要求21的組合物，其中所述真核微生物來自破嚢壺菌科(familythraustochytriaceae)。30.權(quán)利要求21的組合物，其中所述真核微生物來自破嚢壺菌屬(genusf力raw"ocj^W咖)。31.權(quán)利要求21的組合物，其中所述真核微生物為破嚢壺菌屬種(^raw"(c力/f/7咖sp.)。32.權(quán)利要求21的組合物，其中所述真核微生物為金黃破嚢壺菌(T力rafoc力yfW咖sw/"e咖)。33.權(quán)利要求21的組合物，其中所述真核微生物為粉紅破嚢壺菌34.權(quán)利要求21的組合物，其中所述真核微生物為紋狀破嚢壺菌(Thraustochytriumstraitum)。35.權(quán)利要求21的組合物，其中所述真核微生物來自裂殖壺菌屬(genusSchizochytrium)。36.權(quán)利要求21的組合物，其中所述真核微生物為裂殖壺菌屬種(Schizochytriumsp.)37.權(quán)利要求21的組合物，其中所述真核微生物產(chǎn)生的脂肪酸具有圖2所示的特征。38.權(quán)利要求37的組合物，其中所述不飽和脂肪酸包括(w-3或w-6脂肪酸。39.權(quán)利要求37的組合物，其中所述不飽和脂肪酸包括DHA或DPA。40.權(quán)利要求21的組合物，其中所述真核微生物可產(chǎn)生的脂質(zhì)或脂肪酸組分為至少約4wt%至6wt%。41.權(quán)利要求40的組合物，其中所述脂質(zhì)包括DHA。42.權(quán)利要求40的組合物，其中所述脂質(zhì)組合物含有占約25w"/n脂肪酸組分至約40wt%脂肪酸組分的n-3DHA、占約6wt%脂肪酸組分至約10wt%。脂肪酸組分的n-6DPA以及占約0wt%。脂肪酸組分至約3wt%脂肪酸組分的n-3EPA。43.權(quán)利要求21的組合物，其中所述真核微生物來自破嚢壺菌科并且具有ATCC編號20888、20889、20890、20891或20892。44.一種包含具有18S序列的真核樣史生物的組合物，其中所述18S序列與SEQIDNO:1列出的序列具有至少80%的同一性。45.—種組合物，含有占約25wt%脂肪酸組分至約40wt%脂肪酸組分的n-3DHA、占約6wt%脂肪酸組分至約10wt%脂肪酸組分的n-6DPA以及占約0wt%脂肪酸組分至約3wt%脂肪酸組分的n-3EPA。46.—種制備脂質(zhì)組合物的方法，所述方法包括在異氧培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求1-20任一項的真核微生物，并分離所述脂質(zhì)組合物。47.根據(jù)權(quán)利要求46的方法制備得到的脂質(zhì)組合物。48.—種送遞裝置，包含有權(quán)利要求21-45或47任一項的組合物。49.權(quán)利要求48的送遞裝置，其中所述送遞裝置包括^t嚢、微球、納米球或納米顆粒、脂質(zhì)體、noisome、納米紅質(zhì)體、固體-液體納米顆粒、亮丙瑞林、凝膠、凝膠膠嚢、片劑、洗劑、膏劑、噴霧劑、乳劑或粉劑。50.—種微嚢，包含基本微嚢的聚集物和負栽物質(zhì)，各個基本微嚢個體均具有主殼，其中所述負載物質(zhì)含有權(quán)利要求21-45或47任一項的組合物，并被主殼包封，并且其中所述聚集物#:外殼包封。51.權(quán)利要求50的微嚢，其中所述主殼和/或外殼包含表面活性劑、明膠、聚磷酸酯、多糖或它們的混合物。52.權(quán)利要求50的微嚢，其中所述主殼和/或外殼包含B型明膠、聚磷酸酉旨、阿拉伯膠、藻酸鹽、殼多糖、角叉菜膠、果膠、淀粉、變性淀粉、ot-乳清蛋白、p-乳球蛋白、卵清蛋白、聚山梨酯、麥芽糊精、環(huán)糊精、纖維素、甲基纖維素、乙基纖維素、羥丙曱基纖維素、羧曱基纖維素、乳蛋白質(zhì)、乳清蛋白、大豆蛋白、油菜籽蛋白、白蛋白、kosher明膠、non-kosher明膠、Halal明膠或non-Halal明膠，或它們的混合物。53.權(quán)利要求50的微嚢，其中所述主殼和/或外殼包含復(fù)合凝聚層。54.權(quán)利要求50的微嚢，其中所述主殼和/或外殼包含A型明膠。55.權(quán)利要求50的微嚢，其中所述主殼和/或外殼包含魚明膠。56.權(quán)利要求50的微嚢，其中所述主殼和/或外殼包含Bloom值為約0至約300的明膠。57.權(quán)利要求50的微嚢，其中所述主殼和/或外殼包含Bloom值為約0至約50的明膠。58.權(quán)利要求50的微嚢，其中所述主殼和/或外殼包含Bloom值為約51至約300的明膠。59.權(quán)利要求50的微嚢，其中所述主殼和/或外殼包含Bloom值為約0、約210、約220或約240的明膠。60.權(quán)利要求50的微嚢，其中所述主殼和/或外殼包含明膠和聚磷酸酯的凝聚層。61.權(quán)利要求50的微嚢，其中所述負載物質(zhì)包含來自破嚢壺菌、裂殖壺菌或它們的混合物的油。62.權(quán)利要求50的微嚢，其中所述外殼的平均直徑為約1um至約2，000um。63.權(quán)利要求50的微嚢，其中所述外殼的平均直徑為約20um至約1，000um。64.權(quán)利要求50的微嚢，其中所述外殼的平均直徑為約30mum至約80mum。65.權(quán)利要求50的微嚢，其中所述外殼的平均直徑為約40mum至約10mum。66.權(quán)利要求50的微嚢，其中所述外殼的平均直徑為約0.1mum至約5mum。67.權(quán)利要求50的微嚢，其中所述負載物質(zhì)以重量計為微嚢的約20%至約90%。68.權(quán)利要求50的微嚢，其中所述負載物質(zhì)以重量計為微嚢的約50%至約70%。69.—種營養(yǎng)添加劑，包含權(quán)利要求21-45或47任一項的組合物、權(quán)利要求48-49任一項的送遞裝置或權(quán)利要求50-68任一項的微嚢。70.權(quán)利要求69的營養(yǎng)添加劑，其中所述添加劑的形式為片劑、凝膠膠嚢、膠嚢、液體或糖漿形式。71.—種食品，包含權(quán)利要求21-45或47任一項的組合物、權(quán)利要求48-49任一項的送遞裝置、權(quán)利要求50-68任一項的微嚢或權(quán)利要求69-704壬一項的營養(yǎng)添力口劑。72.權(quán)利要求71的食品，其中所述食品為烘焙食品、面食、肉制品、冷凍乳制品、乳制品、奶酪制品、蛋制品、調(diào)味品、湯粉、點心、堅果制品、植物蛋白制品、硬糖、軟糖、家禽產(chǎn)品、經(jīng)加工的果汁、砂糖、醬油、肉汁、糖漿、營養(yǎng)飲品、飲料、飲料干粉、果醬或果凍、嬰兒配方或嬰兒食品。73.權(quán)利要求71的食品，其中所述食品為魚制品、寵物伴侶食品、家畜飼料或水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料。74.權(quán)利要求71的食品，其中所述食品為面包、玉米餅、谷類食品、香腸、雞肉、水淇淋、酸奶、牛奶、沙拉調(diào)味料、米糠、果汁、飲料干粉、面包巻、餅干、薄脆餅干、快餐、水果餡餅或蛋糕。75.—種將組合物送遞給受試者的方法，包括給予所述受試者權(quán)利要求48-49任一項的送遞裝置、權(quán)利要求50-68任一項的^t嚢、權(quán)利要求69-70任一項的營養(yǎng)添加劑或權(quán)利要求71-74任一項的食品。76.權(quán)利要求75的方法，其中所述受試者為哺乳動物。77.權(quán)利要求75的方法，其中所述受試者為人。78.權(quán)利要求50-68任一項的微嚢用于制備將負載物質(zhì)送遞給受試者的藥物的用途。79.—種降低受試者體內(nèi)膽固醇水平、甘油三酯水平或它們的組合的方法，包括給予所述受試者有效量權(quán)利要求21-45或47任一項的組合物、權(quán)利要求48-49任一項的送遞裝置、權(quán)利要求50-68任一項的微嚢、權(quán)利要求69-70任一項的營養(yǎng)添加劑或權(quán)利要求71-74任一項的食品的步驟。80.—種補充受試者體內(nèi)必需樣史量元素的方法，所述方法包括給予所迷受試者有效量權(quán)利要求21-45或47任一項的組合物、權(quán)利要求48-49任一項的送遞裝置、權(quán)利要求50-68任一項的微嚢、權(quán)利要求69-70任一項的營養(yǎng)添加劑或權(quán)利要求71-74任一項的食品的步驟，其中所述組合物、送遞裝置、微嚢、添加劑和食品含有必需微量元素。81.—種提高受試者體內(nèi)胰島素敏感度的方法，包括給予所述受試者有效量權(quán)利要求21-45或47任一項的組合物、權(quán)利要求48-49任一項的送遞裝置、權(quán)利要求50-68任一項的微嚢、權(quán)利要求69-70任一項的營養(yǎng)添加劑或權(quán)利要求71-74任一項的食品的步驟。82.—種減輕受試者高血糖癥的方法，包括給予所述受試者有效量權(quán)利要求21-45或47任一項的組合物、權(quán)利要求48-49任一項的送遞裝置、權(quán)利要求50-68任一項的微嚢、權(quán)利要求69-70任一項的營養(yǎng)添加劑或權(quán)利要求71-74任一項的食品的步驟。83.—種減輕受試者高膽固醇血癥的方法，包括給予所述受試者有效量權(quán)利要求2卜45或47任一項的組合物、權(quán)利要求48-49任一項的送遞裝置、權(quán)利要求50-68任一項的微嚢、權(quán)利要求69-70任一項的營養(yǎng)添加劑或權(quán)利要求71-74任一項的食品的步驟。84.—種減少受試者體脂肪的方法，包括給予所述受試者有效量權(quán)利要求21-45或47任一項的組合物、權(quán)利要求48-49任一項的送遞裝置、權(quán)利要求50-68任一項的微嚢、權(quán)利要求69-70任一項的營養(yǎng)添加劑或權(quán)利要求71-74任一項的食品的步驟。85.—種促進受試者減肥的方法，包括給予所述受試者有效量權(quán)利要求21-45或47任一項的組合物、權(quán)利要求48-49任一項的送遞裝置、權(quán)利要求50-68任一項的微嚢、權(quán)利要求69-70任一項的營養(yǎng)添加劑或權(quán)利要求71-74任一項的食品的步驟。86，一種治療或預(yù)防受試者糖尿病的方法，包括給予所述受試者有效量權(quán)利要求21-45或47任一項的組合物、權(quán)利要求48-49任一項的送遞裝置、權(quán)利要求50-68任一項的微嚢、權(quán)利要求69-70任一項的營養(yǎng)添加劑或權(quán)利要求71-74任一項的食品的步驟。87.—種藥物制劑，包含權(quán)利要求21-45或47任一項的組合物、權(quán)利要求48-49任一項的送遞裝置、權(quán)利要求50-68任一項的微嚢以及藥物栽體。88.—種食品，包含權(quán)利要求21的組合物。89.權(quán)利要求88的食品，其中所述食品烘焙食品、面食、肉制品、冷凍乳制品、乳制品、奶酪制品、蛋制品、調(diào)p木品、湯粉、點心、堅果制品、植物蛋白制品、硬糖、軟糖、家禽產(chǎn)品、經(jīng)加工的果汁、砂糖、醬油、肉汁、糖漿、營養(yǎng)々欠品、飲料、々欠料干粉、果醬或果凍、嬰兒配方或嬰兒食品。90.權(quán)利要求88的食品，其中所述食品為魚制品、寵物伴侶食品、家畜飼料或水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料。91.權(quán)利要求89的食品，其中所述食品為面包、玉米餅、谷類食品、香腸、雞肉、水淇淋、酸奶、牛奶、沙拉調(diào)味料、米糠、果汁、飲料干粉、面包巻、餅干、薄脆餅干、快餐、水果餡餅或蛋糕。92.—種降低受試者體內(nèi)膽固醇水平、甘油三酯水平或它們的組合的方法，包括給予有效量權(quán)利要求21的組合物、含有權(quán)利要求21的組合物的營養(yǎng)添加劑、含有權(quán)利要求21的組合物的送遞裝置或含有權(quán)利要求21的組合物的食品的步驟。93.—種補充受試者體內(nèi)必需微量元素的方法，包括給予有效量權(quán)利要求21的組合物、含有權(quán)利要求21的組合物的營養(yǎng)添加劑、含有權(quán)利要求21的組合物的送遞裝置或含有權(quán)利要求21的組合物的食品的步驟。94.一種提高受試者體內(nèi)胰島素敏感度的方法，包括給予有效量權(quán)利要求21的組合物、含有權(quán)利要求21的組合物的營養(yǎng)添加劑、含有權(quán)利要求21的組合物的送遞裝置或含有權(quán)利要求21的組合物的食品的步驟。95.—種減輕受試者高血糖癥的方法，包括給予有效量權(quán)利要求21的組合物、含有權(quán)利要求21的組合物的營養(yǎng)添加劑、含有權(quán)利要求21的組合物的送遞裝置或含有權(quán)利要求21的組合物的食品的步驟。96.—種減輕受試者高膽固醇血癥的方法，包括給予有效量權(quán)利要求21的組合物、含有權(quán)利要求21的組合物的營養(yǎng)添加劑、含有權(quán)利要求21的組合物的送遞裝置或含有權(quán)利要求21的組合物的食品的步驟。97.—種減少受試者體脂肪的方法，包括給予有效量權(quán)利要求21的組合物、含有權(quán)利要求21的組合物的營養(yǎng)添加劑、含有權(quán)利要求21的組合物的送遞裝置或含有權(quán)利要求21的組合物的食品的步驟。98.—種促進受試者減肥的方法，包括給予有效量權(quán)利要求21的組合物、含有權(quán)利要求21的組合物的營養(yǎng)添加劑、含有權(quán)利要求21的組合物的送遞裝置或含有權(quán)利要求21的組合物的食品的步驟。99.一種治療或預(yù)防受試者糖尿病的方法，包括給予有效量權(quán)利要求21的組合物、含有權(quán)利要求21的組合物的營養(yǎng)添加劑、含有權(quán)利要求21的組合物的送遞裝置或含有權(quán)利要求21的組合物的食品的步驟。100.—種藥物制劑，包含權(quán)利要求21的組合物。全文摘要公開了與真核微生物有關(guān)的組合物和方法，所述真核微生物可產(chǎn)生可被純化和使用的不飽和脂肪酸。文檔編號A23K1/00GK101389749SQ200680029630公開日2009年3月18日申請日期2006年6月7日優(yōu)先權(quán)日2005年6月7日發(fā)明者A·J·溫德斯特,A·M·伯杰,C·J·巴羅,H·瑞迪亞寧塔斯申請人:加拿大海洋營養(yǎng)食品有限公司