專利名稱：：編碼超氧化物歧化酶的aav載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于篩選能有效治療肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)的化合物的體外模型。本發(fā)明也涉及基因治療載體和方法。
背景技術(shù)：
：神經(jīng)退行性疾病呈現(xiàn)了主要的公共健康問題。例如，肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)是涉及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元選擇性滅絕的無情的進(jìn)行性致死疾病。關(guān)于ALS的進(jìn)一步的情況能在OnlineMendelianInheritanceinMan(OMIM)進(jìn)入號(hào)#105400'和RowlandandShneider(2001)Amyotrophiclateralsclerosis,TVew/MW.344:1688-1700中找到，其全部?jī)?nèi)容引入本文作為文獻(xiàn)。編碼超氧化物歧化酶(SOD)基因的突變同ALS相關(guān)。已知在哺乳動(dòng)物中存在3種SOD突變體。胞質(zhì)SOD是被SOD1編碼的銅鋅酶(Cu/ZnSOD)(WeisigerandFridovich(1973)/編.CTz亂248,4793-4796)。正如下文討論的，SOD1遺傳缺陷同家族性肌萎縮性側(cè)索硬化(fALS)相關(guān)。線粒體SOD(MnSOD)同錳元素相關(guān)并被SOD2編碼。Lietal((1995)A^wwGew^cs11，376-381)描述了編碼SOD2的基因被滅活的突變小鼠。被SOD3編碼(Carlssonetal.(1995)/Voc.JVW/.v4cadSc丄t/SJ92,6264-6268)并且也含有銅和鋅的第三種哺乳動(dòng)物SOD主要位于胞外。該基因的滅活導(dǎo)致不明顯的表型。大約20%的fALS同SOD1基因的突變有關(guān)(Julien,J.P.，CW/(2001)104:581-591)。過表達(dá)突變S0D1基因(甘氨酸93突變成丙氨酸(G93A))的轉(zhuǎn)基因鼠產(chǎn)生了具有許多fALS臨床和病理特征的顯性遺傳的成年麻痹紊亂癥(Gumeyetal.,5We"ce(1994)264:1772-1775)。然而，截至目前，導(dǎo)致ALS和大多數(shù)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病的運(yùn)動(dòng)祌經(jīng)元退化的分子機(jī)制依然所知甚少，并且，當(dāng)前并沒有能用來預(yù)防或治療ALS的方法。篩選能有效治療ALS的化合物的方法是無效率和費(fèi)力的，這妨礙了藥物的發(fā)現(xiàn)。盡管上面討論的ALS轉(zhuǎn)基因鼠代表了評(píng)價(jià)候選化合物功效的有用的體內(nèi)方法，但是用小鼠進(jìn)行的試驗(yàn)相對(duì)昂貴、耗時(shí)并且不能很好適用于高通量篩選。其他實(shí)驗(yàn)依賴于不充足且不易受受控實(shí)驗(yàn)操作控制的死后人類標(biāo)本中基因表達(dá)的研究。ALS有效的體外模型將促進(jìn)潛在治療性化合物的快速篩選。證明在體外具有有益效果的化合物然后能用附加實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證，例如使用上面討論的轉(zhuǎn)基因鼠。然而，現(xiàn)存的體外方法不適合高通量篩選。例如，在一個(gè)方法中，原代培養(yǎng)物中的單個(gè)細(xì)胞用編碼突變SODl基因(例如G93A)的質(zhì)粒進(jìn)行微注射來模擬ALS中相同突變基因過表達(dá)造成的效應(yīng)。這樣的細(xì)胞然后能用目標(biāo)化合物處理來確定該化合物能否逆轉(zhuǎn)與S0D1過表達(dá)相關(guān)的諸如聚集物或包涵體形成的表型效應(yīng)。然而，微注射是費(fèi)力的并且僅能在有限數(shù)目的細(xì)胞上進(jìn)行操作，這使獲得統(tǒng)計(jì)學(xué)上穩(wěn)健的結(jié)果變得困難。'對(duì)篩選能有效逆轉(zhuǎn)或改善ALS效應(yīng)的化合物的模型系統(tǒng)的需求是存在，所述模型應(yīng)該能用于高通量篩選并且支持具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著數(shù)目的細(xì)胞的評(píng)價(jià)來確定目的化合物的功效。野生型SOD(非突變體)可能是有效的治療性試劑。大量的紊亂是氧化性應(yīng)激，即細(xì)胞中諸如超氧化物等有害活性氧存在的結(jié)果。參見例如，Cashetal.(2004)Cfeaiev.1:19-23。超氧化物歧化酶催化超氧化物到過氧化氫和分子氧的轉(zhuǎn)變。被SOD產(chǎn)生的過氧化氫隨后被過氧化氫酶轉(zhuǎn)變成分子氧和水，完成了超氧化物到更低反應(yīng)性并因此具有更少傷害性的氧形式的轉(zhuǎn)變。諸如維生素A、維生素C、谷胱甘肽、維生素E、胡蘿卜素、硫辛酸和輔酶Qu)的抗氧化劑能被給予來降低這樣的活性氧的產(chǎn)生和積累，但是，當(dāng)全身性給予的時(shí)候，這樣的試劑在細(xì)胞中可能不會(huì)積累到有效水平。作為另一種選擇，酶SOD到這樣的細(xì)胞的持久的傳遞可能會(huì)幫助降低超氧化物聚集的有害效應(yīng)。對(duì)能傳遞SOD基因到能受益于SOD活性的受治者細(xì)胞的治療載體和方法的需求是存在的。這樣的受治者包括那些遭受引起超氧化物過量產(chǎn)生或積累的紊亂癥的痛苦的人，那些暴露于引起過量超氧化物產(chǎn)生或積累的的環(huán)境中的人，甚至是那些暴露于正常老化相關(guān)的蓄積性氧化損傷的個(gè)體。
發(fā)明內(nèi)容在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及編碼超氧化物歧化酶(SOD)的腺相關(guān)病毒(AAV)載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述SOD是SODl。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述SOD1基因含有ALS相關(guān)的諸如Gly93Ala的突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述編碼SOD的AAV載體(AAV-SOD)用于傳遞所述SOD基因到目標(biāo)細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，目標(biāo)細(xì)胞位于患有疾病或狀態(tài)的受治者內(nèi)，對(duì)這些受治者，SOD到目標(biāo)細(xì)胞的傳遞提供了治療的益處。在某些實(shí)施方案中，SOD的傳遞在受治者上產(chǎn)生了治療性效果。在其他實(shí)施方案中，疾病或病態(tài)選自帕金森綜合癥、亨廷頓舞蹈癥、退化性眼疾病(例如黃斑變性、色素性視網(wǎng)膜炎)、阿爾茨海默氏癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、局限性腸炎、佩羅尼氏病、漬瘍性結(jié)腸炎、腦缺血癥(中風(fēng))、心肌梗塞(心臟病發(fā)作)、腦和/或脊髓損傷、重灌流損傷、ALS、唐氏綜合癥、白內(nèi)障、精神分裂癥、癲癇癥、人白血病和其他癌癥或糖尿病。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及篩選有效治療肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS)的化合物的模型系統(tǒng)，該模型系統(tǒng)包含多個(gè)用編碼含有ALS相關(guān)的諸如Gly93Ala突變的SOD1基因的AAV載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。在各個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的AAV載體衍生自AAV-2、AAV-5或AAV-6。在一個(gè)實(shí)施方案中，用所述AAV載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的多數(shù)包含在它們被發(fā)現(xiàn)的群體中至少80%的細(xì)胞，例如來源于嚙齒類動(dòng)物脊髓的細(xì)胞原代培養(yǎng)物。在某些實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞顯示了ALS相關(guān)的表型變化。在其他實(shí)施方案中，一種或多種篩選出的化合物降低或改善了這個(gè)表型變化。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及使用本發(fā)明模型系統(tǒng)篩選有效治療ALS的化合物的方法。圖1是傳遞命名為pVm-G93ASOD的hSODl—Gly93Ala的AAV載體的原理圖。hSODl-Gly93Ala的表達(dá)被雞P肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。表達(dá)框位于兩個(gè)AAV-2ITR序列之間。SODl-Gly93Ala在本文中也稱為"突變"SOD。圖2是傳遞稱為pVm-WTSOD的野生型人SOD1的rAAV載體的原理圖。wtSODl的表達(dá)被雞e-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。表達(dá)框位于兩個(gè)AAV-2ITR序列之間。具體實(shí)施例方式除非另外指明，本發(fā)明的實(shí)施將使用本領(lǐng)域技術(shù)中的病毒學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞和分子生物學(xué)以及重組DNA技術(shù)等傳統(tǒng)方法。這樣的技術(shù)已經(jīng)在文獻(xiàn)中得到了全面的闡述。參見例如，Sambrooketal.,Mo/ecw/arC7o"z'"g:爿丄a6orafo/^Mawwa/(CurrentEdition);￡W」C7o幽g.'j尸ra"/c"/J/praac/7，Vol.I&II(D.Glover,ed.);(9/加wwc/eo^sfe^y涵as7's(N.Gait,ed.，CurrentEdition);泡c/e/c/^n'^fe加'ow(B.Hames&S.Higgins,eds.,CurrentEdition);rraramjc^/o"朋d!Tram7加'ow(B.Hames&S.Higgins,eds"CurrentEdition);C7C/^"必ooA:o/尸arraWmses，vol.I&II(P.Tijssen,ed.);Fw"(ib,齒/2ndEdition,vol.I&II(BN.FieldsandD.M.Knipe，eds.);Freshney,CW/Mreo/JwVwa/CW/s，Mawwa/o/Sos/c7^c/zm々we(Wiley隱Liss,ThirdEdition);禾口Ausubeletal.(1991)Cw/re"f尸ratoco/sMo/ecw/ar(WileyInterscience，NY).本文所引用的所有出版物、專利、專利申請(qǐng)和數(shù)據(jù)庫登入號(hào)(包括OMIM登入號(hào))均全文引入本文作為參考。本發(fā)明涉及能被用于創(chuàng)造ALS的體外模型或作為治療劑的編碼SOD的AAV載體。爿LS被游S,突變?cè)诒景l(fā)明涉及到ALS模型系統(tǒng)的方面，被AAV載體編碼的SOD基因包含ALS相關(guān)的突變。如本文所用，術(shù)語"ALS相關(guān)的突變"是指在患有ALS的個(gè)體中比不患有ALS的個(gè)體中更頻繁發(fā)生的SOD基因中的突變。wtSODl的氮基酸序列在表1中列出。SOD1中已知的突變包括Ala4Ser，Ala4Thr，Ala4Val(A4V;147450.0012)，Cys6Gly，Cys6Phe，Val7Glu，Leu8Val，Leu8Gln，GlylOVal，Glyl2Arg，Vall4Met，Vall4Gly，Glyl6Ala，Glyl6Ser，Asnl9Ser，Phe20Cys，Glu21Gly，Glu21Lys，Gln22Leu，Gly37Arg(G37R;147450.0001)，Leu38Arg，Leu38Val(L38V;147450.0002)，Gly41Asp(G41D;147450.0004)，Gly41Ser，His43Arg，Phe45Cys，His46Arg(H46R;147450.0013)，Val47Phe，His48Arg，His48Gln，Glu49Lys，Thr54Arg，Cys57Arg，Ser59Ile，Asn65Ser，Leu67Arg，Gly72Cys，Gly72Ser，Asp76Tyr，Asp76Val，His80Ala，His謹(jǐn)rg，Leu84Val，Gly85Arg，Asn86Asp，Asn86Ser，Val87Met，Val87Ala，Ala89Thr，Ala89Val，Asp90Ala，Asp90Val，Gly93Ala(G93A;147450.0008)，Gly93Arg，Gly93Asp，Gly93Cys(G93C;147450.0007)，Gly93Ser，Gly93Val，Ala95Thr，Asp96Asn，Val97Met，GlulOOGly，GlulOOLys，Aspl01Asn，Aspl01Gly，Aspl01His,Uel04Phe，Leul06Val，IlelBThr(I113T;147450.0011)，Leul26Ter，Serl34Asn，Leul44Ser和Alal45Thr。突變后的編號(hào)在出現(xiàn)時(shí)代表那些突變的OMIM文獻(xiàn)編號(hào)。SODl突變也在Roseneta1.(1993)MutationsinCu/Znsuperoxidedismutasegeneareassociatedwithfamilialamyotrophiclateralsclerosis,iVa加re362:59-62;Cudkowicetal.(1997)Epidemiologyofmutationsinsuperoxidedismutaseinamyotrophiclateralsclerosis,J朋.TVs,/.41:210-221;Bellerocheetal.(1995).Familialamyotrophiclateralsclerosis/motorneurondisease(FALS):areviewofcurrentdevelopments,/MedGewd.32:841-847中披露。。盡管本文披露了大量的SOD1突變，但并不是所有這些突變?cè)趧?chuàng)建ALS的疾病模型中均有用。表1:wtSODl的氨基酸序列1ATKAVCVLKGDGPVQGHNFE,SNGPVKVWGSKGLTEGLHGFHVHEF51GDNTAGCTSAGPHFNPLSRK恥GPKDEERHVGDLGNVTADKDGVADVSffi101DSVISLSGDHCIIGRTLVVHEKADDLGKGGNEESTKTGNAGSRLACGVIG151IAQ(SEQIDNO,1)嚴(yán)被竊載沐腺相關(guān)病毒(AAV)已經(jīng)成功用來為基因治療傳遞基因，并且人類臨床實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明其具有巨大的希望(參見例如，Kayetal.,iVw.(2000)24:257-261)。作為唯一的基于非致病和復(fù)制缺陷病毒的病毒載體系統(tǒng)，重組AAV病毒體已經(jīng)成功地用于建立在多種組織中的增殖和末端分化細(xì)胞的有效且持久的基因轉(zhuǎn)移而沒有檢測(cè)到免疫反應(yīng)或毒性(Buder，H.,歷o/.C&w.(1999)380:613-622)。AAV基因組是包含大約4681個(gè)核苷酸的線性單鏈DNA分子。AAV基因組通常包含兩端具有反向末端重復(fù)序列(ITRs)的內(nèi)部非重復(fù)基因序列。ITRs的長(zhǎng)度大約為145個(gè)堿基對(duì)(bp)。ITRs具有包括作為DNA復(fù)制起點(diǎn)和病毒基因組包裝信號(hào)在內(nèi)的多個(gè)功能?；蚪M的內(nèi)部非重復(fù)部分包括已知為AAV復(fù)制(r印)和衣殼。"p)基因的兩段巨大開放閱讀框。r印和cqp基因編碼支持病毒復(fù)制和包裝入病毒粒的病毒蛋白。特別地，至少四種病毒蛋白的族從AAVr印區(qū)域表達(dá)，根據(jù)它們表觀的分子量分別命名為Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。AAV區(qū)域編碼至少三種蛋白，分別為VP1、VP2和VP3。通過刪除AAV基因組的內(nèi)部非重復(fù)序列(即r印和cop基因)并在ITRs間插入異源基因，AAV已經(jīng)被工程化來傳遞目的基因。異源基因被典型性地功能性地連接到能在合適條件下驅(qū)動(dòng)病人目標(biāo)細(xì)胞中的基因表達(dá)的異源啟動(dòng)子(組成型的、細(xì)胞特異的或可誘導(dǎo)的)上。諸如多腺苷酸位點(diǎn)的末端信號(hào)也能被包括進(jìn)來。AAV是依賴幫助者病毒的病毒；即，為了在野生環(huán)境中形成AAV病毒粒，它需要同幫助者病毒(例如腺病毒、皰疹病毒或牛痘病毒)共轉(zhuǎn)染。在缺少同幫助者病毒共轉(zhuǎn)染的情況下，AAV建立了病毒基因組插入宿主細(xì)胞染色體但具有侵染性的病毒粒未被生產(chǎn)的潛伏狀態(tài)。隨后的幫助者病毒的感染"拯救"了被整合的基因組，支持它復(fù)制并將它的基因組包裝入侵染性的AAV病毒粒。雖然AAV能侵染不同物種的細(xì)胞，但所述幫助者病毒必須同宿主細(xì)胞屬于同一個(gè)物種。這樣，例如，人AAV將在同犬腺病毒共轉(zhuǎn)染的犬細(xì)胞中復(fù)制。在本發(fā)明的優(yōu)先實(shí)施方案中，三重轉(zhuǎn)染方法(在美國專利N0.6,001,650中進(jìn)行了詳細(xì)地公開，將其全文引入本文作為文獻(xiàn))被用于生產(chǎn)rAAV病毒粒，因?yàn)檫@種方法不需要使用侵染性的幫助者病毒，這使被生產(chǎn)的rAAV病毒粒不含任何可檢測(cè)到的幫助者病毒成為可能。rAAV病毒粒的生產(chǎn)通過使用三種載體可以實(shí)現(xiàn)AAV幫助者功能載體，附屬功能載體和rAAV表達(dá)載體。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將使被這些載體編碼的核酸序列能以各種組合提供在兩個(gè)或更多個(gè)載體上。AAV幫助者功能載體編碼反式調(diào)控生產(chǎn)的AAV復(fù)制和衣殼化的AAV幫助者功能序列(即r印和cap)。優(yōu)選地，AAV幫助者功能載體支持有效的AAV載體生產(chǎn)而不產(chǎn)生含有功能性r印和基因的任何可檢測(cè)到的AAV病毒粒。這種載體的一個(gè)例子，pHLP19在美國專利NO.6,001，650中得到了詳細(xì)的公開，將其全文引入本文作為參考。如上面解釋的，AAV幫助者功能載體的和ca;基因能衍生自任何己知的AAV血清型。例如，AAV幫助者功能載體可能會(huì)具有衍生自AAV-2的r印基因和衍生自AAV-6的cop基因。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將識(shí)別，其它，和c叩基因的組合是可能的，其明顯的特征是能支持rAAV病毒粒的生產(chǎn)。附屬功能載體編碼AAV的復(fù)制所依賴的非AAV衍生的病毒和/或細(xì)胞的功能的核苷酸序列，本文以附屬功能提及。附屬功能包括那些AAV復(fù)制所需要的功能，包括但不限于那些在AAV基因轉(zhuǎn)錄激活、期特異AAVmRNA拼接、AAVDNA復(fù)制、cop表達(dá)產(chǎn)物的合成和AAV衣殼組裝中涉及到部分。基于病毒的附屬功能能衍生自諸如腺病毒、皰疹病毒(除了單純皰疹病毒類型-l)和牛痘病毒的任何為人們所熟知的幫助者病毒。在優(yōu)先的實(shí)施例中，使用了附屬功能質(zhì)粒pLadeno5。關(guān)于pLadeno5質(zhì)粒的詳情在美國專利NO.6,004,797中進(jìn)行了描述，將其全文引入本文作為參考。該質(zhì)粒為AAV載體生產(chǎn)提供了整套腺病毒附屬功能，但是缺少形成能復(fù)制的腺病毒所需的組件。錢蚱教載沐使用已知的技術(shù)構(gòu)建了重組AAV(rAAV)表達(dá)載體來提供包括控制元件(包括轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域)、編碼目的SOD的多核苷酸和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域在內(nèi)的有效連接的組件。產(chǎn)生的構(gòu)建物含有同功能性AAVITR序列結(jié)合的(5'和3')有效連接的組件。在針對(duì)用于ALS研究的模型系統(tǒng)的實(shí)施方案中，被選擇的控制元件能在哺乳動(dòng)物神經(jīng)元細(xì)胞中起作用。在針對(duì)治療使用的AAV-SOD的實(shí)施方案中，被選擇的控制元件能在目的細(xì)胞或組織中起作用。盡管組織特異的和可調(diào)控的控制元件在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中是令人希望的，但其它實(shí)施方案包括了組成型啟動(dòng)子的使用。AAVITR區(qū)的核苷酸序列是已知的。參見例如，Kotin,R,M.(1994)//w應(yīng)wT7zerapy5:793-801;Berns,K丄"ParvoviridaeancTtheirReplication"inFimcbme齒/Hra/ogy'2ndEdition,(B.N.FieldsandD.M.Knipe,eds.)中關(guān)于AAV-2序列的部分。在本發(fā)明的載體中使用的AAVITRs不需要具有野生型核苷酸序列，并且可能會(huì)被改變，例如，通過核苷酸的插入、刪除或替換。此外，AAVITRs可能會(huì)衍生自幾種AAV血清型中的任何一種，包括但不限于AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7和AAV-8等。AAVITRs也可能會(huì)衍生自，例如，從鼠、羊或牛源分離而來的AAV變種。此外，位于AAV表達(dá)載體中選定的核酸序列兩端的5'和3'ITRs不必是相同的或衍生自相同的AAV血清型或分離物，只要它們以所預(yù)期的方式起作用，即支持目的序列從宿主細(xì)胞基因組或載體中切除和拯救，并且當(dāng)AAVRep基因產(chǎn)物在細(xì)胞中出現(xiàn)時(shí)支持DNA分子整合入受體細(xì)胞基因組。不同的AAV血清型能用來特定地針對(duì)不同細(xì)胞類型。例如，在各種實(shí)施方案中，本發(fā)明的載體衍生自AAV-2、AAV-5禾口AAV-6。例如，在原代鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元培養(yǎng)物中，衍生自AAV-6的載體定向SOD的表達(dá)使其主要在神經(jīng)元中表達(dá)；衍生自AAV-2的載體定向SOD的表達(dá)使其既在祌經(jīng)元中也在神經(jīng)膠質(zhì)中表達(dá)；和衍生自AAV-5的載體定向SOD的表達(dá)使其主要在神經(jīng)膠質(zhì)中表達(dá)。當(dāng)使用AAV-2起源的載體進(jìn)行傳遞時(shí)，hSODl-Gly93Ala引起病理相關(guān)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元形態(tài)改變，但是當(dāng)使用AAV-5起源的載體進(jìn)行傳遞時(shí)并不能引起運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的病理。在本發(fā)明涉及到rAAV-SOD治療性用途的各個(gè)實(shí)施方案中，rAAV載體被用來傳遞SODl、SOD2或SOD3基因，或其組合。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，SODl被傳遞。一般地，本文公開的載體可能會(huì)用于治療或預(yù)防與不良水平的ROS和自由基，或氧化應(yīng)激相關(guān)的疾病或狀態(tài)。ROS也作為某些治療性藥物的有害副作用而產(chǎn)生。參見例如，Chanetal.(1996)A/v.A^ra/71:271-279;DiGuiseppiandFridovich(1984)CV".觸r腦.co/.12:315-342?？赡芡ㄟ^使用本發(fā)明的AAV-SOD載體治療的狀態(tài)包括帕金森綜合癥、亨廷頓舞蹈癥、退化性眼疾病(例如黃斑變性，色素性視網(wǎng)膜炎)、阿爾茨海默氏癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、局限性腸炎、佩羅尼氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、腦缺血癥(中風(fēng))、心肌梗塞(心臟病發(fā)作)、腦和/或脊髓損傷、重灌流損傷、ALS、唐氏綜合癥、白內(nèi)障、精神分裂癥、癲癇癥、人白血病和其他癌癥和糖尿病。甚至是那些僅遭受年齡增長(zhǎng)相關(guān)的正常氧化損傷的人也能從本發(fā)明的載體和方法中獲益。如被大鼠組織中(Erdincler，D.S.，eta1.(1997)C/f".C7n'柳.^"a，265:77-84)和老年病人的血細(xì)胞中(Congi,F.，etal.(1995)戶msw.A/W.,24:1115-1118)脂質(zhì)過氧化物形成的增長(zhǎng)所證明的，由于ROS和自由基的形成而導(dǎo)致的氧化應(yīng)激的累積性上升在老化過程中發(fā)生(參見例如，Mecocci，Retal.(2000)AaA'o.MW，28:1243-1248)。近期的綜述(Niki,E.，/"&r".(2000)39:324-326)報(bào)道，被ROS和自由基增加的組織損傷能歸因于老化過程中發(fā)生的抗氧化酶SOD和CAT水平的降低。例如，通過插入額外的SOD基因到小鼠基因組而產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因鼠被發(fā)現(xiàn)具有降低的ROS和自由基損傷水平。這樣的動(dòng)物也具有延長(zhǎng)的壽命。更近的證據(jù)表明，模擬SOD活性的小卟啉錳化合物的給予導(dǎo)致秀麗隱桿線蟲(Q^"on^Z^'^e/egara)的壽命延長(zhǎng)44%(S.Melow，etal.(2000)Sde"ce，289:1567-1569)。相應(yīng)地，本發(fā)明的載體和方法可能會(huì)預(yù)防和/或抵消老化過程相關(guān)的ROS和自由基的水平升高導(dǎo)致的組織損傷增加和預(yù)期壽命減少。如本文中所用，術(shù)語ALS的"治療"包括預(yù)成損傷的逆轉(zhuǎn)、進(jìn)一步損傷的預(yù)防和延緩損傷的進(jìn)展，它們的每一種都是所期望的結(jié)果。被認(rèn)為治療有效的治療性rAAV-SOD載體或通過使用本發(fā)明的體外ALS模型系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)的化合物不必逆轉(zhuǎn)預(yù)成損傷。任何至少延緩了受治者ALS進(jìn)展的治療均可以被認(rèn)為是治療有效的。,遂教f絲眾^激游JLS謬//#統(tǒng)如在實(shí)施例中更詳細(xì)公開的，本發(fā)明的AAV-SOD載體能用于創(chuàng)建ALS的體外模型系統(tǒng)，該模型系統(tǒng)能被用來篩選有效治療或預(yù)防ALS的化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，ALS相關(guān)的已知的突變SOD1(SODl-Gly93Ala)被克隆入AAV載體并且重組病毒粒(rAAV-SODl-Gly93Ala)被生產(chǎn)。rAAV-SODl-Gly93Ala然后被用于轉(zhuǎn)導(dǎo)從諸如大鼠脊髓或大鼠大腦等代表性組織而來的原代培養(yǎng)物。轉(zhuǎn)染后3-5天用探針檢測(cè)培養(yǎng)物來確定培養(yǎng)物中的某些神經(jīng)元顯示了ALS相關(guān)的諸如SOD聚集物或空泡化形成等形態(tài)改變。這樣的細(xì)胞在本文中稱為"ALS樣細(xì)胞"。這樣的聚集物可能能通過免疫細(xì)胞化學(xué)進(jìn)行觀測(cè)。在優(yōu)先的實(shí)施方案中，培養(yǎng)物中ALS樣細(xì)胞的百分比是高的，例如20、30、40、50、60、70、80、90或95%或更高。在使用該培養(yǎng)物的細(xì)胞時(shí)，培養(yǎng)物中ALS樣細(xì)胞百分比越高能被篩選的化合物的數(shù)目越大，或每一種化合物重復(fù)的數(shù)目更高。通過將ALS樣細(xì)胞暴露于一種或更多種目的化合物中進(jìn)行篩選，然后確定諸如SOD聚集物減少等反映ALS特征改善的ALS樣細(xì)胞的表型是否發(fā)生改變。在某些實(shí)施方案中，化合物被分別加入到諸如在單個(gè)的細(xì)胞瓶、細(xì)胞皿、細(xì)胞板或多孔細(xì)胞板的孔中的ALS樣細(xì)胞的單獨(dú)培養(yǎng)物中。在其它實(shí)施方案中，化合物以幾種化合物的混合物的方式加入。在某些實(shí)施方案中，化合物以化合物組合庫或子庫的形式加入。在某些實(shí)施方案中，化合物混合物中活性化合物的鑒定通過用化合物重疊子庫獲得的數(shù)據(jù)重疊進(jìn)行測(cè)定。在其它實(shí)施方案中，活性化合物的鑒定通過個(gè)別地篩選活性混合物中或小組中的個(gè)別化合物進(jìn)行測(cè)定?；衔锘旌衔镏谢驇熘械幕钚曰衔锏臋z測(cè)方法不是本發(fā)明的關(guān)鍵方面。如在實(shí)施例1中證明的，作為突變SOD基因的SODl-Gly93Ala的使用導(dǎo)致了轉(zhuǎn)染的大鼠脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中SOD聚集物的形成，和大鼠大腦紋狀體神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的空泡化。如當(dāng)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞用潛在治療性試劑或治療方法治療時(shí)這樣的形態(tài)特征的任何逆轉(zhuǎn)均能被觀察一樣，形態(tài)特征能通過免疫細(xì)胞化學(xué)進(jìn)行可視化觀察。在其它實(shí)施方案中，ALS樣表型的觀察被自動(dòng)化，例如，通過能在沒有人干涉情況下檢測(cè)聚集和空泡化的計(jì)算機(jī)輔助圖像分析。這樣的計(jì)算機(jī)輔助圖像分析在大量潛在治療性試劑或療法的篩選中是特別首選的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，不是Gly93Ala的SODl突變體被使用，用這些其它突變SOD1基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的表型可能同SODl-Gly93Ala轉(zhuǎn)導(dǎo)的相關(guān)表型不同。任何突變SOD轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的可檢測(cè)的表型改變均能用于評(píng)價(jià)細(xì)胞是否被轉(zhuǎn)導(dǎo)成ALS樣表型和評(píng)價(jià)潛在治療性試劑或療法在逆轉(zhuǎn)ALS樣表型方面是否有效。能被篩選的化合物包括那些能在ALS樣細(xì)胞培養(yǎng)物中提供的任何化合物。這些化合物包括但不限于天然產(chǎn)物(粗混合物或高度純化的成份)、合成化合物、組合庫和己知具有藥理活性化合物的庫。通過使用合理的藥物設(shè)計(jì)，用于治療ALS的合成化合物能被任意地選擇或特別合成。組合庫能衍生自小分子的組合合成或通過諸如寡核苷酸、寡糖或多肽等聚合分子的組合合成獲得。通過使用本發(fā)明的ALS體外模型系統(tǒng)被篩選的庫可能會(huì)含有包括10、50、100、500、1000、10,000、100,000到l，OOO，OOO或更多化合物的任何數(shù)目的單體化合物。如本文中所用，術(shù)語"高通量篩選"是指在單位時(shí)間內(nèi)(例如每天)篩選比通過使用諸如所述轉(zhuǎn)基因小鼠SODl-Gly93Ala模型并用相同的時(shí)間和努力消耗篩選的化合物更多的化合物。在各種實(shí)施方案中，高通量篩選指每天篩選10、20、50、100、500、1000、2000、5000或更多個(gè)化合物。本發(fā)明的模型系統(tǒng)也能用來篩選那些不涉及試劑加入的逆轉(zhuǎn)或預(yù)防ALS樣表型的治療方法的能力的療法。在本發(fā)明的體外實(shí)驗(yàn)中顯示出功效的化合物能被進(jìn)一步地進(jìn)行研究，例如，在其它體外實(shí)驗(yàn)、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)(例如前面描述的ALS小鼠)或臨床實(shí)驗(yàn)中。這樣的后續(xù)試驗(yàn)與本發(fā)明的體外模型系統(tǒng)相比是相對(duì)更費(fèi)力、耗時(shí)和昂貴的，因此，通過使用這樣的費(fèi)力的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行大量化合物的篩選是不實(shí)際的。通過使用本發(fā)明的體外ALS模型來充分減少候選化合物的數(shù)量來使這樣的費(fèi)力的試驗(yàn)變得可行是可能的。以這種方式，本發(fā)明的體外實(shí)驗(yàn)使篩選比通過使用本領(lǐng)域先前的篩選方法能實(shí)際篩選的化合物更多的化合物變得可能，這樣就增加了發(fā)現(xiàn)能治療或預(yù)防ALS的有效先導(dǎo)化合物的幾率。■辦微系鄉(xiāng)基艦鄉(xiāng)遂本發(fā)明的ALS模型系統(tǒng)不僅能提供有效的高通量篩選方法，它們也能為研究疾病發(fā)病機(jī)理和定義ALS中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的選擇性易損性的基礎(chǔ)提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。例如，原代培養(yǎng)物中的細(xì)胞能用編碼ALS相關(guān)的突變S0D1的AAV病毒粒轉(zhuǎn)導(dǎo)，在轉(zhuǎn)導(dǎo)后4小時(shí)到4天的時(shí)候能從轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中收獲RNA。RNA也能從用編碼wtSODl的AAV病毒粒轉(zhuǎn)導(dǎo)的或未用任何病毒粒轉(zhuǎn)導(dǎo)的對(duì)照細(xì)胞中獲得。RNA樣品然后用于在AffymetrixGeneChipTM上進(jìn)行的基因表達(dá)分析來測(cè)定ALS模型細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞相比，哪種基因過表達(dá)、哪種基因欠表達(dá)。顯示出差異表達(dá)的基因可能代表了干預(yù)治療的有吸引力的途徑?？嵳阊?huì)激游^S沐Af動(dòng)激J鄉(xiāng)微編碼SOD突變形式的重組AAV載體也能用來創(chuàng)建ALS新的動(dòng)物模型。動(dòng)物能被給予編碼突變SOD1基因的rAAV載體(例如rAAV病毒粒)來產(chǎn)生ALS樣表型。顯示出包括模擬ALS癥狀表型在內(nèi)的改變的表型的動(dòng)物然后用于實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)潛在治療性化合物或療法的功效。為了研制成為治療性試劑，產(chǎn)生ALS樣表型逆轉(zhuǎn)的化合物然后能被進(jìn)一步研究。能用于這樣的ALS模型的動(dòng)物包括但不限于小鼠、大鼠和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物。本發(fā)明特定的具體化的實(shí)施例在下面提供。所述實(shí)施例僅供用于說明的目的，并不意味著對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例1嚴(yán)/汰能動(dòng)#敘線欽柳^縣微ALS體外模型系統(tǒng)可按下述方法建立。通過將人S0D1野生型基因(hSODlwt)或突變SODl基因(hSODl-Gly93Ala)克隆入衍生自AAV-2的含有兩個(gè)使得SOD基因表達(dá)被雞P-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子所定向的AAV反向末端重復(fù)序列(ITRs)的載體來創(chuàng)立兩個(gè)AAV載體。產(chǎn)生的rAAV2-SODl-Gly93Ala載體然后被包裝入AAV-2病毒粒(參見例如，美國專利Nos.6,001.650和6,004,797)并用于轉(zhuǎn)導(dǎo)原代大鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元培養(yǎng)物。轉(zhuǎn)導(dǎo)后3-5天的熒光顯微術(shù)揭示，轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞展示了諸如在多數(shù)表達(dá)突變SOD的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中的細(xì)孔狀聚集物中突變SOD蛋白的異常分布、胞體(perikaryal)細(xì)胞質(zhì)的擴(kuò)散和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元進(jìn)程(processes)的膨脹、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的程序性死亡和星形細(xì)胞的激活等ALS的病理改變特征。由于用rAAV2-SODwt載體進(jìn)行的轉(zhuǎn)導(dǎo)在目標(biāo)細(xì)胞中不產(chǎn)生任何ALS相關(guān)的表型改變，將該載體用作本發(fā)明ALS模型的對(duì)照。用編碼pVm-WTSOD或pVm-G93ASOD的AAV2載體分別轉(zhuǎn)導(dǎo)后大約3-5天，來源于大鼠脊髓的原代培養(yǎng)物中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中SOD的存在通過免疫組化進(jìn)行觀察。免疫組化用小鼠抗SOD1IgG第一抗體和Alexa-594標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG第二抗體進(jìn)行。用pVm-G93ASOD轉(zhuǎn)導(dǎo)的神經(jīng)元顯示了聚集的SODl，而在用pVm-WTSOD轉(zhuǎn)導(dǎo)的神經(jīng)元中未觀察到。用編碼pVm-WTSOD或pVm-G93ASOD的AAV2載體分別轉(zhuǎn)導(dǎo)后大約3-5天，來源于大鼠脊髓的原代培養(yǎng)物中的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中SOD的存在通過免疫組化進(jìn)行觀察。用pVm-G93ASOD轉(zhuǎn)導(dǎo)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞顯示了聚集的SODl，而在用pVm-WTSOD轉(zhuǎn)導(dǎo)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中未觀察到。個(gè)別的實(shí)驗(yàn)按照類似那些上面描述的方法進(jìn)行，但是使用的是衍生自AAV-5和AAV-6的AAV載體，即AAV載體的ITRs分別衍生自AAV-5和AAV-6。rAAV-5和rAAV-6病毒粒然后通過分別使用AAV-5或AAV-6衣殼蛋白基因的包裝系統(tǒng)進(jìn)行生產(chǎn)。用編碼pVm-WTSOD或pVm-G93ASOD的AAV-6載體轉(zhuǎn)導(dǎo)后大約3-5天，來源于大鼠脊髓的原代培養(yǎng)物中的神經(jīng)元中SOD的存在通過免疫組化進(jìn)行觀察。用pVm-G93ASOD轉(zhuǎn)導(dǎo)的神經(jīng)元顯示了聚集的SODl，而在用pVm-WTSOD轉(zhuǎn)導(dǎo)的神經(jīng)元中未觀察到。結(jié)果顯示，使用rAAV-6病毒粒傳遞的基因主要在神經(jīng)元中表達(dá)，而用rAAV-2病毒粒傳遞的基因在神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(如前面所討論的)均有表達(dá)。用rAAV-5病毒粒傳遞的基因僅在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，并且rAAV-5病毒粒轉(zhuǎn)導(dǎo)未在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中產(chǎn)生病理。在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元上的rAAV2-SOD轉(zhuǎn)導(dǎo)的表型效應(yīng)在轉(zhuǎn)導(dǎo)后第6-7天和第12天再次進(jìn)行測(cè)量。結(jié)果顯示，長(zhǎng)期的聚集物的發(fā)展導(dǎo)致細(xì)胞在轉(zhuǎn)導(dǎo)12天后死亡。用編碼pVm-G93ASOD的AAV-2載體轉(zhuǎn)導(dǎo)后大約6-7天，來源于大鼠脊髓的原代培養(yǎng)物中的神經(jīng)元中SOD的存在通過免疫組化進(jìn)行觀察。用pVm-G93ASOD轉(zhuǎn)導(dǎo)的神經(jīng)元中的SOD1聚集物比它在轉(zhuǎn)導(dǎo)后3-5天的SOD1聚集物更廣泛，這說明損傷隨時(shí)間而發(fā)展。用編碼pVm-G93ASOD的AAV-2載體轉(zhuǎn)導(dǎo)后大約12天，來源于大鼠脊髓的原代培養(yǎng)物中的神經(jīng)元中SOD的存在通過免疫組化進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示，SODl-Gly93Ala對(duì)細(xì)胞是有毒的，并且它最終殺死了這些細(xì)胞。用rAAV-SODl-G93A轉(zhuǎn)導(dǎo)后6-7天，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)被評(píng)價(jià)并同來源于ALS病人的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)相比較。用編碼pVm-G93ASOD的AAV-2載體轉(zhuǎn)導(dǎo)后大約6-7天，來源于大鼠脊髓的原代培養(yǎng)物中的神經(jīng)元中SOD的存在通過免疫組化進(jìn)行觀察。培養(yǎng)物中用rAAV-SODl-G93A轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞展示了同ALS運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元相同的局部軸突膨脹特征，這表明，本發(fā)明的體外ALS模型系統(tǒng)模擬了疾病的狀態(tài)。用pVm-G93ASOD轉(zhuǎn)導(dǎo)的神經(jīng)元在轉(zhuǎn)導(dǎo)后第6-7天顯示了胞體(perikaryal)細(xì)胞質(zhì)的擴(kuò)散和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元過程(processes)的膨脹，這一點(diǎn)同在來自于ALS病人的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中看到的那些現(xiàn)象相似。同用于轉(zhuǎn)導(dǎo)大鼠脊髓培養(yǎng)物(前述的)相同的病毒粒也用于轉(zhuǎn)導(dǎo)原代大鼠大腦培養(yǎng)物的紋狀體神經(jīng)元。當(dāng)用表達(dá)SOD1-G93A的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)后3-5天，轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)顯示，紋狀體神經(jīng)元顯示出空泡化。當(dāng)來源于大鼠大腦的原代培養(yǎng)物的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞用表達(dá)S0D1-G93A的AAV載體轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)，可以觀察到類似的表型。當(dāng)用pVm-G93ASOD轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)，來源于大腦的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞顯示了空泡化，與此相比較，脊髓神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(前面討論的)用相似處理方法處理后觀測(cè)到的是聚集物形成。在大腦細(xì)胞中觀察到的表型同在轉(zhuǎn)導(dǎo)的脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中觀察到的SOD1聚集物形成不同。實(shí)驗(yàn)證實(shí)表達(dá)S0D1-G93A的細(xì)胞實(shí)際上是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。免疫細(xì)胞化學(xué)在用rAAV-SODlwt或rAAV-SODl-G93A轉(zhuǎn)導(dǎo)大約5-6天后在大鼠脊髓的原代培養(yǎng)物中的細(xì)胞上進(jìn)行。第一個(gè)實(shí)驗(yàn)包括SOD和神經(jīng)元纖維素(NF-L)的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。在用編碼pVm-WTSOD或pVm-G93ASOD的AAV-2載體分別轉(zhuǎn)導(dǎo)大約3-5天后，SOD和神經(jīng)元纖維素(NF-L)在來源于大鼠脊髓的原代培養(yǎng)物中大的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中檢測(cè)到。NF-L是特異的神經(jīng)標(biāo)記。在同樣細(xì)胞中SOD和NF-L的同時(shí)染色證實(shí)，該細(xì)胞是神經(jīng)元。第二個(gè)實(shí)驗(yàn)包括SOD和膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。在用編碼pVm-WTSOD或pVm-G93ASOD的AAV-2載體分別轉(zhuǎn)導(dǎo)大約3-5天后，SOD和膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)在來源于大鼠脊髓的原代培養(yǎng)物中大的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中檢測(cè)到。ChAT是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的特異的標(biāo)記。在相同細(xì)胞中SOD和ChAT的同時(shí)染色證實(shí)，該細(xì)胞是一個(gè)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。這些實(shí)驗(yàn)證實(shí)了在表達(dá)作為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元特征的蛋白的細(xì)胞中的SOD表達(dá)。熒光顯微術(shù)表明，原代大鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元培養(yǎng)物中所有細(xì)胞的大約90%被轉(zhuǎn)導(dǎo)。通過使用rAAV-SODl-Gly93Ala獲得的高效率的轉(zhuǎn)導(dǎo)提供了大量適用于所述實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞，該轉(zhuǎn)導(dǎo)具有相對(duì)少的勞動(dòng)量，通過加入適當(dāng)數(shù)量的病毒顆粒和孵育即可輕易實(shí)現(xiàn)。在本實(shí)施例中，細(xì)胞用每細(xì)胞100,000個(gè)rAAV-SODl-Gly93Ala病毒顆粒進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，即，感染復(fù)數(shù)(MOI)是105。其他實(shí)驗(yàn)(未列出)顯示，低至1000的感染復(fù)數(shù)在提供最大(90%)轉(zhuǎn)導(dǎo)上是等效的。大量轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞使觀察任何給定的目的化合物在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著數(shù)目的不同細(xì)胞中的效果成為可能，從而能得到統(tǒng)計(jì)上穩(wěn)健的結(jié)論。這同先前涉及顯微注射編碼突變SOD的質(zhì)粒到單個(gè)細(xì)胞的方法是不同的，作為一個(gè)實(shí)質(zhì)問題，這種涉及顯微注射的方法不能為高通量篩選提供統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義數(shù)量的細(xì)胞。這個(gè)使用病毒載體同時(shí)轉(zhuǎn)導(dǎo)大量運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和其他細(xì)胞的后生模型可能會(huì)推進(jìn)ALS分子病理的研究、ALS新動(dòng)物模型的產(chǎn)生和ALS藥物的篩選。實(shí)施例1的材料和方法如下。浙p^w-G^述OD頁發(fā)游/鍵人野生型和G93A突變SOD基因用含有整合的HindIII位點(diǎn)的正向弓I物和含有整合的Notl位點(diǎn)的反向引物通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增。5'-AGCTAAGCTTCCACCATGGCGACGAAGGCCGTGTG-3'—mc#146)(SEQIDNO.2)5'-ATATGCGGCCGCTTATTGGGCGATCCCAATIACACCA-3'(HC#147)(SEQIDNO.3)PCR產(chǎn)物用HindIII和Notl限制酶進(jìn)行消化并克隆入質(zhì)粒F101的HindIII和Notl位點(diǎn)，并且基因被置于雞3-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的控制下并位于兩個(gè)AAV'ITRs間來創(chuàng)建質(zhì)粒F101-wtSOD和F101-G93A。wtSOD和G93A連同雞P-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子被用BglII和Notl切離質(zhì)粒F101-wtSOD和F101-G93A并通過使用SphI-BglII和Notl-Ncol接頭克隆入pVm-LacZ的Sphl和Ncol位點(diǎn)。構(gòu)建物通過測(cè)序分析進(jìn)行確證并被命名為pVm-wtSOD(圖2)和pVm-G93ASOD(圖1)。所述質(zhì)粒然后進(jìn)行擴(kuò)增并用于轉(zhuǎn)染293細(xì)胞來產(chǎn)生AAV載體。潔鵬潛養(yǎng)激裂解的脊髓或大腦的原代培養(yǎng)物從第15天的斯普拉格-道利大鼠胚胎制備而來。切開的紋狀體或脊髓組織被切成小片并用胰蛋白酶孵育30分鐘。裂解后，所述組織用巴斯德吸管進(jìn)行研磨，然后細(xì)胞以每孔350,000個(gè)(紋狀體神經(jīng)元)或700,000個(gè)(脊髓神經(jīng)元)的密度鋪在含有用聚-D-賴氨酸(SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO)包被的圓的18mm玻璃蓋玻片(FisherScientific,Chicago,IL)的12孔培養(yǎng)板(FisherScientific,Chicago,IL)上。對(duì)于紋狀體培養(yǎng)物，所用培養(yǎng)基是補(bǔ)充了2%B-27，0.5mML-谷氨酰胺和25mML-谷氨酸的神經(jīng)基質(zhì)培養(yǎng)基(neurobasalmedium)(lnvi加gen,Chicago,IL)。為了維持細(xì)胞，培養(yǎng)物每周加一次營(yíng)養(yǎng)物。對(duì)于脊髓培養(yǎng)物，所用培養(yǎng)基是用2.5gD-葡萄糖豐富并補(bǔ)充2%馬血清、5%胎牛血清、1%青鏈霉素和生長(zhǎng)因子的Eagle最小必需培養(yǎng)基(EMEM)(ATCC，Manassas,Virginia)。為了獲得最佳的細(xì)胞生長(zhǎng)和穩(wěn)定狀態(tài)，培養(yǎng)物每周加入兩次營(yíng)養(yǎng)物。通過在第4-6天時(shí)用1.4ug/ml胞嘧啶-B-D-阿糖胞苷(Calbiochem)處理培養(yǎng)物，非神經(jīng)元細(xì)胞被降到最低。培養(yǎng)物維持在37°C5%C02的環(huán)境中。為了允許運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生長(zhǎng)并從其它神經(jīng)元分化而來，裂解后2-3周，這些細(xì)胞被用于實(shí)驗(yàn)。綠欽頓紋狀體培養(yǎng)物和脊髓培養(yǎng)物用AAV-hSODwt或AAV-hG93A(每個(gè)細(xì)胞105個(gè)載體基因組(vg))孵育來獲得最大的載體表達(dá)。競(jìng)瘦潘應(yīng)眾學(xué)生長(zhǎng)在玻璃蓋玻片上的紋狀體和脊髓細(xì)胞用4%多聚甲醛固定并用0.05%NP-4O進(jìn)行通透化處理。含有IXPBS、3%BSA和2%山羊血清的封閉液被使用。免疫細(xì)胞化學(xué)用下列抗體進(jìn)行神經(jīng)微絲-L(NF-L;AB1983，1:100，ChemiconInc)、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT;AB143和MAB305，1:10，Chemiconlnc)、超氧化物歧化酶(SOD;521:300，SigmaChemicalCo.,St.Louis，MO)、神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP;AB5804,1:500，ChemiconInc)。所有的抗體都稀釋在封閉液中。用二抗(共軛連接AlexaFluor488(綠色)或AlexaFluor594(紅色)并以1:200稀釋的抗小鼠/抗兔/抗大鼠IgG(MolecularProbes))孵育后，通過落射熒光顯微鏡觀察抗體的分布。實(shí)施例2IL-10肽作為候選ALS治療藥物的評(píng)價(jià)本發(fā)明實(shí)施例1的體外ALS模型系統(tǒng)的價(jià)值通過評(píng)價(jià)IL-10衍生肽在ALS上的效果的實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行闡釋。寡肽制造通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的固相合成方法獲得。合成寡肽的分析包括電噴射質(zhì)譜、高效液相色譜和提純產(chǎn)物的視覺表現(xiàn)。用于注射的寡肽以lmg/ml的濃度制備在水中。適當(dāng)?shù)难苌訧L-10的肽的范例(美國專利Na6,159，937)和"亂序"對(duì)照肽在表2中提供。肽的序列以傳統(tǒng)的N—C末端方向提供。氨基酸用三字母命名法命名。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>盡管在表2中提供了范例性的肽序列，本領(lǐng)域的技術(shù)人員很清楚，能對(duì)所列的序列進(jìn)行各種修飾或取代而仍能保持和可能提高該肽在神經(jīng)病痛或神經(jīng)變性疾病治療方面的功效，或提高它的藥理學(xué)性質(zhì)。這樣的序列變種能在下述實(shí)施例中的一個(gè)或多個(gè)模型中進(jìn)行檢驗(yàn)來評(píng)價(jià)它們的治療功效。例如，從非人物種而來的IL-10序列能用來獲得不同于人源IL-10肽的衍生自IL-10的肽序列，衍生自非人源IL-10的肽與衍生自人源的序列相比較可能會(huì)表現(xiàn)出提高的性質(zhì)。可選地，治療性肽的變種能通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的已知經(jīng)驗(yàn)參數(shù)的檢驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)。另外，合理的藥物設(shè)計(jì)能用來設(shè)計(jì)期望表現(xiàn)出增強(qiáng)功效的序列變種，該合理的藥物設(shè)計(jì)能基于IL-10、IL-10受體或IL-10同受體復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)的分析。大鼠脊髓原代培養(yǎng)物用rAAV2-SODl-G93A病毒粒孵育來生產(chǎn)包含表達(dá)S0D1-G93A的一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物。在轉(zhuǎn)導(dǎo)后的各個(gè)時(shí)間，上面描述的IL-10和亂序肽被加入到(重復(fù)三次)含有用rAAV2-SODl-G93A轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的組織培養(yǎng)平板中。轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的對(duì)照平板未用任何肽進(jìn)行處理。作為肽加入后的時(shí)間函數(shù)，進(jìn)行SOD免疫細(xì)胞化學(xué)來測(cè)定IL-10肽、亂序肽或二者是否改善了SOD1-G93A表達(dá)的表型效應(yīng)(即胞內(nèi)SOD聚集物形成或細(xì)胞死亡)。假如在用一種或兩種肽處理的培養(yǎng)物中觀察到聚集物降低或細(xì)胞死亡，在本發(fā)明體外實(shí)驗(yàn)中給出陽性結(jié)果的肽然后被給予更廣泛的研究(即在ALS小鼠中進(jìn)行體內(nèi)研究)。本發(fā)明體外實(shí)驗(yàn)的陽性結(jié)果包括SOD聚集物形成的減少或細(xì)胞死亡減少10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、98%或更多。ALS治療或預(yù)防功效最終通過人類臨床實(shí)驗(yàn)進(jìn)行確認(rèn)。在其他實(shí)驗(yàn)中，上面所示的IL-10的500個(gè)序列變體被合成并實(shí)驗(yàn)其在用rAAV-SODl-G93A轉(zhuǎn)導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中減少ALS樣表型的活性。顯示出最大活性的肽被進(jìn)一步研究其治療或預(yù)防ALS的功效。本發(fā)明使用的代表性的、非限制性的其它IL-10序列的例子包括在下述NCBI登入號(hào)中描述的序列NM000572、U63015、AF418271、AF247603、AF247604、AF247606、AF247605、AY029171、UL16720(所有的人類序列)、NM012854、L02926、X60675(大鼠)；NM010548、AF307012、M37897、M84340(全部的小鼠序列)、U38200(馬)；U39569、AF060520(貓序列)；U00799(牛);U11421、Z29362(羊序列);L26031、L26029(恒河猴序列);AF294758(猴);U33843(犬);AF088887、AF068058(兔序列);AF012909、AF120030(旱獺序列);AF026277(負(fù)鼠);AF097510(荷蘭豬);U11767(鹿);L37781(沙鼠);AB107649(駱馬和駱鴕)。實(shí)施例3GDNF肽作為候選ALS治療藥物的評(píng)價(jià)本發(fā)明實(shí)施例1的體外ALS模型系統(tǒng)的價(jià)值通過評(píng)價(jià)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞起源的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)肽對(duì)ALS的作用效果的實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行進(jìn)一步的闡釋。除了從GDNF起源的肽外，本實(shí)驗(yàn)基本按照實(shí)施例2中描述的方法進(jìn)行，并提供它的不是IL-10肽的亂序版本。假如在實(shí)驗(yàn)中GDNF肽顯示出陽性結(jié)果(即，假如用所述肽處理后發(fā)生了轉(zhuǎn)導(dǎo)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的ALS樣表型特征的降低)，該肽能被進(jìn)一步研究來確認(rèn)它在ALS治療或預(yù)防上的功效。在其他實(shí)驗(yàn)中，500個(gè)不同的GDNF的衍生肽被合成并實(shí)驗(yàn)其在用rAAV-SODl-G93A轉(zhuǎn)導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中減少ALS樣表型的活性。顯示出最大活性的肽被進(jìn)一步研究其治療或預(yù)防ALS的功效。本發(fā)明使用的GDNF肽可能衍生自大量已知的GDNF序列，包括在美國專利NO.6,221,376和6,363,319中披露的序列，將其全文引入本文作為文獻(xiàn)，和Linetal.,5Wewce(1993)260:1130-1132中披露的大鼠和人的序列，以及NCBI登入號(hào)AY052832、AJ001896、AF053748、AF063586和L19063中記錄的人的序列；NCBI登入號(hào)AF184922、AF497634、X92495、NM019139中記錄的大鼠的序列；NCBI登入號(hào)AF516767中記錄的大熊貓的序列；NCBI登入號(hào)XM122804、NM010275、D88351S1、D49921、U36449、U37459、U66195中記錄的小鼠的序列；NCBI登入號(hào)AF469665中記錄的朱鹮的序列；NCBI登入號(hào)AF106678中記錄的恒河猴的序歹lj;和NCBI登入號(hào)NM131732和AF329853中記錄的斑馬魚的序列。GDNF序列也在美國專利申請(qǐng)No.2003/0161814中進(jìn)行了披露。根據(jù)本文披露的內(nèi)容，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能容易地實(shí)施本發(fā)明的這些以及其它實(shí)施方案。盡管本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案己經(jīng)以某些細(xì)節(jié)進(jìn)行了公開，但應(yīng)該明白，在沒有離開本文定義的本發(fā)明的精神和范圍的情況下，變化仍然能被做出。本文引用的所有的出版物、專利和專利申請(qǐng)均將其全文引入本文作為參考。權(quán)利要求1.重組腺相關(guān)病毒(AAV)載體，其包含至少一個(gè)AAV反向末端重復(fù)(ITR)序列和編碼超氧化物歧化酶(SOD)的基因。2、權(quán)利要求1所述的載體，其中的SOD是SODl。3、權(quán)利要求2所述的載體，其中的S0D1包含ALS相關(guān)的突變。4、權(quán)利要求3所述的載體，其中的SODl包含Gly93Ala突變。5、權(quán)利要求l所述的載體，其中的AAV載體是質(zhì)粒。6、權(quán)利要求1所述的載體，其中的AAV載體是AAV病毒粒。7、權(quán)利要求6所述的載體，其中的AAV病毒粒衍生自AAV-2。8、權(quán)利要求6所述的載體，其中的AAV病毒粒衍生自AAV-5。9、權(quán)利要求6所述的載體，其中的AAV病毒粒衍生自AAV-6。10、治療受治者的方法，其包含給予所述受治者編碼SOD的AAV載體。11、權(quán)利要求10所述的方法，其中所述受治者患有選自ALS、帕金森綜合癥、亨廷頓舞蹈癥、阿爾茨海默氏癥、唐氏綜合癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、局限性腸炎、佩羅尼氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、黃斑變性、色素性視網(wǎng)膜炎、白內(nèi)障、腦缺血癥、心肌梗塞、腦損傷、脊髓損傷、重灌流損傷、精神分裂癥、癲癇癥、人白血病或糖尿病的失調(diào)癥。12、篩選有效治療或預(yù)防肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)癥的化合物的方法，其包含用編碼含有ALS相關(guān)突變的SOD1的AAV載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞來產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，其中所述的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞顯示了ALS相關(guān)的表型特征；暴露所述轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞到目的化合物；測(cè)定暴露到目的化合物的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞是否顯示出ALS相關(guān)的表型特征的降低。13、篩選有效治療ALS的化合物的體外模型，其包含用編碼含ALS相關(guān)突變的SOD的AAV載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的多個(gè)細(xì)胞。14、權(quán)利要求12或權(quán)利要求13所述的模型，其中的突變是Gly93Ala。15、權(quán)利要求13所述的模型，其中用AAV載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的多個(gè)細(xì)胞包含培養(yǎng)物細(xì)胞群體中的所有細(xì)胞的至少80%。全文摘要本發(fā)明涉及編碼超氧化物歧化酶(SOD)的腺相關(guān)病毒(AAV)載體，所述編碼SOD的AAV載體(AAV-SOD)可能用于傳遞SOD基因到目標(biāo)細(xì)胞。目標(biāo)細(xì)胞可能位于患有疾病或狀況的個(gè)體中，SOD傳遞到目標(biāo)細(xì)胞在這些個(gè)體上提供了治療的益處和/或治療效果。在另一方面，本發(fā)明涉及篩選有效治療肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)癥的化合物的模型系統(tǒng)。所述模型系統(tǒng)可能包含用編碼SOD基因的AAV載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的多個(gè)細(xì)胞；被轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞可能顯示ALS相關(guān)的表型變化。本發(fā)明的模型系統(tǒng)可能會(huì)用來篩選能有效治療ALS的化合物。文檔編號(hào)A01N63/00GK101237778SQ200680028891公開日2008年8月6日申請(qǐng)日期2006年6月30日優(yōu)先權(quán)日2005年7月7日發(fā)明者M(jìn)·D·道羅德奇申請(qǐng)人:建新公司