專利名稱：：抗核盤菌蕓苔及開發(fā)抗核盤菌的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及抗核盤菌(Sc/era"ma)蕓苔(Bm^'ca)。本發(fā)明也涉及在溫室和田間篩選抗核盤菌的新方法。發(fā)明背景核盤菌可感染100多種植物，包括各種重要的經(jīng)濟農(nóng)作物，例如蕓苔、向日葵、蕓豆、大豆、紫花豌豆、小扁豆、萵苣及馬鈴薯(BolandandHall,1994)。油菜核盤菌(Sc/era,她w/era"'。r謂)可引發(fā)99%以上的菌核病，而小核盤菌(Sc/wo""/am/"or)只引發(fā)少于1%的該種病害。核盤菌可產(chǎn)生帶菌核的、形狀不規(guī)則的、黑色的、可過冬的菌體，它可在土壤中存活4到5年。菌核根據(jù)環(huán)境狀況及農(nóng)作物冠層(canopy)可按子實體或菌絲體方式萌發(fā)。這兩種類型的萌發(fā)可導致兩種截然不同的病害。按子實體萌發(fā)的菌核產(chǎn)生可感染地上組織的子嚢盤和子嚢孢子，從而導致植物的莖枯萎、梗腐、頂部腐爛、莢腐、白霉病及花簇枯萎。按菌絲體萌發(fā)的菌核可產(chǎn)生感染根組織的菌絲體，從而導致根冠腐爛、根腐及基部莖桿腐爛。核盤菌可在包括卡諾拉(canola)在內(nèi)的蕓苔中引發(fā)核盤菌莖腐，也稱之為白霉病?？ㄖZ拉是一種在種子中含有低水平芥子油普與芥酸的蕓苔。在夏季菌核按子實體方式萌發(fā)，產(chǎn)生子嚢盤。子嚢盤可釋放能傳播1千米以上的靠風傳送的子嚢孢子。在卡諾拉開花前或開花期，潮濕的土壤條件(在或接近最高有效水量的情況下至少IO天)和15-25。C的溫度可促進病害。孢子不能直接感染葉片和莖，他們必須首先落在莖和葉片上的花上、脫落的花瓣上以及花粉上?；g影響感染效率，越老的花瓣越容易被感染(HemnWa/.,1999)。真菌孢子在萌發(fā)并感染植物時，利用花部分作為食物來源。在蕓苔中核盤菌的嚴重度是不同的，依賴于感染時間及氣候條件(HeranWa/.,1999)。涼爽的溫度和延長的降水期可促進病害。最適植物感染所需的溫度在20和25。C之間、相對濕度大于80%(Heranwa/.,1999)。已報道在不同田間的損失為5到100%(ManitobaAgriculture,濕的割刈地帶造成嚴重的損失。在1999年、2000年和2001年，核盤菌在明尼蘇達州和北達科他州給卡諾拉栽培者分別造成了1730、2080和1680萬美元的經(jīng)濟損失(Bradley"a/.2006)。核盤菌感染的癥狀通常在開花后的幾周內(nèi)逐步顯示出來。植物在位于或高于土壤線以及上部的枝或莢上展現(xiàn)出淺灰色到白色的枯斑。感染通常發(fā)生在葉片和莖的連接處，是因為被感染的花瓣在那里倒伏。一旦植物被感染，則霉菌繼續(xù)向莖中生長并侵入健康組織。被感染的莖表現(xiàn)為褪色并易于破裂。深黑色的真菌菌核在感染的莖、枝或莢中發(fā)育。在花期被感染的植抹產(chǎn)生很少或不產(chǎn)生種子。環(huán)剝了莖的植抹會枯萎并過早成熟。嚴重感染的農(nóng)作物通常在收割處倒伏、破碎，使得收割更為耗時。感染可發(fā)生在植物所有的地上部分，在密集或堆積地帶尤為如此，在那里植抹與植抹的接觸幫助了感染的蔓延。新菌核可將病害帶到下個季節(jié)?？刂凭瞬〉膫鹘y(tǒng)方法包括(a)化學控制、(b)病害抗性及(c)培養(yǎng)控制，下面對它們進行——介紹。(a)諸如苯菌靈、烯菌酮及咪唑霉這樣的殺真菌劑仍是控制菌核病的主要方法(Morally"/.,1985;Tu,1983)。近來，也開發(fā)了其它的殺真菌劑配方用于抵抗核盤菌，包括嘧菌酯、丙硫菌唑和。定酰菌胺(Boscalid)(Johnson2005)。但是，使用殺真菌劑比較昂貴，而且對于使用者及環(huán)境有害。另外，由于重復使用已對某些殺真菌劑產(chǎn)生了抗性。(b)在豆、紅花、向日葵和大豆某些栽培種中，可進行一些改進以產(chǎn)生部分(不完全的)抗性。部分抗性通常是指耐受性。不過，成功開發(fā)部分抗性是非常有限的，可能是因為部分生理抗性如在豆中所揭示的那樣是一個多基因性狀(Fuller"a/.,1984)。除了部分生理抗性外，也可對譬如直立生長習性、抗倒伏性以及狹窄的冠層這樣的形態(tài)性狀進行某些改進，以避免核盤菌感染。例如，具有部分生理抗性并具有直立姿態(tài)、狹窄冠層及不確定的生長習性的豆類植物最能避免核盤菌(Saindon"a/.,1993)。紅花的早期成熟培養(yǎng)品種對核盤菌具有很好的田間抗性。最后，在大豆中，諸如高度、早期成熟及優(yōu)異的抗倒伏性這樣的培養(yǎng)性狀可減少病害，這主要是因為降低了對病害有利的微氣候環(huán)境(BolandandHall1987;BuzzellWa/.1993)。(c)諸如使用不含病原體或者用殺真菌劑處理過的種子、增加行間距、降低播種率以減少病害的次級傳播、以及掩埋菌核以防止子實體萌發(fā)這樣的培養(yǎng)實踐，可減少菌核病，但不能有效地控制該病害。所有的加拿大卡諾拉基因型對核盤菌莖腐都是敏感的(ManitobaAgriculture,FoodandRuralInitiatives,2004)。包4舌所有已^口的春天開花的卡諾拉品種的基因型。澳大利亞卡諾拉變種對核盤菌也沒有抗性(Hind-Lanoiselet"a/.2004)。某些具有特定形態(tài)性狀的變種可以更好地4氐抗核盤菌感染。例如，波蘭變種(Sra^zcofra/a)具有更高的冠層，表現(xiàn)出更低的感染水平。另外，花瓣較少的變種(無花瓣變種)也可在更大程度上避免核盤菌感染(Okuyamae,a/.,1995;Fu，1990)。蕓莒基因型中其它的可在一定程度上降低田間敏感性的形態(tài)性狀包括增加的直立性、減少的花瓣維持、分枝(更疏松和/或更高)以及早期葉脫落。Jurke和Fernando(2003)篩選了11個卡諾拉基因型來研究菌核病發(fā)病率。通過植物形態(tài)來解釋病害發(fā)病率之間的顯著性差異，鑒定出花瓣維持上的差異是最為重要的因素。不過，單單是這些形態(tài)性狀不會賦予對核盤菌的抗性，在加拿大所有的卡諾拉產(chǎn)品均對核盤菌敏感。越冬的卡諾拉的基因型也對核盤菌敏感。例如，在德國，沒有抗核盤菌的變種(Specht,2005)。廣布的德國變種Express被認為是敏感至中等敏感的，并且屬于敏感程度更低的變種/雜合子一類(參見表4)。對處于花期并生長在利于病害的條件下的卡諾拉農(nóng)作物，噴灑殺真菌劑是唯一的控制核盤菌的手段。典型的用于控制蕓苔上的核盤菌的殺真菌劑包括產(chǎn)自Bayer的RovralTM和產(chǎn)自BASF的RonilanTM/LanceTM。LanceTM中的活性成分是啶酰菌胺，它在美國以EnduraTM銷售。應該在出現(xiàn)莖腐癥狀之前，通常是在農(nóng)作物20-30%的開花期時使用殺真菌劑。如果感染已經(jīng)很明顯了，那么使用殺真菌劑也沒有作用，因為已經(jīng)太晚了不會有效果的。因此，栽培者必須估計其田間病害的危險性以決定是否使用殺真菌劑。這可通過使用政府提供的清單或者通過使用花瓣檢測試劑盒來完成。其中每種方法都是很繁瑣的，而且容易出錯(Hind-La腿selet2004;Joh訓n2005)。已進行了很多工作來開發(fā)抗核盤菌的蕓苔植物。內(nèi)在固有的抗性比通過使用殺真菌劑來控制核盤菌更為方便、更為經(jīng)濟、對環(huán)境更有利。由于性狀是多基因遺傳的，所以它比較穩(wěn)定，不像殺真菌劑那樣容易喪失有效性。春季生長的卡i若才立(SnxM7'cawa/mssubsp.oleiferavar.annua)不同于越冬的卡i若4立(Bnxsvs7'cawa/7wssubsp.oleiferavar.biennis),主要是5史有了必需的春化作用。亞洲油菜籽(Rapeseed)和卡諾拉品種對春化作用具有低度到中度需求，因此被視為半越冬類型。在春季種植越冬卡諾拉時，它無法完成繁殖周期，而早春種植并暴露在低溫中可使亞洲品種開花并結(jié)籽。若在晚春種植，則亞洲品種無法完成其繁殖周期。在可控條件下，越冬品種需要12-14周的春化作用，而亞洲品種需要2-8周。表1總結(jié)了在越冬、半越冬(亞洲)和春季卡諾拉變種之間的差異。表1.在歐洲油菜(Bm^ca)品種中生長習性的主要測定<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>*加拿大、歐洲和澳大利亞的春季品種可在任何適于春季卡諾拉的環(huán)境或播種時間種植并生長。某些中國(半越冬)油菜籽/卡諾拉栽培種對核盤菌具有部分抗性。侈寸^口，ChimYun"a/.,2003;HanZhong"a/.,2004;XeiXinW"/.,2002;YongJu""/.,2000;ChaoCai"a/.,1998描述了具有部分抗性的油菜籽變種。但這些變種中有一些不是卡諾拉品系，而且它們均需要春化作用。中國變種中的部分田間抗性主要來自油菜籽變種Zhongyou821。盡管改進了Zhongyou821中的部分抗性，但它對病害的反應在利于核盤菌發(fā)展的環(huán)境條件下是不穩(wěn)定的(Yunchang等人，1999)。這顯示的是更低水平的部分抑制(LiWa/.,1999)。某些日本油菜籽栽培種對核盤菌具有部分莖抗性?？赏ㄟ^室內(nèi)試驗與越冬卡諾拉相比較來檢測部分莖抗性(Brun1987)。不過，這些變種不是卡諾拉品系，而且是半越冬類型(參見表l)。在卡諾拉中繁育出核盤菌田間抗性是非常困難的，這歸因于該性狀的數(shù)量特性。此外，生理抗性與避免或降低感染的形態(tài)性狀的結(jié)合倍增了繁育出抗性的復雜性。另外，由于環(huán)境與植物居群的直接相互作用(也就是溫度和濕度需求，以及微環(huán)境需求)，所以^艮難篩選出抗性。如上所述，盡管通過多年的共進化及環(huán)境壓力來選擇該性狀，仍未獲得抗核盤菌的加拿大春季蕓苔變種。在油菜籽(及近來某些卡諾拉品種)中可實現(xiàn)的最高田間抗性水平是通過在中國使用所述的Zhongyou821的繁育工作所獲得的(Yunchang""/.,1999)。這種部分抗性或耐受性的水平相對較低，因為在中國仍推薦在所有的油菜籽和卡諾拉品種中使用殺真菌劑(口頭交流)(Baochengeta11999)。顯然，在自然界沒有發(fā)現(xiàn)對核盤菌具有高水平抗性的蕓莒及卡諾拉變種?？ㄖZ拉品系歐洲油菜是在1970年代開發(fā)的。盡管有30年的廣泛的繁育工作，但之前并沒有開發(fā)出對核盤菌具有抗性的卡諾拉變種。舉例來說，繁育工作包括定量性狀基因座分析(Zhao-JianweiWa/.,2003)、i秀變繁育(Mullinsa/.,1999;Wu畫YanyouWa/.,1996;LiangHongefa/"2003)、廣泛的篩選工作(Sedunee/a/.,1989;Zhao""/.,2004)、及篩選表達序列標簽(ESTs)(Rugang^a/.,2004)。已開發(fā)出幾種對核盤菌具有中度耐受性春季卡諾拉變種(AhmadiWa/.,2000a;AhmadiWa/.,2000b;BaoMing"a/.,1999;andLiu"a/.,1991),不過耐受性水平較低,并且該品系無法抵抗較高的病害壓力。近來已開發(fā)出攜帶草酸氧化酶基因的轉(zhuǎn)基因卡諾拉(US6,166,291及其分案專利)；但對轉(zhuǎn)基因植物仍存在管理上和社會上的爭論。如同需要使用殺真菌劑那樣，也需要抗核盤菌的越冬卡諾拉基因型(Johnson2005)。因此，需要有重要的技術性人工干預來繁育抗核盤菌的卡諾拉變異體。發(fā)明概述本發(fā)明的一個方面提供了對油菜核盤菌具有更高抗性的蕓苔植物或植物類群。在一方面，本發(fā)明提供了春季歐洲油菜植物或植物類群，該植物或植物類群代表了在田間相同環(huán)境與病害狀態(tài)下，其平均菌核病發(fā)病率(SSDI%)得分比PioneerHi-Bred變種46A76、或PioneerHi-Bred變種46A65的SSDI。/。得分、或者這兩個變種平均SSDP/。得分低約60%的種群。歐洲油菜植物或植物類群也代表了其平均菌核病發(fā)病率(SSDI%)得分比PioneerHi-Bred變種46A76、或PioneerHi-Bred變種46A65的得分、或者這兩個變種平均得分低約50%、35%或者20%的種群。本發(fā)明的另一個方面提供了越冬歐洲油菜植物或植物類群，該植物或植物類群代表了在田間相同環(huán)境與病害狀態(tài)下，其平均菌核病發(fā)病率(SSDI%)得分比Columbus.變種、或Express變種的SSDP/q得分、或者這兩個變種平均SSDr/。得分低約60%的種群。越冬歐洲油菜植物或植物類群也代表了其平均菌核病發(fā)病率(SSDI%)得分比Columbus變種、或Express變種的得分、或者這兩個變種平均得分低約50%、35%或者20%的種群。本發(fā)明的另一個方面提供了春季歐洲油菜植物或植物類群，代表其種群的植物或者植物類群至少具有以下特征(a)種群中種子的固體成分所包含的芥子油苷水平低于30微摩爾每克非油類固體(oilfreesolid),(b)植物中種子的油類含有低于2%的芥酸，(c)50%的開花時間在30天到90天之間，以及(d)在田間相同環(huán)境與病害狀態(tài)下，SSDI。/q得分比PioneerHi-Bred變種46A76、或PioneerHi-Bred變種46A65的SSDP/。得分、或者這兩個變種平均SSDI%得分低約60%。歐洲油菜植物也可代表其中平均菌核病發(fā)病率(SSDI%)得分比PioneerHi-Bred變種46A76、或PioneerHi-Bred變種46A65的得分、或者這兩個變種平均得分低約50%、35%或者20%的種群。本發(fā)明的另一個方面提供了越冬歐洲油菜植物或植物類群，代表其種群的植物或者植物類群至少具有以下特征(a)種群中種子的固體成分所包含的芥子油苷水平低于30微摩爾每克非油類固體，(b)植物中種子的油類含有低于2%的芥酸，(c)50%的開花時間在30天到90天之間，以及(d)在田間相同環(huán)境與病害狀態(tài)下，SSDIq/。得分比Columbus變種、或Express變種的SSDI。/。得分、或者這兩個變種平均SSDr/。得分低約60%。越冬歐洲油菜植物也可代表其中平均菌核病發(fā)病率(SSDI%)得分比Columbus變種、或Express變種的得分、或者這兩個變種平均得分低約50%、35%或者20%的種群。歐洲油菜#:物可以描述為以下春季歐洲油菜系(a)03SN40341的S3混合增力口(bulkincrease),以ATCC保藏號PTA-6776保藏；或者來源于03SN40341的加倍單倍體系，以ATCC保藏號PTA-6780保藏。(b)03SN40441的S3混合增加，以ATCC保藏號PTA-6779保藏；或者來源于03SN40441的加倍單倍體系，以ATCC保藏號PTA-6778保藏。(c)02SN41269的F4混合增加，以ATCC保藏號PTA-6777保藏；或者來源于02SN41269的加倍單倍體系，以ATCC保藏號PTA-6781保藏。(d)命名為04SN41433的S2混合，以NCIMB保藏號41389保藏，或者來源于04SN41433的加倍單倍體系，以NCIMB保藏號41391保藏。(e)命名為04SN41415的S2混合，以NCIMB保藏號41388保藏，或者來源于04SN41415的加倍單倍體系，以NCIMB保藏號41390保藏。(也參見表11a.)歐洲油菜植物可以描述為以下越冬歐洲油菜系(a)04CWB930128系的F4混合增加，以NCIMB保藏號41396保(b)藏。(c)藏。(d)藏。(e)藏。(f)藏。(g)藏。04CWB930127系的F4混合增加:04CWB930081系的F4混合增加:04CWB930111系的F4混合增力口:04CWB930144系的F4混合增加:04CWB930015系的F4混合增加:04CWB930135系的F4混合增加:以NCIMB保藏號41395保以NCIMB保藏號41393保以NCIMB保藏號41394保以NCIMB保藏號41398保以NCIMB保藏號41392保以NCIMB保藏號41397保(也參見表lib.)本發(fā)明的另一個方面提供了任何上述方面中的蕓苔植物的后代植抹，其中后代植抹至少具有以下特征(a)種群中種子的固體成分所包含的芥子油苷水平低于30微摩爾每克非油類固體，(b)植物中種子的油類含有低于2%的芥酸，(c)50%的開花時間在30天到90天之間，以及(d)代表在田間相同環(huán)境與病害狀態(tài)下，SSDP/。得分比(1)其后代植物具有春季生長習性的PioneerHi-Bred變種46A76、或PioneerHi-Bred變種46A65的SSDr/。得分、或者這兩個變種平均SSDr/。得分，或者(2)其后代植物具有越冬生長習性的Columbus變種、或Express變種的ssDr/。得分、或者這兩個變種平均ssDiy。得分低約60%的種群。后代歐洲油菜植物也代表了在田間相同環(huán)境與病害狀態(tài)下，菌核病發(fā)病率平均水平比(l)其后代植物具有春季生長習性的PioneerHi-Bred變種46A76或PioneerHi-Bred變種46A65或者這兩個變種平均得分，或者(2)其后代植物具有越冬生長習性的Columbus變種Express變種或者這兩個變種平均SSDr/。得分低50y。、35%或20%的種群。本發(fā)明的另一個方面提供了歐洲油菜植物或植物類群、該植物或植物類群具有生理性狀或者具有可同時發(fā)揮功能的形態(tài)及生理性狀的組合，以降低病害發(fā)展，其中植物或植物類群所代表的種群，在田間相同環(huán)境與病害狀態(tài)下，其SSDI。/。得分比(1)種群具有春季生長習性的PioneerHi-Bred變種46A76、或PioneerH卜Bred變種46A65、或者這兩個變種平均得分，或者(2)種群具有越冬生長習性的Columbus變種、或Express變種、或者這兩個變種平均SSDI%得分低約60%。本發(fā)明的另一個方面提供了任何上述歐洲油菜植物的后代、所述后代通過加倍單倍體選取核盤菌抗性性狀產(chǎn)生，其中含有所述后代的同源種群的SSDr/。得分在田間相同環(huán)境與病害狀態(tài)下，比(1)種群具有春季生長習性的PioneerHi-Bred變種46A76、或PioneerHi-Bred變種46A65、或者這兩個變種平均得分，或者(2)種群具有越冬生長習性的Columbus變種、或Express變種、或者這兩個變種平均SSDI。/。得分低約60%此外，本發(fā)明還提供了由任何上述歐洲油菜植抹所產(chǎn)生的加倍單倍體系、來自任何植抹的種子、來自任何植林的碾碎的歐洲油菜種子、來自任何植抹的植物細胞、以及來自任何植抹的植物細胞物質(zhì)，例如花粉或胚珠物質(zhì)。本發(fā)明的另一個方面提供了一種在可控的環(huán)境條件下篩選對核盤菌具有抗性的植物的方法，包括(a)用含有核盤菌菌絲體的低營養(yǎng)PDA塞狀物接種處于可控環(huán)境條件下生長的植物，及(b)篩選對核盤菌具有抗性的植物。塞狀物可以通過昆蟲針附著在植物上。塞狀物約3mm?？煽氐沫h(huán)境條件包括可控的濕度。本發(fā)明的另一個方面提供了篩選在田間生長的對核盤菌具有抗性的植物的方法，包括(a)用核盤菌接種植物，(b)用水灌溉植物，其中水含有很低的或者不含可與草酸結(jié)合的離子；(c)使植物保持預定閾值的持續(xù)的濕度，及(d)篩選對核盤菌具有抗性的植物?？墒褂幂d體材料實現(xiàn)接菌。載體可以是諸如定植了核盤菌的Niger種子這樣的種子，可以以約5-20kg/ha的速率進行散播。水可以是去離子水、蒸餾水、徑流水或收集的雨水。該方法進一步可包括用網(wǎng)狀圍欄(enclosure)來提供一個可控的微環(huán)境。本發(fā)明的另一個方面提供了一種在田間相同環(huán)境與病害狀態(tài)下，產(chǎn)生SSDI。/o得分比PioneerHi-Bred變種46A76、或PioneerHi-Bred變種46A65的SSDr/。得分、或者這兩個變種平均SSDI%得分低約60%的歐洲油菜系03SN40341的連續(xù)后代的方法，包括(a)將歐洲油菜系03SN40341與其自身或者另一種蕓苔植物雜交，產(chǎn)生來源于蕓苔系03SN40341的后代蕓苔種子，(b)培養(yǎng)步驟(a)中的歐洲油菜種子，以產(chǎn)生另外的來源于蕓莒系03SN40341的蕓苔植林，(c)選擇性地對連續(xù)后代重復步驟(a)和(b)中的雜交及培養(yǎng)過程，以產(chǎn)生其它來源于歐洲油菜系03SN40341的植株，及(d)篩選后代植林，其中所述植株代表在田間相同環(huán)境與病害狀態(tài)下，其SSDr/o得分比PioneerHi-Bred變種46A76、或PioneerHi-Bred變種46A65的SSDI%得分、或者這兩個變種平均SSDI%得分4氐約60%的植物種群。本發(fā)明對系03SN40441、02SN41269、04DHS12921、04DHS11319、04DHS11418、04SN41433、04SN41415、05DHS12897和04DHS12879也提供了類似的方法。在田間相同環(huán)境與病害狀態(tài)下，后代植抹所代表的種群其SSDI。/。得分比PioneerHi-Bred變種46A76、或PioneerHi-Bred變種46A65的SSDr/。得分、或者這兩個變種平均SSDr/。得分低約50。/c)、35%或20%。本發(fā)明的另一個方面提供了一種在田間相同環(huán)境與病害狀態(tài)下，產(chǎn)生SSDI。/。得分比Columbus變種、或Express變種的SSDI%得分、或者這兩個變種平均SSDI%得分#^約60%的歐洲油菜系04CWB930127的連續(xù)后代的方法，包括(a)將歐洲油菜系04CWB930127與其自身或者另一種蕓苔植物雜交，產(chǎn)生來源于蕓苔系04CWB930127的后代蕓苔種子，(b)培養(yǎng)步驟(a)中的歐洲油菜種子，以產(chǎn)生另外的來源于蕓莒系04CWB930127的蕓苔植抹，(c)選擇性地對連續(xù)后代重復步驟(a)和(b)中的雜交及培養(yǎng)過程，以產(chǎn)生其它來源于歐洲油菜系04CWB930127的植抹，及(d)篩選后代植抹，其中所述植抹代表在田間相同環(huán)境與病害狀態(tài)下，其SSDr/Q得分比Columbus變種、或Express變種的SSDI%得分、或者這兩個變種平均SSDP/。得分低約60。/。的植物種群。本發(fā)明對系04CWB930128、04CWB930081、04CWB930111、04CWB930144、04CWB930135和04CWB930015也提供了類似的方法。在田間相同環(huán)境與病害狀態(tài)下，后代植抹所代表的種群其SSDr/。得分比Columbus變種、或Express變種的SSDr/o得分、或者這兩個變種平均SSDI%得分低約50%、35%或20%。本發(fā)明的另一個方面提供了春季歐洲油菜植物在培養(yǎng)農(nóng)作物、油類及膳食生產(chǎn)、或者培育新的蕓苔系方面的用途，在田間相同環(huán)境與病害狀態(tài)下，該植物所代表的種群其SSDI。/o得分比PioneerHi-Bred變種46A76、或PioneerHi-Bred變種46A65的SSDr/。得分、或者這兩個變種平均SSDr/。得分低約60%。植物可命名為03SN40341、03SN40441、02SN41269、04DHS12921、04DHS11319或04DHS11418,代表性的種子分別以ATCC保藏號PTA-6776、PTA-6779、PTA-6777、PTA-6781、PTA-6780或PTA-6778保藏，所述種子約于2005年6月8日保藏；或者命名為04SN41433、04SN41415、05DHS12897或04DHS12879,代表性的種子分別以NCIMB保藏號41389、41388、41391或41390保藏。本發(fā)明的另一個方面提供了越冬歐洲油菜植物在培養(yǎng)農(nóng)作物、油類及膳食生產(chǎn)、或者培育新的蕓苔系方面的用途，該植物所代表的種群在田間相同環(huán)境與病害狀態(tài)下，其SSDP/u得分低于Columbus變種、或Express變種的SSDP/。得分、或者這兩個變種平均SSDP/o得分約60%。植物可命名為04CWB930127、04CWB930128、04CWB930081、04CWB930111、04CWB930144、04CWB930135或04CWB930015,代表性的種子分別以NCIMB保藏號41395、41396、41393、41394、41398、41397或41392保藏。本發(fā)明的另一個方面是提供了生產(chǎn)卡諾拉油的方法，包括(a)碾-爭由命名為03SN40341、03SN40441、02SN41269、04DHS12921、04DHS11319或04DHS11418的歐洲油菜植物所產(chǎn)生的種子，代表性的種子分別以ATCC保藏號PTA-6776、PTA-6779、PTA-6777、PTA-6781、PTA-6780、或PTA-6778保藏，所述的種子約在2005年6月8日保藏；或者命名為04SN41433、04SN41415、05DHS12897或04DHS12879,代表性的種子分別以NCIMB保藏號41389、41388、41391或41390保藏；或者任何上述植物的后代，其中植物或后代植物所代表的種群在田間相同環(huán)境與病害狀態(tài)下，其SSDr/。得分比PioneerHi-Bred變種46A76、或PioneerHi-Bred變種46A65的SSDI。/。得分、或者這兩個變種平均SSDI%得分低約60%,(b)從上述碾碎的種子中提取原油，并且可選擇地(c)對所述原油進行精煉、脫色及除臭，以產(chǎn)生卡諾拉油(canolaoil)。本發(fā)明的另一個方面提供了生產(chǎn)卡諾拉油的方法，包括(a)碾碎由命名為04CWB930127、04CWB930128、04CWB930081、04CWB930111、04CWB930144、04CWB930135或04CWB930015的歐洲油菜植物所產(chǎn)生的種子，代表性的種子分別以NCIMB保藏號41395、41396、41393、41394、41398、41397或41392保藏,或者任何上述植物的后代，其中植物或后代植物所代表的種群在田間相同環(huán)境與病害狀態(tài)下，其SSDIW得分比Columbus變種、或Express變種的SSDr/o得分、或者這兩個變種平均SSDP/。得分低約60%,(b)從上述碾碎的種子中提取原油，并且可選擇地(c)對所述原油進行精煉、脫色及除臭，以產(chǎn)生卡諾拉油。本發(fā)明的另一個方面提供了上述的歐洲油菜植物，進一步地在田間相同環(huán)境與病害狀態(tài)下，具有高于PioneerHi-Bred變種的46A76的黑胚病(丄eptoy/7/we〃'amacw/ara)^t性7^平。才直物命名為03SN40341、03SN40441、2SN41269、04DHS12921、04DHS11319或04DHS11418，代表性的種子分別以ATCC保藏號PTA-6776、PTA-6779、PTA-6777、PTA-6781、PTA-6780或PTA-6778保藏，所述的種子約在2005年6月8日保藏；或者命名為04SN41433、04SN41415、05DHS12897或04DHS12879,代表性的種子分別以NCIMB保藏號41389、41388、41391或41390保藏；或者任何上述植物的后代，其中植物或后代植物所代表的種群在田間相同環(huán)境與病害狀態(tài)下，其SSDI。/。得分比PioneerHi-Bred變種46A76、或PioneerHi-Bred變種46A65的SSDI%得分、或者這兩個變種平均SSDI。/。得分低約60%,并且進一步地，在田間相同環(huán)境與病害狀態(tài)下，其平均黑脛病抗性水平要高于PioneerHi-Bred變種46A76。還提供了來自該植物的植物細胞。附圖的筒要描述圖1是在極端病害壓力田間研究條件下從2000-2005年期間種群T的5到IO周期的柱狀圖。Y軸所示的是后代頻率。X軸所示的是如表4所述的1-9個SSDI核盤菌等級。圖2所示的是特定的具有核盤菌抗性的春季卡諾拉系的農(nóng)藝學與核盤菌數(shù)據(jù)。核盤菌數(shù)據(jù)以46A76、46A65及其平均值的百分比來表示。A部分包括在極端病害壓力田間研究條件下的農(nóng)藝學數(shù)據(jù)和核盤菌數(shù)據(jù)。B部分包括自然田間數(shù)據(jù)。C部分所示的是A部分與B部分的聯(lián)合結(jié)果。D部分是省略了一個自然田間試驗(NDSU)數(shù)據(jù)的B部分。E所示的是A部分與D部分的聯(lián)合結(jié)果。發(fā)明的詳細描述I.概述本發(fā)明描述了第一個具有春季或越冬習性、并對核盤菌具有高水平田間抗性的低芥酸及低芥子油普的卡諾拉系。田間抗性基于針對核盤菌的傳統(tǒng)部分生理抗性以及形態(tài)性狀的積累，它們可同時發(fā)揮作用以降低病害發(fā)展。本發(fā)明具有幾個方面。第一個方面是開發(fā)了抗核盤菌的卡諾拉系。本發(fā)明的該方面在實施例1、2、3、4、8和9中有所描述。這是關于在田間相同環(huán)境與病害狀態(tài)下，通過SSDI乂得分來測定的平均核盤菌發(fā)病率水平比PioneerH卜Bred變種46A76、或PioneerHi-Bred變種46A65的發(fā)病率水平、或這兩個變種平均得分低約60%的春季卡諾拉系；或者在田間相同環(huán)境與病害狀態(tài)下，通過SSDI。/。得分來測定的平均核盤菌發(fā)病率水平比Columbus變種、或Express變種的發(fā)病率水平、或這兩個變種平均得分低約60%的越冬卡諾拉系的首次報道。在過去6年的(2000-2005)源于15年來的研究(1991到2005)的育種與篩選工作中，對遺傳操縱的直接人類技術干預以及逐步增加的多個生理及形態(tài)性狀產(chǎn)生了對核盤菌具有抗性的春季卡諾拉系。已經(jīng)在本文其它地方，包括表lla和llb,詳細描述了代表著改良系的種子保藏。本發(fā)明的第二個方面是開發(fā)了同時具有核盤菌抗性及黑脛病抗性的卡諾拉系。在實施例1、2、3和4中所描述的育種及篩選工作，不僅產(chǎn)生了具有核盤菌抗性的品系，也產(chǎn)生了具有黑脛病抗性的品系。在過去6年的源于15年來的研究的育種與篩選中，多個生理及形態(tài)性狀的逐步增加，產(chǎn)生了具有核盤菌抗性并且也具有黑脛病抗性的品系。在實施例5中描述了本發(fā)明的該部分。本發(fā)明的第三個方面是開發(fā)了在溫室或小溫室中以及在田間篩選核盤菌抗性的方法學。這些方法學的發(fā)展，在開發(fā)如實施例1、2、3、4和5中所述的本發(fā)明的核盤菌抗性系及黑脛病抗性系方面是一個重要的成功因素。該方面在實施例6和7中有所描述。II.卡諾拉育種技術卡諾拉育種程序使用了諸如混合與輪回選擇、回交、譜系繁育及加倍單倍體發(fā)育這樣的技術。對于油菜籽與卡諾拉的一般性描述，可參見R.K.DowneyandG.F.W.Rakow,1987:RapeseedandMustard(In:Fehr,W.R.(ed.),Principlesof栽培種Development,437-486.NewYork:MacmillanandCo.);Thompson,K.F.,1983:Breedingwinteroilseedrape區(qū)欠濟1〉、由《.AdvancesinAppliedBiology7:1-104;andOilseedHape,Ward,Wa/.,FarmingPressLtd.,WharefedaleRoad,Ipswich,Suffolk(1985),其中每一個均以參考的方式整合在本文中。兩個不同純合子系之間的雜交會產(chǎn)生一致的雜種植物種群(也稱為Fl雜種植物)，它在很多基因座上是雜合的。兩個在很多基因座上有差異的雜合子植物雜交，會產(chǎn)生遺傳上不同并且不一致的植物種群。不管是什么譜系，自花授粉并且篩選多代的植物都會在幾乎所有基因座上變成純合的，產(chǎn)生真正的純系后代一致的種群。本文所用術語"近親繁殖的"是指純合植物或者純合植物集合。普通技術人員知道在近親繁殖個體中可存在某些殘留的雜合現(xiàn)象。育種或者選擇方法的選取依賴于植物繁殖模式、改良性狀的遺傳可能性以及商業(yè)上可用的變種類型(譬如，F(xiàn)l雜合變種、純系變種等)。對于可高度遺傳的性狀，選擇在單個區(qū)域評估出的優(yōu)異個體植物就很有效，而對于低遺傳可能性的性狀，應基于相關植物家族重復評估的平均值來進行選擇。流行的選擇方法一般包括譜系選擇、修正的譜系選擇、混合選才奪及輪回選擇。遺傳的復雜性會影響育種方法的選取。通常，通過兩個基因型雜交來開始進行育種，其中的每一個具有一種或多種對方所缺少的或者可與對方互補的所需特性。如果兩個最初的親本沒有提供所有所需的特性，可通過進行更多次雜交來涵蓋其它供體。在每一個連續(xù)的子代中，F(xiàn)l到F2;F2到F3、F3到F4、F4到F5等等，植物均進行自交以增加該系的純合性。典型地，在一個育種程序中，要進行5代或者以上的選擇及自交以獲得純合植物。語系育種通常用來改良自花授粉的農(nóng)作物。兩個具有優(yōu)良的、互補的性狀的親本，進行雜交以產(chǎn)生F1。通過一個或幾個F1自交或者兩個Fl同胞授粉來產(chǎn)生F2種群?？稍贔2種群中開始進行最優(yōu)個體的選擇；然后在F3中開始，在最優(yōu)的家族中選擇最優(yōu)的個體?？稍贔4代中開始對家族進行重復檢驗，以改善對于低遺傳可能性性狀的選擇效率。在同系繁殖更增進的階段(即F6和F7),檢驗最佳系或者表型相似系的混合，以尋找潛在的新變種?；亟挥N已經(jīng)用于從供體親本中將簡單遺傳的、具有高度可遺傳性的性狀的基因轉(zhuǎn)移到所需的、最好是純合的可用作輪回親本的變種中。被轉(zhuǎn)移的性狀的來源被稱為供體親本。初次雜交后，選擇具有所需性狀或者供體親本性狀的個體，然后與輪回親本重復雜交(回交)。預計所獲得的植物會具有輪回親本的特征加上所需性狀或來自供體親本的性狀。這種方法已廣泛用于繁育抗病害的變種。每種卡諾拉育種程序均應包括對育種過程效率進行定期的、客觀的評估。評估標準根據(jù)目的及目標有所差異，但應包括同適當?shù)臉藴氏啾容^從每年的選擇中所獲得的收益、增進的育種系的全部價值、及每單位投入(譬如，每年、每美元支出等)產(chǎn)生成功變種的數(shù)目。多種輪回選擇技術可用于改良由多個基因控制的數(shù)量遺傳性狀。在自花授粉農(nóng)作物中輪回選擇的應用依賴于授粉的難易程度以及來自每個成功雜交的雜合后代的數(shù)目。〉'昆合選4奪(massselection)及4侖回選才奪(recurretselection)可用于改良自花授粉或者交叉授粉農(nóng)作物的種群?？赏ㄟ^與幾個不同的親本雜交來鑒定或者產(chǎn)生遺傳上多變的雜合個體的種群?；趥€體的優(yōu)勢、突出的后代、或優(yōu)秀的配合力來選擇最佳的植物。所選擇的植物進行雜交以產(chǎn)生新的種群，并在其中繼續(xù)進行下一輪的選擇。在嚴格意義上，一粒傳法過程是指栽培一個隔離的種群，收集每個植抹一粒種子這樣一個樣本，然后使用該一粒種子樣本去栽培下一代。當種群已經(jīng)從F2增進到繁育所需的水平時，種系所來源的植林均可追溯到不同的F2個體。在種群中植林的數(shù)目由于一些種子無法發(fā)芽或者由于某些植抹無法產(chǎn)生種子從而每代均有所減少。因此，當世代增進結(jié)束時，并非種群中初始采樣的所有F2植抹均有后代來代表。在多粒程序中，卡諾拉育種工作者通常從一個種群的每個植抹上收集一個或多個莢或者長角果，然后將其一起脫?；旌显谝黄?。部分混合物用來栽培下一代，部分保存起來。該程序可參照改良的一粒傳法(single-seeddescent)或莢混合技術(pod-bulktechnique),已使用多粒程序來在收獲中節(jié)省勞力。用機器脫粒莢要比單粒程序中通過手工來分離單個種子快許多。多粒程序也可栽培同系繁殖的每一代種群中相同數(shù)量的種子。收集足夠的種子，以彌補那些沒有發(fā)芽或者產(chǎn)生種子的植林。如果需要，可使用加倍單倍體方法來獲得同源系，從而增加具有所需基因型的種子的供應。可在植物育種方法中使用包括諸如同工酶電泳、限制性片段長度多態(tài)性(RFLPs)、隨機擴增多肽DNAs(RAPDs)、任意引物聚合酶鏈反應(AP-PCR)、DNA擴增指紋(DAF)、序列特異擴增區(qū)域(SCARs)、擴增片段長度多態(tài)性(AFLPs)、簡單序列重復(SSRs)及單核香酸多態(tài)性(SNPs)這樣的技術在內(nèi)的分子標記。分子標記的一個用途是數(shù)量性狀座位(QTL)作圖。OTL作圖使用了與在數(shù)量性狀上具有可測量效果的等位基因連鎖的已知標記。在育種過程中的選擇基于來自植物基因組中與陽性效應等位基因相聯(lián)的標記的積累，和/或與陰性效應等位基因相聯(lián)的等位基因的消除。也可在育種過程使用分子標記來選擇數(shù)量性狀。例如，與等位基因連鎖的標記，或含有位于實際目標等位基因中的序列的標記，可用來在回交育種程序中選擇含有目的等位基因的植抹。標記也可用于選擇輪回親本的基因組并可排除供體親本的標記。使用該程序可使在選擇的植抹中所保留的供體親本的基因組的量最小化。也可用來降低在回交程序中所需的輪回親本回交的次數(shù)。在選擇過程中使用分子標記通常稱為遺傳標記增強選擇或者標記輔助選擇(MAS)。產(chǎn)生加倍單倍體(Swansone,a/.,1987)也可用來在育種程序中開發(fā)同系繁殖系。雜交后，可使用加倍單倍體方法來快速獲得純合植抹。在歐洲油菜中，可在產(chǎn)生單倍體胚芽時使用微孢子培養(yǎng)技術。然后將單倍體胚芽在合適的培養(yǎng)基上再生成單倍體幼苗。將其染色體二倍體化，產(chǎn)生加倍單倍體的植株。由于該過程省略了從雜合子來源獲得純合植抹所需的自花授粉世代，因此具有優(yōu)勢。授粉控制系統(tǒng)及將花粉從一個親本到其它親本的有效傳遞，可改良植物育種，并提供了用于產(chǎn)生雜合卡諾拉種子與植林的有效方法。例如，在蘿卜(7"尸/wm^ra〃vws)和油菜籽(歐洲油菜)之間通過原生質(zhì)體融合所開發(fā)的ogura細胞質(zhì)雄性不育(cms)系統(tǒng)是一種產(chǎn)生雜合子的最為常用的方法。它可提供穩(wěn)定表達的雄性不育性狀(Ogura,1986),Pelletiere"/.(1983)及有效的育性恢復基因(Pellan-Dourmee,a/.，1988)。在開發(fā)改良的新型蕓苔雜合變種中，育種工作者使用了自交不親和的(SI)、細胞質(zhì)雄性不育的(CMS)及核雄性不育的(NMS)蕓莒植株農(nóng)作物雌性親本。在使用這些植株時，育種工作者試圖改良產(chǎn)生種子的效率及Fl雜合子的品質(zhì)，并降低育種成本。當不使用SI、CMS或NMS來進行雜交時，則更難在后代(Fl代)中獲得并分離所需性狀，這是因為親本可進行異花授粉及自花授粉。如果親本之一是不能產(chǎn)生花粉的SI、CMS或NMS植林，則僅發(fā)生異花授粉。通過在雜交中排除一個親本變種的花粉，則植物育種工作者可確認獲得了具有一致品質(zhì)的雜合種子，只要親本具有一致品質(zhì)并且育種工作者進行了單次雜交即可。在一個例子中，F(xiàn)l雜合子的產(chǎn)生包括將CMS蕓苔雌性親本與產(chǎn)生花粉的雄性蕓苔親本進行雜交。但為了有效繁殖，F(xiàn)l雜合子的雄性親本必須具有育性恢復基因(Rf基因)。Rf基因的存在意味著Fl代不是完全或部分不育的，從而可進行自花授粉或異花授粉。Fl代自花授粉以產(chǎn)生幾個后續(xù)世代很重要，可確保所需性狀是可遺傳的并是穩(wěn)定的，并且可分離新的變種。細胞質(zhì)雄性不育并且可用于育種的蕓莒植株的例子有ogura(OGU)細胞質(zhì)雄性不育(R.Pellan-DelourmeW"/.,1987)。在法國的Instit.NationaldeRechercheAgricole(INRA)inRennes,Ogura雄性不育植林的育性恢復已從Aa//2"m^犯"vM(蘿卜)中轉(zhuǎn)移到蕓苔中(Pelletier"a/.，1987)。在WO92/05251及DelourmeW(1991)中描述了來源于蘿卜的Ffl恢復基因?？砷_發(fā)出該種恢復的改良版本。例如，參見WO98/27806中含改良的針對ogura細胞質(zhì)雄性不育的育性恢復基因的油籽蕓莒，該發(fā)明通過參考整合在本文中?？ㄖZ拉中的CMS不育的其它來源及改進包括Polima細胞質(zhì)雄性不育植抹、以及美國專利5,789,566DNA"sequenceimpartingcytoplasmicmalesterility,mitochondrialgenome,nucleargenome,mitochondriaandplantcontainingsaidsequenceandprocessforthepreparationofhybrids"、美國專利5,973,233"Cytoplasmicmalesterilitysystemproductioncanolahybrids"及WO97/02737"Cytoplasmicmalesterilitysystemproducingcanolahybrids，，、歐洲專利申i青O599042"AMethodsforintroducingafertilityrestorergeneandforproducingFlhybridsofSnmv'caplantsthereby"、美國專利6,229,072"Cytoplasmicmalesterilitysystemproductioncanolahybrids"、美國專利4,658,085"Hybridizationusingcytoplasmicmalesterility,cytoplasmicherbicidetolerance,andherbicidetolerancefromnucleargenes"中的那些植林，所有這些均整合在本文中。通常在代表著商品化目的地區(qū)的環(huán)境中，將有潛在價值的增進的育種系與適合的標準進行檢測和比較。最佳系會作為新的商品化系的候選者；而那些在某些性狀上仍有缺陷的品系可用作親本以產(chǎn)生新的種群進行進一步的選擇。對絕大多數(shù)性狀而言，真正的基因型價值可被其它混雜的植物性狀或者環(huán)境因素所掩蓋。一種鑒定優(yōu)異植物的方法是觀察其相對于其它試驗植物和一種或多種廣泛種植的標準系的表現(xiàn)。如果單次觀察無法下結(jié)論，則重復觀察可對遺傳價值提供更好的評估。育種工作者使用多種方法來協(xié)助確定應從隔離的種群中選擇哪些植株，及最終哪些系可用于商品化。除了種質(zhì)知識及育種工作者使用的技術外，部分篩選過程依賴于使用統(tǒng)計學分析進行的實驗設計。實驗設計及統(tǒng)計學分析可用于協(xié)助確定哪些植抹、哪些植物家族及最終是哪些品系在一個或多個目的性狀上顯著優(yōu)越或者不同。實驗設計方法可用于控制誤差，從而可更精確地測定兩個系之間的差異。統(tǒng)計學分析包括計算平均值、確定變量來源在統(tǒng)計學上的顯著性、及計算合適的方差分量。通常用百分之五和百分之一顯著性水平來測定給定性狀所產(chǎn)生的差異是否是真實的，或是歸因于環(huán)境或?qū)嶒炚`差。正確的檢驗方法應當可檢測任何主要錯誤，并確定比當前系優(yōu)異或改進的水平。新系除了有優(yōu)異的表現(xiàn)外，也必須與工業(yè)化標準兼容，或可形成新的市場。引入新系通常會對于種子生產(chǎn)者、栽培者、加工者及消費者造成額外開銷，用來進行專門的廣告及銷售、變換種子及商業(yè)化生產(chǎn)實踐、以及新產(chǎn)品利用。對前述新系發(fā)布所進行的檢驗應考慮到研發(fā)成本以及最終系的技術優(yōu)越性。對于種子繁殖系，一定要能夠容易地并且經(jīng)濟地進行切實產(chǎn)生。優(yōu)選地，殘余的雜合性不應超過5%。這些通向銷售及發(fā)行最終步驟的過程，從笫一次雜交開始通常要花費約6到12年。所以，開發(fā)諸如本發(fā)明中這樣的新系是一個耗時的過程，需要精確的預先計劃、有效利用資源、及在方向上的最小變動。因此，需要有人為的重要技術干預。此外，由于不育系統(tǒng)的增進，種系會被開發(fā)成可用作開放授粉的變種(即出售給栽培者用于種植的純系栽培種)，和/或作為用于生產(chǎn)Fl雜合種子的不育同系繁殖系(雌性)。在后一種情況下，期望具有與恢復者(雄性)有利的配合力(combiningability)。然后可將所獲得的雜合種子出售給栽培者用于種植?？墒褂眉毎|(zhì)雄性不育來產(chǎn)生卡諾拉的雜合種子。該類型的雜合子生產(chǎn)使用了3種同系繁殖系恢復系、A系及B系?；謴拖?，也稱為R系，用來作為雜合種子生產(chǎn)中的雄性?；謴拖稻哂兴熘淖鳛榛謴突?、負責雜合不育性的顯性核基因。R系與A雜交以產(chǎn)生F1雜合種子。A系由于細胞質(zhì)及由于核基因組中的非恢復等位基因因而是雄性不育的。由于A系是雄性不育的，所有它不能僅依賴自身來繁殖。為了產(chǎn)生A系，開發(fā)了B系。B系，也稱為維持系，在遺傳上與A系等價，只是B系具有正常的細胞質(zhì)，因此是雄性可育的。A系由B系來授粉。收集在A系植林上發(fā)育的種子，其后代與R系雜交以產(chǎn)生Fl雜合種子。在卡諾拉植物育種程序中開發(fā)卡諾拉雜合子包括3個步驟(1)從多種種質(zhì)庫中選擇植林用于首次育種雜交；(2)對從育種雜交中選擇的植抹進行幾代的自同的同系繁殖系與所選的同系繁殖系雜交，以產(chǎn)生雜合子。在卡諾拉的同系繁殖過程中，種系的活力會降低。當兩個不同的同系繁殖系雜交產(chǎn)生雜合子時，活力會恢復。關于同系繁殖系的純合性及同質(zhì)性的一個重要推論，就是在一對給定的同系繁殖系之間，雜合子總是相同的。一旦鑒定出可提供優(yōu)越雜合子的同系繁殖系，只要維持了同系繁殖系親本的同質(zhì)性，就可以無限生產(chǎn)雜合子種子。一個系的配合力，以及該系自身的表現(xiàn)，是選擇改良的可用作同系繁殖系的卡諾拉系中的一個因素。配合力是指一個系作為親本與其它系雜交形成雜合子時的貢獻。將出于選擇優(yōu)越品系目的而產(chǎn)生的雜合子指定為測交系。然后將該含義調(diào)整成除去了環(huán)境影響，并調(diào)整為只考慮品系間已知的遺傳關系。生產(chǎn)雜合種子需要將由雌性親本產(chǎn)生的花粉失活。花粉的不完全失活會提供自花授粉的潛力。這種不經(jīng)意間的自花授粉種子可能會在無意中被收集并與雜合種子包在一起。類似地，由于在田間雄性親本與雌性親本相鄰種植在一起，也有可能會在無意間收集了雄性自花授粉的種子并與雜合種子包在一起。一旦播種了來自雜合子袋子中的種子，可能會鑒定并選擇這些自花授粉的植林。這些自花授粉的植株在遺傳上等價于用于產(chǎn)生雜合子的同系繁殖系之一。盡管存在將同系繁殖的種子包括在雜合種子袋子中的可能性，但這種事情極少出現(xiàn)，因為會格外注意以防止此類夾雜。本領域的技術人員可通過視覺或分子方法，來鑒定并選出這些自花授粉的植林。歐洲油菜卡諾拉植抹，沒有任何雄性不育或者自交不親和系統(tǒng)，通常被認為是自育的，大約70到90%的種子通常是由于自花授粉而形成的。當在給定栽培地點上的公認的昆蟲授粉者的種群變大時，異花授粉的百分比也可進一步增加。III.定義單位、前綴及符號以其SI接受的形式進行注釋。在本文用法中，"合適的參照"是指可為實驗系提供核盤菌抗性評估的基礎的蕓苔基因型。同實驗系一樣，在包括病害壓力在內(nèi)的相同環(huán)境條件下培養(yǎng)合適的參照，它同實驗系具有大致相同的成熟期。例如，對于春季卡諾拉而言，期望合適的參照可在實驗系的+/-10天、通常是+/-5天內(nèi)成熟。成熟的標準對于本領域技術人員而言是周知的。合適的參照通常是可普遍獲得或者廣泛培養(yǎng)的變種。術語"合適的參照"實際上反映了多種合適的變種。例如，對于春季卡諾拉基因型而言，PioneerHi-Bred變種46A76和46A65中的每一個均是合適的參照；兩個變種的平均表現(xiàn)也是合適的參照。對于冬季卡諾拉基因型而言，公共系Columbus及Express中的每一個均是合適的參照；兩個變種的平均表現(xiàn)也同樣是。術語"卡諾拉"是指其中油類必須含有低于2%的芥酸、并且種子的固體組分中每克風干的不含油的固體中所含的的3-丁烯基的芥子油苷、4-戊烯基芥子油苦、2-羥基3-丁烯基芥子油苦和2-羥基4-戊烯基芥子油苷中的任何一種或者任意的混合物必須低于30微摩爾的蕓苔植物。在本發(fā)明語境中的術語"雜交的"或"雜交"是指配子通過授粉進行融合以產(chǎn)生后代(即細胞、種子或植林)。該術語既包括有性雜交(一個植株由另一個植抹來授粉)也包括自交(自花授粉，即花粉和胚珠來自相同的植抹)。術語"最高有效水量(fieldcapacity)，，是指在土壤的最上面4英寸、或者大約是土壤的最上面4英寸濕度完全飽和了，但是沒有或幾乎沒有積水。術語"田間抗性，，是指在田間條件下測定的抗性。它反映的是整個植物或者植物種群暴露在自然田間條件下的害蟲或者病害中時的抗性。田間抗性可通過植抹的發(fā)育階段來測定，也可根據(jù)可收獲產(chǎn)量的效果來表示，所反映的是當植物處對于病害發(fā)生最為敏感的生長階段中時的定向評估。術語"遺傳連鎖"是指遺傳的基因座處于連鎖不平衡狀態(tài)，在統(tǒng)計學上可確定不是獨立分配。遺傳連鎖的基因座的獨立分配在51%到99%之間或者是其間的任意整數(shù)值，優(yōu)選地至少為60%、70%、80%、90%、95%或99%。本文所用術語"同系繁殖"是指純合子植物或者純合子植物的集合。本領域的普通技術人員知道在同系繁殖中可存在某些殘留的雜合性。術語"基因滲入"是指將所需的基因座通過親本植林間的有性雜交導入到至少一個后代植抹中，其中至少一個親本植抹在其基因組中具有所需的基因座。術語"部分葉片抗性"是指同敏感植林的葉片反應相比，對核盤菌的抗性擴展到葉片上。由于部分葉片抗性，與敏感植抹中的情況相比，病害在植物上發(fā)展更為緩慢，或者程度更低。術語"標記"或者"分子標記"是指當鑒定諸如QTL(數(shù)量性狀基因座)這樣的遺傳連鎖基因座時用作參考點的基因座。該術語也可指同基因組序列互補的核酸序列，譬如用作探針的核酸。術語"部分莖抗性"或者"莖抗性"是指莖中的不完全抗性。同敏感植抹的莖反應相比，對核盤菌的抗性擴展到莖上。在部分莖抗性中，與敏感植抹中的情況相比，病害在植物上發(fā)展更為緩慢，或者程度更低。不過，在具有"部分莖抗性"的植抹中，該植抹會表現(xiàn)出害病狀況(同完全抗性相比較)。術語"完全抗性"是指其中病害的發(fā)展中的某一方面、通常是癥狀表現(xiàn)或者病原體的生殖被完全阻斷(同部分抗性相比較)的抗性反應。術語"輪回選擇"是指其目標是通過重復雜交及循環(huán)選擇來增加有利的數(shù)量遺傳性狀基因的頻率的育種系統(tǒng)。術語"成熟"或者"至成熟天數(shù)"是指從播種到收獲的日期數(shù)目。在基因型之間或者之中，成熟根據(jù)位置、生長季節(jié)及播種時間可變化很大。本文所用術語"種群"是指植抹的雜種繁殖類群或者共享一個基因庫的個體的集合。種群可以是同質(zhì)的(在遺傳上一致)，譬如由純合親本雜交而建立的Fl種群；或者是遺傳上多樣的，譬如通過雜合植林自花授粉或者雜合親本雜交而建立的隔離的后代。此外，可將同質(zhì)的種群幾乎所有的基因座均培育為純合的，產(chǎn)生一個真正純系后代的一致的種群。術語"種群育種"是指對使用來自相同種群的個體作為親本來進行育種的種群進行改進。種群育種意味著可在一個種群內(nèi)進行輪回選擇。術語"春季蕓苔"或者"春季卡諾拉，，是指不需要進行春化的蕓莒植物。術語"有利于核盤菌的形態(tài)"或"有利于核盤菌的表型"是指同對核盤菌感染具有更低幫助的蕓苔表型相比，更容易形成并擴大核盤菌感染的蕓苔表型。例如，有利于核盤菌的形態(tài)至少包括以下形態(tài)性狀中的一種緊密的枝條、過低的枝條、延長的花期、過高的花瓣維持、過高程度的葉片維持、及易于倒伏或傾斜。這些形態(tài)性狀為最初從花瓣生菌提供了良好的條件，并增加了植物周圍的濕度。相反，對核盤菌感染具有較少有利條件的形態(tài)性狀的植抹的例子至少包括以下性狀中的一種較低的花瓣維持、缺少花瓣的表型、良好的直立性、缺少緊密枝條、枝條較高、及早期葉片脫落。這些形態(tài)性狀降低花瓣生菌、以及植物周圍的濕度水平。術語"病害發(fā)病率"是指在樣本中受病害侵襲的植抹數(shù)目。典型地，使用受病害侵襲的植抹占樣本中植抹總數(shù)目的百分比來表示。術語"SSDI%，，是指作為種群中感染了核盤菌的植林的百分比來測定的菌核病發(fā)病率百分比。術語"SSDI"是指從1到9的等級級別，用來在如實施例7及表4中所述的可控極端病害壓力田間實驗條件下測定菌核病發(fā)病率。SSDI可測定同合適的參照變種相比，種群中被核盤菌所感染的植林的百分比。對于春季卡諾拉而言，合適的參照有PioneerHi-Bred變種46A76和/或PioneerHi-Bred變種46A65。對越冬卡諾拉而言，合適的參照有Columbus和/或Express。例如，對于春季卡諾拉，在一側(cè)的一排PioneerHi-Bred變種46A76與另一側(cè)的一排PioneerHi-Bred變種46A65之間播種5排待測種系。典型地，在極端病害條件下，PioneerHi-Bred變種46A76的病害發(fā)病率為60%(SSDI%)，46A65的病害發(fā)病率為70%(SSDI%),平均為65%。如果在任一特定的檢測點上PioneerHi-Bred變種46A65和PioneerHi-Bred變種46A76的平均SSDP/o不是65%,那么PioneerHi-Bred變種46A65和PioneerHi-Bred變種46A76的得分將乘以一個系數(shù)使得它們平均為65%。待測種系的得分也要乘以這個系數(shù)。然后根據(jù)表4中相應的SSDr/。來對種系給定其等級級別。例如，如果參照的平均值為70%,由于超出了目標病害壓力，就使用系數(shù)65/70來降低生長在參照之間的實驗系所測定的病害百分比。相反，如果參照的平均值為60%,由于低于目標病害壓力，就使用系數(shù)65/60來增加(調(diào)節(jié))實驗系的SSDI。/。。盡管目標病害發(fā)病率是65%，可以預料到由于大樣本的植林、環(huán)境變化及接菌上的變化會出現(xiàn)圍繞該目標變動的偏差，因此，通過參照來進行調(diào)整使得可在苗圃中對種系進行比較，并防止了對田間反應進行錯誤分類。由于利于核盤菌的條件不會在自然界按照可預測的方式出現(xiàn)，因此可廣泛使用在實施例7中所述的極端病害壓力田間實驗條件來產(chǎn)生本發(fā)明的核盤菌抗性系。所以，試圖進行快速選擇以及希望提供可重復的條件時，可使用極端病害壓力田間實驗條件。試驗中的SSDI分級等級，在針對病害做了調(diào)整后，可以根據(jù)病害的嚴重度進行進一步調(diào)整。因此，按先前所述調(diào)整了SSDI。/。之后，可同樣來進行SSDS的調(diào)整。將感染的參照植抹的平均SSDS(l-8分)與實驗數(shù)據(jù)進行比較。如果平均SSDS優(yōu)于實驗系(例如參照等級為3而實驗系等級為4)，則SSDr/。通過乘以^來進行調(diào)整。例如，如果實驗系的SSDr/。為20。/),%乘以20%=15%。這在SSDI等級這對應的是7.5的級別。相反，如果實驗數(shù)據(jù)的SSDS是2(更受影響)而參照的為3,則SSDI。/。要乘以3/2。例如，如果SSDr/o是20。/。，乘以3/2等于30%。這在SSDI等級這對應的是6.0的級別。術語"極端病害壓力田間實驗條件，，是指如實施例7這所述的可控病害實驗條件。例如，使用Niger種子載體模擬帶有核盤菌的花瓣來產(chǎn)生極端病害壓力。在田間，自然的生菌可作為備用接菌而存在。將待測植林的百分比病害發(fā)病率按照上述所用的參照進行調(diào)整，并賦給1到9的SSDI得分。不過，在這些極端條件下，植株由于以下原因?qū)吮P菌更為敏感(1)在極端病害壓力田間實驗條件下，植抹處于通過噴霧進行灌溉的有利于核盤菌發(fā)生的潮濕環(huán)境中，(2)在極端病害壓力田間實驗條件下，因為使用了確保有利于核盤菌發(fā)生的持續(xù)潮濕條件而使用的人工大棚，使得植抹處于半封閉的環(huán)境中，及(3)在極端病害壓力田間實-瞼條件下，在每塊地上有6排不同的待測植抹，所以，任意一排具有特定形態(tài)學表型的植抹都被兩排具有不同形態(tài)學表型的不同植抹所圍繞。因此，任何由對核盤菌感染缺少有利因素的形態(tài)學表型所帶來的益處(例如更高的分枝)，都因為任意一排都是被具有不同的形態(tài)學表型的植抹(例如較低的分枝)所圍繞，而被降低了。相反，在自然田間條件下生長的植林，(1)沒有封閉在確保持續(xù)濕度的人工大棚內(nèi)，及(2)生長在被具有相同形態(tài)學表型的植抹所圍繞的用地上，可以使得來自該形態(tài)學的所有益處都表現(xiàn)出來。因此，對于選擇例如更高的分枝這樣的對核盤菌感染缺少有利因素的形態(tài)而言，在自然的田間條件下要比在極端病害壓力田間實馬全條件下明顯優(yōu)越。術語"自然田間病害條件，，是指在灌溉或非灌溉田地中生產(chǎn)用地里的條件。感染是通過定植在花瓣上的菌絲體來實現(xiàn)的。生產(chǎn)用地提供了可反映出與農(nóng)場田地類似的自然條件中植物種群的樣本。使用ssdi%來表示在重復實驗中被感染植抹的百分比。除了ssdi。/。之外，也可收集個體植抹的數(shù)據(jù)來在不同等級上(1-9的Pioneer等級以及0-5的公共等級)來反映嚴重度(SSDS)。其它的可進一步對病害效果進行量化的參數(shù)，例如下述及表2中所示的核盤菌田間嚴重度(SSFS),也可用于評估。SSFS可提供一些情報，在高自然田間病害壓力下尤為如此。術語"病害嚴重度"是指由于病原體感染而導致的植抹損害程度。在本發(fā)明追使用了兩種尺度來測定病害嚴重度。第一個是從1到9的PioneerHi-Bred等級。第二個是在公共機構的研究者中所使用的等級，這里用0-5的等級表示。二者均在表15中有所描述。在表2中給出了它們用途的某些例子。術語"SSDS"是指菌核病嚴重度，是對感染植林上病害發(fā)生程度的度量。例如，它可區(qū)分只有很小癥狀的植抹及死亡植林。為了本發(fā)明的目標，使用了兩種分級等級(1)在表15中描述了范圍為1到9的PioneerSSDS分級等級及(2)在表2的腳注中描述了范圍在0到5的PublicScientist's的等級。術語"SSFS"是指核盤菌田間嚴重度，是對病害發(fā)病率(SSDI%)后果、以及在自然田間條件下感染植抹發(fā)病程度(SSDS)的度量。它是對田間真菌影響的一個度量，在高病害壓力下，及當病害發(fā)病率在田間非常顯著時，可提供更多信息。它可通過用病害嚴重度乘以ssdp/。并且除以5來計算，其中病害嚴重度的分級為0-5,如表2所述，0表示沒有感染，5表示是死亡植林。術語"數(shù)量性狀遺傳位點"或者"QTL，，是指可影響表型性狀表現(xiàn)的分離的遺傳因子。表2.田間收集的核盤菌參數(shù)SSDIQ/。和SSDS，以及它們相對于原始參數(shù)SSDI(實驗數(shù)據(jù))和SSFS(自然數(shù)據(jù))的關系.<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>SSDI%是種群中感染了核盤菌的植株的百分比。SSDS是對受感染植抹上病害發(fā)展程度的分級。在本發(fā)明使用了兩種等級。范圍從l(死亡)到9(沒有病害)的PioneerSSDS等級與范圍從0(沒有病害)到5(死亡植林)的公共等級。對于PioneerSSDS等級的細節(jié)可參見表15。下面給出了公共等級0=沒有病害；1=表面損害或者小枝條受感染；2=大枝條死亡；3=主干至少50%環(huán)剝；4=主千環(huán)剝但植抹可產(chǎn)生良好的種子；5=主干環(huán)剝，產(chǎn)量大幅下降。SSDI如表4所述分為1到9個等級，并對春季卡諾拉按照參照變種46A65和/或46A76、對越冬卡諾拉按照參照變種Express和/或Columbus的SSDI%進行了調(diào)整。僅僅在可控的極端病害壓力田間實驗條件下使用該等級?？赏ㄟ^使用因子X乘以觀測的SSDI。/。來計算，其中因子X是使合適參照的平均SSDI。/。為65%的因子。在調(diào)整發(fā)病率后可對嚴重度進行調(diào)整。然后根據(jù)表4的等級計算SSDI。對于實施例1到5，假定參照的平均SSDI%=65%、參照的平均SSDS=4來計算SSDI值。SSFS是在田間自然病害壓力下對病害發(fā)病率與嚴重度的度量。它可通過下面來計算SSFS=[SSDI%xSSDS(0-5scale)]+5。IV.實施例在花期處于長期潮濕條件下的卡諾拉中，核盤菌莖腐是通過生菌花瓣來發(fā)展的。掉落的花瓣使得核盤菌可感染會將其引向莖部的卡諾拉葉片。真菌導致了核盤菌莖腐。植林在成熟期前死亡，導致產(chǎn)量損失約50%。卡諾拉對核盤菌莖腐是敏感的。在有著過長潮濕周期的年份里，對卡諾拉的損害非常顯著。為了降低或預防這種損害，農(nóng)民通常根據(jù)潮濕周期的持續(xù)時間使用一或兩種殺真菌劑。實施例1:在低、中、高、很高和極端病害田間研究條件下測定卡諾拉參照的表現(xiàn)方法和才才^牛為了在低、中、高和很高核盤菌條件下測定可普遍獲得的春季卡諾拉培養(yǎng)物的核盤菌耐受水平，收集了多年來包括公共生產(chǎn)用地在內(nèi)的自然田間條件下的數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)總結(jié)在表3中。44A89和46A65的數(shù)據(jù)來自2001年明尼蘇達州的5次重復自然試驗(JurkeandFernando,2003)。似項目的反應的評估、以及2003年北達科他州的數(shù)據(jù)。在本研究中生成了極端病害條件下卡諾拉參照的表現(xiàn)的數(shù)據(jù)。越冬卡諾拉系Columbus和Express作為連續(xù)參照包括在極端病害壓力研究試驗中。如表4和表10c所示，它們是敏感或中度敏感系。極端病害條件極少見，但可能發(fā)生，其目的是篩選在這種條件下的品系。極端病害壓力是指連續(xù)20-30天潮濕及平均溫度為20到25°C。用核盤菌感染的植株在極端病害條件下通常需要使用兩種殺真菌劑來抵抗病害。在每次使用時，殺真菌劑可提供平均10-14天的保護。在極端病害條件下進行篩選選擇可確保選擇能夠抵抗典型的病害壓力。由于極端病害條件在自然界很少發(fā)生，因此在田間使用人工極端條件，如實施例7所述。這包括人工接種定植了核盤菌的Niger種子，進行灌溉，使用網(wǎng)格維持潮濕環(huán)境。對PioneerHi-Bred變種44A89、46A65和46A76進行了檢測。使用敏感性更低的46A65和46A76作為連續(xù)參照來監(jiān)測病害水平并測定表現(xiàn)(SSDI)。為了測定噴灑在感染核盤菌的田間的殺真菌劑的效果，收集并總結(jié)了自然田間條件下生產(chǎn)用地的數(shù)據(jù)，以及接菌并在30%開花期噴灑了Lance殺真菌劑的數(shù)據(jù)。結(jié)果表3所示的是春季卡諾拉參照在各種條件下的表現(xiàn)。對病害發(fā)病率(即，被核盤菌感染的植抹的百分比)的篩選是首要目標。以前的田間數(shù)據(jù)表明典型的中度或高度病害壓力可對46A65產(chǎn)生20-50%的病害發(fā)病率，對46A76產(chǎn)生10-40%的病害發(fā)病率(表3)。但在極端條件下，如表3所示，PioneerHi-Bred變種46A65的病害發(fā)病率百分比約為70%,PioneerHi-Bred變種46A66的病害發(fā)病率百分比約為60%。如果天氣對核盤菌感染不利，則卡諾拉參照所受影響降低，而且病害發(fā)病率對部分抗性植抹來說是部分降低或消除的。由于多數(shù)田間情況是基于低于極端病害壓力條件的，因此參照和開發(fā)的品系通常比表4所示的影響更小一些。在極端病害壓力下，根據(jù)噴霧灌溉下每隔6行的連續(xù)參照來篩選病害發(fā)病率，如實施例7所述。該極端病害壓力研究田間數(shù)據(jù)在表4中表示為等級為1到9的SSDI。典型地，5行待測品系播種在一邊為一行PioneerHi-Bred變種46A76、另一邊為一行PioneerHi-Bred變種46A65之間。在極端病害條件下，PioneerHi-Bred變種46A76的病害發(fā)病率為60o/Q(SSDI%),PioneerHi-Bred變種46A65的病害發(fā)病率為70%(SSDI%),平均為65%(SSDI%)。如果在任何特定的待測用地中，PioneerHi-Bred變種46A65和46A76的平均SSDP/。不是65%,則對PioneerHi-Bred變種46A65和PioneerHi-Bred變種46A76乘以一個系數(shù)，使其平均值為65%。待測品系的分數(shù)也乘以該系數(shù)。在如所述的SSDI定義進行了嚴格調(diào)整后，將品系根據(jù)SSDI劃分等級，如表4所示。表3.在普遍獲得的春季卡諾拉的自然核盤菌田間反應中的變化(SSDI%)病害壓力<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>極端病害壓力用于實施例7所述的核心研究和開發(fā)中。**在加拿大西部北達科他州和明尼蘇達州的農(nóng)場田間的每個感染水平的頻率估計。表4.在極端病害壓力(研究試驗)下測定田間表現(xiàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>*SSDI。/。核盤菌菌核病發(fā)病率％^SSDI核盤菌菌核病發(fā)病率等級，以極端病害壓力(研究試驗)下的春季卡諾拉參照46A65/46A76和越冬卡諾拉參照Express/Columbus來調(diào)整發(fā)病率和嚴重性。表5所示的是殺真菌劑的使用可降低核盤菌對蕓苔的作用，可用作抗核盤菌表現(xiàn)的改進的間接測定方法。表5所示的是一種殺真菌劑于2004年在Morden和Carman、馬尼托巴省自然感染條件下應用在重復田間用地的效果。從表5可看出，在低病害壓力條件下，除了高敏感植抹外，可使用單一的殺真菌劑來實現(xiàn)對核盤菌的近乎完全控制。殺真菌劑對等級為1的品種的效率(HS)低于殺真菌劑對等級為2或3的品種的效率(S或MS)。表5.2004年于Morden,馬尼托巴省和Carman,馬尼托巴省地區(qū)，在自然條件下的生產(chǎn)用地中，核盤菌對噴灑或未噴灑的參照的感染情況(SSDI%)<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>*Lance(啶酰菌胺)-BASF登記的控制核盤菌的殺真菌齊,HS二高度敏感；S二敏感；MS二中度敏感表6所示的是2003年北達科他州/明尼蘇達州田間試驗的結(jié)果。絕大多數(shù)普遍商品化的卡諾拉變種根據(jù)如表2所述的PioneerSSDI的1到9等級而定級為1或2。某些罕見變種為等級3，可更有效地受到殺真菌劑的保護。例如，表6所示的是核盤菌等級約為2的Hyola357在北達科他州殺真菌劑試驗中具有約69%的發(fā)病率。在使用最好的殺真菌劑后，發(fā)病率降低為44%。表6也表明核盤菌等級為1或2的Invigor2663在明尼蘇達州試驗中有22.3%發(fā)病率，其病害壓力是較低的。在使用殺真菌劑后，發(fā)病率降#^為5%。此頁無內(nèi)容表6.2003年在NorthDakotaStateUniversityCarringtonResearch/ExtensionCenter和UniversityofMinnesotaRedLakeFalls的相<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>基于病害發(fā)病率和表3,北達科他州試驗可劃分為很高或極端病害壓力。在北達科他州的殺真菌劑試驗的結(jié)果與極端病害壓力下對等級為1-9的PioneerSSDI是相當?shù)?，表明最好的殺真菌劑對敏感變種的保護作用。在試驗中，在該壓力下，Endura(啶酰菌胺TM)與其它殺真菌劑相比較，可提供最高水平的保護作用。*來源于2003年的EvaluationsforfungicidesforControlofSc/era"腿StemRotofCanolainNorthDakotaandMinnesota,NDSUExtensionServiceApril2004。實施例2:開發(fā)對核盤菌的抗性_一種群T的開發(fā)本研究的目標是用核盤菌抗性變種來替代卡諾拉的殺真菌劑處理。其策略是使用具有部分抗性的天然來源，通過群體內(nèi)的輪回選擇來增加這些可避免病害的形態(tài)性狀來源，以獲得很高水平的部分抗性。一旦在避免病害的背景中增加了抗性，如果此抗性可維持最大長度的從花瓣凋落到花期結(jié)束暴露在病害中的時間，則該抗性是徹底的，因此可在不顯著損害植株的情況下抵抗病原體。避免病害的形態(tài)性狀包括，例如，良好的直立性和不易彎曲的柄(莖)、更遲的成熟期、高分枝、較低的花瓣維持和快速的葉片脫落。生理性狀主要是與某些葉抗性相關的較強的莖抗性。因此，由形態(tài)性狀所降低的病害發(fā)展可進一步被莖和/或葉抗性所降低。當較強的部分莖抗性與可降低病害影響的形態(tài)性狀相結(jié)合時，可降低或最小化真菌對莖的整體影響。在缺少有利的形態(tài)性狀時，會降低整體表現(xiàn)，但仍顯著優(yōu)于卡諾拉參照。當延長有利于核盤菌感染的天氣情況的時間時，會產(chǎn)生極端病害壓力。典型地，這在溫度在20到25°C、相對濕度大于80%時發(fā)生。在這些情況下，可發(fā)生最理想的植物感染(Herane,a/.,1999)。除了濕度外，另一個潮濕植物冠層的指示物是植物上的自由水分和絕對含水量。方法與材料田間抗性所用的方法。從1986年開始，從美國(美國農(nóng)業(yè)部)、日本(漁業(yè)和自然資源省)及加拿大(植物遺傳資源部)的政府部門獲得了歐洲油菜油菜籽。油菜籽中芥子油苷及芥酸的含量很高，因此不是卡諾拉品種。這稱為雙高。相反，歐洲油菜卡諾拉品種的芥酸和芥子油苷含量很低，也稱之為雙低。所定義的蕓苔植物，其中油類必須含有低于2%的芥酸，種子的固體成分必須在每克干重、不含油的固體中含有低于30微摩爾的3-丁烯基的芥子油苷、4-戊烯基芥子油苷、2-羥基3-丁烯基芥子油苷和2-羥基4-戊烯基芥子油苷。鑒定所獲得的油菜籽種質(zhì)對核盤菌的莖反應(表7)。很多部分莖抗性油菜籽的篩選與卡諾拉品系的篩選交叉進行，提取具有部分莖抗性及卡諾拉品種性狀(低芥酸和/或低芥子油苷)的后代。表現(xiàn)出部分莖抗性的卡諾拉品系可用于進一步的研究及種群發(fā)育。用于開發(fā)改良的春季卡諾拉系的核盤菌抗性的來源列在表7中。來自USDA(US)及MAFF(Japan)的簡介也用于開發(fā)改良的越冬卡諾拉系。在1991年，Pioneer開始了重組具有生理部分莖抗性及田間形態(tài)抗性的卡諾拉品種的種群繁育計劃。組合成了種群T。在表8中給出了0-10循環(huán)的詳細情況。每個循環(huán)均在表中的一行進行了描述。每行描述了所用品種、雜交以產(chǎn)生SG,種子的增加及對So進行溫室選擇，產(chǎn)生S1;然后在田間進行S,檢驗，并進行包括農(nóng)藝學及質(zhì)量分析在內(nèi)的選擇。前四個循環(huán)使用的是封閉種群，如表8中所述。將生理部分莖抗性的進一步變異引入到循環(huán)5、6、7和8中(表8)。在如實施例6與7所述的溫室及田間選擇方法之后，對品系進行檢驗。篩選表現(xiàn)出高水平抗性的后代，并在田間觀察持續(xù)的改良(圖1)。在實施例6的方法之后，只有溫室莖選擇的后代在田間是優(yōu)異的。表7.種群T的開發(fā)-轉(zhuǎn)變?yōu)榭ㄖZ拉、并用于種群T開發(fā)的油菜籽組分(在原始系或其春季篩選(USDA)vs.敏感參照中的室內(nèi)莖損害長度及SSDS數(shù)據(jù))<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>是作為日本原品種的春季卡諾拉的敏感參照Westar*對于USDA和PGR原品種的敏感參照是Pioneer春季系NS1602。表8.通過修改的Sl輪回選擇方法開發(fā)種群T。<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>種<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>表8注釋從循環(huán)6開始進行重復檢驗。"品種"包括在開發(fā)卡諾拉品系來源品種中所用的遺傳背景。封閉種群=僅基于先前循環(huán)的后代的種群開發(fā)，沒有引入新來源。開放種群=基于先前循環(huán)及先前不在種群中的新來源的后代的種群開發(fā)。基因滲入=在種群引入新來源；與開放種群有關。字母F通常用于繁育(譜系繁育)，表示子/后裔世代，F(xiàn)l是由雜交最初產(chǎn)生的種子或植抹。S代表自交，F(xiàn)1可以是S0或無自交。以這種方式，可區(qū)分來自種群(S)與譜系繁育(F)的后代。SO是Fl,它通常用于表明有大量自交后代的種群繁育。種群繁育中Sl等價于譜系繁育中的F2。不同方法的實施例如下所述O年將來源品種雜交，產(chǎn)生SO,S0自交/選擇，在封閉種群中對Sl進行田間選擇。第1年將Sis自交產(chǎn)生SO,S0自交/選擇，Sl田間選擇；封閉循環(huán)的例子(循環(huán)l-4和循環(huán)9、10)第2年將第1年的Sl和新原料雜交-BCO方法(循環(huán)8)或開放循環(huán)的例子(循環(huán)8)。將來自第1年的Sl與已經(jīng)同種群T雜交的新原料進行雜交-BCl方法(循環(huán)5、6、7);開放循環(huán)例子(循環(huán)5、6、7)。結(jié)果圖1是種群T在循環(huán)5到10中生成的品系的柱狀圖，表明了在極端病害壓力田間實驗條件下產(chǎn)生核盤菌抗性方面的進展，如在循環(huán)5到10中對參照所測定的那樣。隨著每一年種群T的改進，病害發(fā)病率的百分率降低，種群平均SSDIl-9的分級提高了。Y軸代表后代頻率，X軸代表按表4所述的1-9的SSDI分級來定級的核盤菌抗性。圖1表明每個循環(huán)的方式和模式在持續(xù)提高。例如，循環(huán)5的種群模式從2.5提高到循環(huán)8的5.5,循環(huán)10的7.5。另外，在循環(huán)7、8和9的單個選擇的等級為7.5、8.0和8.5。篩選具有高水平抗性的后代，并在田間觀察持續(xù)的改進。圖1所示的試驗中的病害發(fā)病率的程度是在極端病害壓力田間實驗條件下測定的。這是在自然田間環(huán)境中最高的可能病害壓力。該病害水平在農(nóng)場田間很少發(fā)生(表3)。因此，希望在本試驗中篩選的品種在更低和更典型的病害壓力下會表現(xiàn)更好。例如，在典型的中度田間病害壓力下，PioneerHi-Bred變種46A65和46A76的病害發(fā)病率通常分別為20-30%及10-20%(表3)。^旦在;^及端病害壓力下，病害發(fā)病率的水平分別為70%和60%(表3)。具有部分田間抗性的植抹表現(xiàn)出(i)在植抹上降低病害發(fā)生，(ii)病害發(fā)作顯著延遲，及(iii)當用莖直接接觸進行接菌時，抵抗病害發(fā)生的時間更長。如果存在利于病害發(fā)生的條件，在部分抗性品種中可觀察到病害影響的顯著降低(表3和圖1)。表9描述了部分具有改進的田間抗性的品系，并給出了由獨立的第三方團體在田間自然條件下所進行的檢驗中的表現(xiàn)。2004年的SSDI%數(shù)據(jù)是在馬尼托巴省的開放田間試驗中，于中度病害壓力下進行檢測的(通過測定3個參照中2個的表現(xiàn))。其中一些相同的品系在2003年于明尼蘇達大學(MN),在高度壓力下(2個參照中的2個)和在2003年于北達科他州(ND),在很高及極端壓力下進行檢測的，如表3所示。所有田間抗性品系具有顯著高于參照的部分莖抗性水平。值得注意的是，在這4個地方，這五個列出的品系每個的表現(xiàn)都在本權利要求的范圍內(nèi)，即，在相同的田間環(huán)境和病害條件下，平均菌核病病害發(fā)病率(SSDI%)得分比PioneerHi-Bred變種46A76的SSDI%得分低約60%。也在極端病害壓力田間實驗條件下對種群T的篩選進行試驗(表10a和表10b)。在循環(huán)8引入了選擇02SN41269。循環(huán)8中選擇03SN40441用于開發(fā)循環(huán)9和03SN40341,及來自先前如表8所述的循環(huán)8的22個Sl品系。用3個品系(即02SN41269、03SN40341和03SN40441)進行雜交，種群T后代會在其一個或多個中恢復其遺傳抗性。表10a所示的是對03SN40341、03SN40441和02SN41269在極端病害壓力田間實驗條件下的3次試驗的結(jié)果(2004兩次，2003年1次)。與46A76相比較，03SN40341、03SN4044和02SN41269的病害發(fā)病率分別平均為39%、39%和44%。在這些極端條件下，植抹對核盤菌更敏感，其原因至少是上述定義"極端病害壓力田間實驗條件，，中所討論的原因。相反，在自然田間條件下培育的植林(1)不覆蓋保證持續(xù)濕度的人工冠層，及(2)栽培在由具有相同形態(tài)表型的植林包圍的用地中，從而可使所有來自形態(tài)的優(yōu)勢都被表達。因此，具有對核盤菌感染不利的形態(tài)，例如高度分枝的選擇在自然田間條件下比在極端病害壓力田間實驗條件下表現(xiàn)得明顯更好。例如，與46A76相比較，在自然田間條件下，03SN40341、03SN40441和02SN41269的病害發(fā)病率分別為23.2%、13.7%和49.1%,如表9所示。因此，02SN41269具有比03SN40341和03SN40441更利于核盤菌感染的形態(tài)。與03SN40341和03SN40441相比較，02SN41269更容易倒伏(圖2A)。圖2A表明02SN41269雙倍體系04DHS12921和雙倍體04DHS11319也比參照和其它待測品種更易于倒伏。在自然數(shù)據(jù)組中，對倒伏的低抗性可危及核盤菌表現(xiàn)，特別是在諸如2005年的NDSU-Carnngton2005這樣的具有大量濕氣或過度灌溉時尤為如此。研究數(shù)據(jù)組避開倒伏抗性，提供了反映遺傳抗性與形態(tài)一起構成的可能性的分數(shù)?？梢允褂脜⒄兆兎N46A76、46A65和44A89作為示例來說明極端病害壓力田間實驗條件同自然田間條件相比對形態(tài)的影響。46A76是北達科他州核盤菌變種試驗和明尼蘇達州大學擴展試驗中最不敏感的變種之一(表9,2003數(shù)據(jù))。與46A65或44A89相比較46A76所具有的形態(tài)最不易被核盤菌感染。形態(tài)包括諸如高度分枝和良好直立性等特征。對于在極端病害壓力田間實驗條件下的SSDI%得分(表10a)，44A89是46A76的115%，而46A65是46A76的98%。但在2004年的自然試驗中(表9),44A89是46A76的232%，46A65是46A76的199%。這清楚說明，與其它卡諾拉參照相比較，特別是在自然田間條件下，46A76是測定田間抗性的高標準。這也說明自然田間結(jié)果與極端病害壓力田間研究結(jié)果的差異。極端病害壓力田間實驗條件對所有基因型進行調(diào)整，代表最惡劣的情況，即，通常在自然田間環(huán)境中僅發(fā)生1到2%。(參見表3.)。在這種極端條件下表現(xiàn)良好的品系被認為至少在自然田間環(huán)境中也會表現(xiàn)良好。用參照變種，例如44A89和46A76來協(xié)助評估;險測環(huán)境和產(chǎn)生的數(shù)據(jù)的可靠性。例如，表9b和9c比較了在2001、2003和2005年，在北達科他力、|和明尼蘇達試驗中的對照品系后代的結(jié)果。這些地方是具有更高病害壓力的地區(qū)，具有痕量水平的病害的年份獲得的數(shù)據(jù)組除外(Bradley,"/.,2006)。在2005年46A76的低水平病害發(fā)病率(NDSU-Carrington)表明環(huán)境條件可使病害得分復雜化，如研究者BobHanson(NDSU)所述。在這種情況下，過度灌溉可導致在早期品系中過度倒伏及在晚期品系中的延遲成熟，這利于晚期成熟品系，例如46A76。表9b和9c表明在NDSU-Carrington2005年收集的數(shù)據(jù)與在相同地方及明尼蘇達州地區(qū)在前兩年獲得的結(jié)果不一致(也參見Bradley,"a/.,2006)。圖2提供了在極端病害壓力和自然田間條件下，春季品系在多個試驗中的數(shù)據(jù)。在4個以上的試驗中收集通常的極端病害壓力田間研究數(shù)據(jù)。自然田間數(shù)據(jù)在3個以上地區(qū)，包括上述北達科他州地區(qū)進行收集(2005數(shù)據(jù))。當除去單個異常試驗時(圖2D和2E),所有被測品系在目標范圍內(nèi)均表現(xiàn)良好，即，在田間相同環(huán)境和病害條件下，SSDI%得分比Pioneer變種46A76的SSDI%得分、Pioneer變種46A65的SSDI%得分，或這兩個變種的平均SSDI。/。得分低600/。。在極端病害壓力田間實一瞼條件下選取并鑒定表示為02SN41269(2個系)、03SN40441和03SN40341的加倍單倍體系(表10b)。加倍單倍體系是通過本領域技術人員所知的方法來產(chǎn)生的，例如可參見Swanson"a/.(1987);Mollers""/.(1994);Hansen"(1996);美國專利6,200,808及加拿大專利2,145,833。這四個加倍單倍體系的SSDI等級在6.6到7.3之間。這與等級為3.8的對照PioneerHi-Bred變種46A76的對比十分鮮明。加倍單倍體系具有與其親本系相似的形態(tài)表型，它們在自然條件下也會表現(xiàn)得更好一些。表10c提供了F3越冬卡諾拉系2005的表現(xiàn)數(shù)據(jù)。該表中的數(shù)據(jù)來源于在Tavistock(Ontario,Canada)進行了三次重復的2005田間試-瞼。使用了極端病害壓力來產(chǎn)生該研究數(shù)據(jù)集。提交物的田間反應優(yōu)于參照Express與Columbus,即便在可導致比預期更高病害壓力的天氣條件下也是如此。在Soest(德國)收集的越冬卡諾拉選擇中的倒伏得分可以對具有良好直立性的抗性品種進行選擇。表11a給出了5個雜合的春季卡諾拉選擇的譜系(02SN41269、03SN40341、03SN40441、04SN41433和04SN41415)及其純合的加倍單倍體后代。由于所有的選擇都是來自單個植抹(來自田間試驗第一年的100-500個種子)，因此需對它們進行進一步的自交并增加其份數(shù)以進行進一步的田間試驗與種子提交。總而言之，如圖1中的柱狀圖所示，基于15年研究(1991到2005)的6年多來(2000-2005)的繁育與選擇工作，得到了改良的春季卡諾拉系。在自然田間條件下，這些品系的平均菌核病發(fā)病率(SSDI%)得分比在田間相同的環(huán)境與病害條件下的PioneerHi-Bred變種46A76的SSDr/。得分、或PioneerHi-Bred變種46A65的SSDr/。得分、或者這兩個變種平均SSDr/"尋分低約60%。表9所示的是在田間PioneerHi-Bred變種46A76是不易感染的卡諾拉參照之一(在SSDI分級中為3級，而絕大多數(shù)流通的卡諾拉產(chǎn)品是1或2級)，代表了一個非常有挑戰(zhàn)性的可與新品種進行比較的目標。此外，LanceTM或EnduraTM被認為是市場上最為有效的殺真菌劑。最不易感染的卡諾拉參照與最有效的殺真菌劑的組合使得柱型非常高。從圖1中的柱狀圖可看出，種群T循環(huán)10的SSDI模式為7.5,其中某些個體的等級為8或8.5。根據(jù)表4中的分級等級以及圖1中所示的結(jié)果，開發(fā)了SSDI等級為5、6、7或8的品系。將它們歸類為中度抗性(等級為5或6)和抗性(等級為7或8)。<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>表9c.NDSU(Camngton)和明尼蘇達州大學(RedLakeFalls)的2001/2003年*關于卡諾拉變種田間對核盤菌反應(％病害發(fā)病率)的自然數(shù)據(jù)，用相當于46A76的。/。的形式來表示<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>表10a.20(X3-2004資料中極端病害壓力研究數(shù)據(jù)(SSDI)總結(jié)，3個試驗<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>表10b.關于所選取的具有高水平田間抗性的加倍單倍體系及其親本來源(02SN41269、03SN40441和03SN40341)的極端病害壓力田間實驗條件數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>表10c.F3越冬卡諾拉系抗核盤菌的表現(xiàn)(Tavistock,安大略省)及其農(nóng)藝學/品系性狀(Soest,德國)2005<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>表lla.三個春季卡諾拉選擇譜系及其加倍單倍體后代<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>*分離的品種來自單個Sl或F3植抹，在第一年后進行試驗的幾年中有所增加。200680029592.3ils步被51/85M表llb.7個越冬卡諾拉提交物的譜系<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>"寸復雜雜交([CV0242x01CWB940022]x[(00FWB940100x00FWB940919)x01CWB910012]}的Fl后代進行自交，并在溫室內(nèi)選擇針對核盤菌的反應。**在不可重復的田間篩選中，從400個F2系中對核盤菌反應以及品系進行選擇。***在田間試驗中從200個F3系中對核盤菌反應、倒伏性以及品系進行選擇，重復3次。每個F3系均來自單個F2植抹。***在Soest2005用地中F4數(shù)量增加，作為來自單個植抹的F3選擇世代的增加，將其收割用于專利保藏表llc.在越冬卡諾拉中用于核盤菌抗性的復雜雜交的組合物<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>實施例3:卡諾拉的確認依照加拿大卡諾拉理事會，卡諾拉是通過以下特征來進行定義的油類必須含有低于2%的芥酸、并且種子的固體組分中每克風干的不含油的固體中所含的的3-丁烯基的芥子油苷、4-戊烯基芥子油苷、2-羥基3-丁烯基芥子油普和2-羥基4-戊烯基芥子油苷中的任何一種或者任意的混合物必須低于30微摩爾。測定芥酸水平及芥子油苷的含量，以確認由種群T所產(chǎn)生的種子符合卡諾拉的定義。如下所述，通過全種子脂肪酸圖語來測定芥酸水平，通過掃描NIR測定芥子油苷的水平脂肪酸含量測定成熟完整干種子的內(nèi)源生成油類中所存在的脂肪酸的典型的重量百分比。在測定時，將種子碾碎，并在與甲醇和甲醇鈉反應后提取脂肪酸曱基酯。然后通過氣液色譜，用根據(jù)不飽和程度和脂肪酸鏈長度進行分離的毛細管柱分析得到的酯的脂肪酸含量。在J.K.Daun^a/.(1983)的工作中描述了該流程，本文通過參考整合在文中。芥子油苷含量通過AOCS官方方法AK-1-92(通過HPLC測定油菜籽的芥子油苷含量)所測定在8.5%濕度時的種子中總芥子油苦是以每克微摩爾來表示的。在最優(yōu)條件下提取并純化二芥子油普的三甲基色氨酸衍生物以獲得最優(yōu)吲哚芥子油苷檢測的毛細管氣相色譜描述在中?？ㄖZ拉也必須滿足農(nóng)藝學上生長季節(jié)的需求。對春季卡諾拉，達到50%開花的平均天數(shù)典型地為30-90天(表1)。為了控制任何一年中或任何一個田間的生長條件，將開花的天數(shù)與培育在相同田間和相同條件下的官方參照變種進行了比較。表12總結(jié)了與官方WCC/RRCG2脂/a/jR"尸wee(iQwc/zt/a/eCw/"v<ars,力Qmat/a)參照變種46A65和Q2相比較，芥子油苷、芥酸、50%開花的天數(shù)和成熟試驗的天數(shù)的結(jié)果。從表12可看出，由種群T產(chǎn)生的植林與參照是相當?shù)?，符合春季卡諾拉的定義。由于環(huán)境差異，發(fā)生了處于可接受范圍內(nèi)的變異。表12.卡諾拉品系/春季環(huán)境-芥酸(C22:l)/芥子油普/開花/成熟<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>表13所示的是為了產(chǎn)品開發(fā)在與敏感的原種品種所進行的雜交中遺傳分離的復雜性。圖1中的有效數(shù)據(jù)所示的是性狀表現(xiàn)，而表13中的分離數(shù)據(jù)所示的是部分抗性系的低回復性。這表明增加的遺傳組分可導致復雜的分離。據(jù)估計在這些品種中有3或4個基因提供了部分抗性。需要大量工作才能將這3或4個基因滲入到原種品種中。敏感的原種品種的成分越大，則核盤菌抗性基因的滲入就越困難。例如，將核盤菌抗性基因滲入到含50%敏感原種品種的品種中，要比滲入到含75%敏感原種品種的品種中更為容易?？墒褂脝伪扼w技術以與表10中所示的固定抗性原料相似的方式來固定分離的后代。表13.繁育行為的結(jié)果-在2003和2004年*將部分抗性選擇物與敏感的原種系進行雜交后抗性后代的回復<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>*在不同的年份/計劃中使用了不同的來源**遲滯會顯著夸大選擇物的數(shù)目。同參照相比較，品系更晚開花實施例5:篩選黑脛病抗性黑脛病(jLe/^o^/2(3en'(3W(2cw/(2m、及其它^e/^as*//2"er/a種),也一爾為莖點霉屬莖腐，是一種在國際上很重要的、在歐洲、澳大利亞和北美造成了嚴重的經(jīng)濟損失的蕓莒病害(Fitt"a/.2006)。通過在"/VoceJwmsQmo/aZ/^/^eec/C力c/"/^CwWraraG2朋W中WCC/RRC的程序所概述的方法來從種群T的后代中篩選黑脛病抗性。表14描述了來自西加拿大兩個地點的病害最為惡性的亞種的黑脛病分級。發(fā)現(xiàn)選擇物02SN41269和02SN40441對黑脛病具有高水平的成年植物抗性，其2004年平均等級為8.7,比較而言，敏感參照Westar的等級為5.8(表14)。在2005年收集的數(shù)據(jù)也表明OMN41269和03SN40441的黑脛病抗性優(yōu)于46A76。Tavistock的田間觀察資料(2004和2005)表明越冬品系對黑脛病的抗性與Columbus/Express的抗性類似。表14.在2004/2005年在西加拿大試-瞼品種對黑脛病抗性的反應<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>*1=死亡植物，9=沒有病害癥狀實施例6:溫室和小溫室篩選核盤菌抗性在溫室/小溫室中對篩選核盤菌方法的開發(fā)是一個開發(fā)出核盤菌抗性蕓苔系的重要的成功因素。已經(jīng)公認生成可靠的核盤菌篩選數(shù)據(jù)仍是充滿問題的。開發(fā)了下述方法用于在溫室及小溫室評估對核盤菌莖腐的卡諾拉莖和/或葉反應。該方法用于開發(fā)并篩選實施例1、2、3、4和5中的核盤菌抗性系。盡管所述的方式是針對蕓莒的，應理解對于任意對核盤菌壽丈感的植物，例如大豆或向日葵均可使用。一放#核盤菌與環(huán)境及植物相作用，病害發(fā)展會反應出相互作用的所有方面。為了在繁育出核盤菌抗性中獲得最精確的結(jié)果，在(l)植物品種(生長階段、莖或葉大學、接菌位點)、(2)接菌及(3)環(huán)境(潮濕箱、小溫室或分隔間)上必須達到最大的一致性。這是收集可靠數(shù)據(jù)的必要條件。淑麻潛紹可使用PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂)來繁殖核盤菌。培養(yǎng)基營養(yǎng)富集，可使真菌快速生長。此外，可通過PDA來感染植物組織。因此，PDA非常適于初次轉(zhuǎn)移，并適于需要施加更高或更快的感染壓力的情況，譬如在非常晚的生長階段或者品種需要較短周轉(zhuǎn)時間的時候。對于更為敏感的試驗，可使用低營養(yǎng)PDA。減緩了菌絲生長及感染過程，植物品種可有更好的機會來表達其典型反應。此外，可更可靠地打斷感染過程，從而使選擇物具有更好的產(chǎn)生種子的機會?？墒褂昧性谙旅娴牟襟E培養(yǎng)基PDA-馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基成分1LPDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂)39g.低營養(yǎng)PDA培養(yǎng)基成分lLPDB(馬鈴薯葡萄糖湯)12g瓊脂(SigmaA-1296)15g1.重新獲得核盤菌分離抹的菌核。2.無菌條件下將菌核切成兩半，并將切面向下置于PDA平皿上。3.在暗處于19。C(+/-3°C)溫育72到90小時，或者直至菌絲接近平皿邊緣為止?？梢岳酶蜏囟葋頊p緩生長(4-16。C)。4.對于在溫室或小溫室的接菌，使用軟木塞打孔器切成直徑約2-4mm的塞狀物。優(yōu)選地，使用來自菌絲外側(cè)一圈的塞狀物，在那里菌絲發(fā)育一致，這樣所有的塞狀物都有相似的年齡及品質(zhì)。差舉#霧^法可在莖延伸至生理成熟，即種子顏色改變后對卡諾拉接菌。在田間，植林在花瓣凋落階段是受影響的。一般來說，早期感染的植林更敏感，而老的植林不太敏感。根據(jù)篩選目標，可在開花前到開花后進行接菌。植抹可在32孔平地或4英寸(及更大的)罐中培育。較大和較強壯的植抹對核盤菌的抗性更大。較小和較弱植抹更敏感。不推薦檢測節(jié)間，但鄰近節(jié)在葉腋上部的點例外，以用于模擬自然感染。在篩選中包括核盤菌敏感和/或部分抗性參照。遂鄉(xiāng)#才法對在潮濕房間內(nèi)檢測的植抹，可使用例如昆蟲針的方法。制備3mm塞狀物(+/-lmm),并用針，例如無銹昆蟲針#1到3#進行檢測。使用針來支撐攜帶有菌絲體的塞狀物附著在莖上。該方法可檢測大量植抹。植枒、可以比4支稀疏，例如在32孔平地上生長。以下列出的步驟包括1.根據(jù)實驗目的，可在莖的單點或多個點進行接菌。2.將植抹在潮濕房間或潮濕環(huán)境中放置20到60小時，或直到癥狀開始發(fā)展。觀察敏感和/或部分抗性參照的反應。根據(jù)篩選目標，除去接菌物(限定的術語為接菌)，而且當新鮮傷口長度在多數(shù)敏感和/或部分抗性參照中至少為5-30mm時，停止在潮濕環(huán)境的培養(yǎng)。傷口長度是最可靠的參數(shù)?？稍诜块g中接種后立刻進行最初的篩選，最初的反應是關于表現(xiàn)的良好指示。3.將植林移植到溫室/培養(yǎng)間的苗床上，在所需處接菌后，記錄傷口長度生長階段。確保植株不干燥。如果需要，可在接種前記錄生長階段。4.比較所需目標和參照或比較鄰近植林的表現(xiàn)而進行篩選。5.如果實驗目的需要，在達到滿意的差異后或在1和2周后，測定傷口長度和病害嚴重性等級(1-9)。這可根據(jù)病害在植抹中的發(fā)展過程而改變。對病害嚴重性等級，需考慮傷口長度、莖直立性和環(huán)剝程度。6.當在夏季月份溫室溫度升高時，避免進行接種實驗。如果需要，可在培養(yǎng)間，優(yōu)選地空氣濕度增加的房間進行實驗?？墒褂美ハx針及具有菌絲體的小直徑低營養(yǎng)PDA塞狀物來篩選大量植抹，并可在單個植抹上進行多次接菌，以-驗證反應。這在向田間篩選和推進最有抗性的后代進行進一步評估是非常重要的。裙產(chǎn)霧爭i^標X(室內(nèi)SSDS-室內(nèi)菌核病嚴重度)1-早熟或死亡的植株3-大傷口，弱及完全環(huán)剝的莖5-大傷口〉30mm,直立，幾乎環(huán)剝的莖7-小傷口〈30mm，直立，無環(huán)剝的莖9-無損傷如果癥狀嚴重度在所定義的分數(shù)之間，則可指定為中間分數(shù)。在感染后，可使用不潮濕的，通氣好的環(huán)境，以利于感染的開花植株在感染中存活。p,凝霧才法進行葉片接菌，以檢測不同項目在抗性水平上的差異。它是在莖接菌之前更早的生長階段譬如抽苔之前進行的，以對部分抗性進行早期檢測。不過，葉篩選通常在開花時進行，可在田間對全體植物考察時進行。由于葉子比莖對核盤菌更為敏感，因此除非特別說明，否則使用的都是低營養(yǎng)PDA?？梢杂萌麪钗锘蛘邘в欣ハx針的塞狀物對完整的葉子進行接菌，用于試驗及選才奪目的?？砂凑障铝胁襟E進行1.可在潮濕的溫室內(nèi)進行大規(guī)才莫篩選。溫室內(nèi)濕氣的水平應該充分高，可使得感染發(fā)生，但又不能過高，以免妨礙真菌感染，這一點很重要。2.優(yōu)選地，從覆蓋了相同菌絲的菌落邊界外側(cè)1cm處取下2-4mm的塞狀物，并將塞狀物上部向下置于葉片上面。調(diào)整塞狀物相對于葉片的位置，使得盡可能多的葉片區(qū)域能夠發(fā)生枯斑。3.在塞狀物周圍的枯斑發(fā)育一致之前不必去測定枯斑的直徑。應避免塞狀物沒有與發(fā)育良好的葉片接觸。如果發(fā)生這種情形，將其記做遺漏。在真菌發(fā)展倒敏感參照中葉片組織的有效邊緣之前或者認為適當?shù)臅r候，以毫米為單位來測定葉片枯斑直徑。.4.在塞狀物周圍已形成一致的枯斑后(或者在敏感與抗性參照直接已有很好的差異時)可從潮濕溫室中移走品種，并在適當潮濕條件下保存品種。對相對于參照或附近植株的敏感反應或者中度及敏感反應兩個參數(shù)通過視覺進行選擇。實施例7:在極端病害壓力田間實馬全條件對核盤菌抗性進行田間篩選對于成功開發(fā)抗核盤菌的蕓苔系而言方法學上的改進是至關重要的。已經(jīng)知道在一年生的基礎上生成可靠的田間數(shù)據(jù)并不普遍。核盤菌是一種烈性疾病，但它僅在潮濕的夏季并且溫度適度時才發(fā)生。當核盤菌的條件并不理想時，多年來在田間篩選核盤菌抗性方面很多組織都會變得至關重要。濕度飽和度、水質(zhì)、接菌的有效性、和是否存在潮濕的或濕潤的環(huán)境均影響農(nóng)作物中病害的發(fā)展。盡管所描述的方法是針對蕓苔的，但應理解這些方法可用于任何對經(jīng)由子嚢孢子的核盤菌感染敏感的植物。這包括向日葵(頭腐)、紅花(頭腐)、菜豆(莢腐)、干豌豆(莢腐)、大豆(莖腐及莢腐)、紫花苜蓿(花腐病)、及萵苣(萵苣凋落)。BardinandHuang2001。也可參見針對大豆中核盤菌影響的美國專利申請2003/0150016。田間關鍵問題已按下述方式解決(a)適當?shù)娜斯そ泳糜谶B續(xù)數(shù)據(jù)收集由于并不總是在田間可觸發(fā)天然接菌，因此開發(fā)了通過花瓣來模擬感染的接菌方式。用于真菌的載體可以是定植了核盤菌并將在全部花瓣凋落時進行散播的Niger種子(Guizotiaabyssinica-Nyer種子)。(b)水質(zhì)與核盤菌最初，使用地下水來灌溉移植了核盤菌的田地。不過，在低降雨量及高溫或低溫的年份里觀察到缺乏感染轉(zhuǎn)移。體外試驗已經(jīng)證實了地下水會抑制核盤菌生長。通過實驗室及田間試驗，認為去離子(DI)水處理可改變地下水水質(zhì)，防止其對核盤菌發(fā)展的抑制作用。因此，使用DI水來灌溉極端病害壓力田間研究用地。理論上，處理過的去離子水與最初的地下水的不同之處在于清除了例如鎂與釣(石灰)這樣的礦物質(zhì)，而pH不受影響。核盤菌會產(chǎn)生可散播的毒素——草酸，以協(xié)助感染過程(US6,380,461)。4丐可以與草酸結(jié)合生成草酸4丐。在去離子水中除去了4丐很可能造成了水質(zhì)改變，可使得核盤菌生長。因此，可使用低礦物質(zhì)或者無礦物質(zhì)的水源，例如降低或者除去鎂與釣的水源。(c)通過葉濕潤傳感器進行灌溉為了在田間保持持續(xù)的濕潤，使用了僅在濕度低于預設閾值時候才會觸發(fā)灌溉的葉濕潤傳感器(CampbellScientific)。理想的灌溉可以促進病害發(fā)展并增強對病害抗性的篩選。但過度地灌溉可能會干擾有意義的評估。特別地，在單一基因型彼此鄰近處于一排這樣的研究設置中，某一類型出現(xiàn)倒伏會導致病原體通過植抹對植抹接觸的方式進行轉(zhuǎn)移，并增加了在另一個基因型上病害的發(fā)病率。這樣，對另一個基因型的核盤菌抗性得分就會低估其在更為均一種群中的潛在表現(xiàn)。在自然田間數(shù)據(jù)試驗中，過度灌溉會通過增加某個給定基因型的倒伏而創(chuàng)造一個對核盤菌更有利的環(huán)境。這樣，會由于過度灌溉而曲解試驗項目的表現(xiàn)，例如在2005NDSU試驗中發(fā)生的那樣(參見圖2)。(d)提供圍欄，以幫助維持病害發(fā)展所必需的微環(huán)境為了使得病害可以在干燥、炎熱和/或多風的季節(jié)發(fā)展，使用了網(wǎng)狀圍欄。這些新方法同上述的繁育與雜交努力相關聯(lián)，從而可以對抗核盤菌的卡諾拉系進行精心選擇。新方法可在有利于核盤菌的條件下控制病害發(fā)展、可靠表達表型并鑒定多個不同品系，從而改進圖1中所示的柱狀圖。開發(fā)了下述方法，用于在田間篩選核盤菌抗性。一放#核盤菌與環(huán)境及植物品種相作用。收集的數(shù)據(jù)反應了這種作用的所有方面。為了減少變化，需要在(l)植物品種、(2)接菌及(3)環(huán)境方面有最大的一致性。這是收集可靠數(shù)據(jù)的先決條件。她^^#/試發(fā)設/力z戎舉l.鑒定可以移植核盤菌用作天然補充接菌及人工接菌的地點。如杲該地點沒有核盤菌定植下來，可以嘗試通過感染諸如大豆或白豆這樣的其它宿主來產(chǎn)生核盤菌，用諸如Niger種子這樣的載體來接菌，或者直4妻導入核盤菌。2.如果可能使植物項目位于重復的用地或者行列中。對合適的敏感與/或抗性參照使用隨機化完全區(qū)組設計(RCBD)(RCBD在每個組中均有每種單位的實驗品種(重復))。盡可能使得實驗較小以降低由于環(huán)境變化導致的誤差。應使用連續(xù)參照，表現(xiàn)通過相對于參照的形式來表示。參照的成熟應與檢測系的成熟相一致。3.盡可能地種植密集健康的卡諾拉農(nóng)作物以促進病害發(fā)展。播種率應當一致。精確種植是優(yōu)選的，或者減少植林使植抹數(shù)目一致。為了促進病害發(fā)展，可以考慮在農(nóng)作物周圍或者其上面通過植樹帶或額外的過道和/或安裝網(wǎng)狀物的方式來使用防風墻。核盤菌莖腐的發(fā)展是環(huán)境依賴的，僅有接菌是不夠的，除非在農(nóng)作物中存在有利的潮濕或濕潤的微環(huán)境。感染的相對成功率可通過相對于實驗中敏感參照所受影響的程度來測定。由于自然感染幾乎不可能具有可靠性或一致性，因此使用灌溉系統(tǒng)來促進病害發(fā)展。灌溉可以在農(nóng)作物一產(chǎn)生冠層就開始進行，這樣冠層可保持潮濕。在開花之前，目標是保持表層土的濕潤并達到核盤菌萌發(fā)的條件，從而使得子嚢盤進行發(fā)育，產(chǎn)生可定植在花瓣上的子囊孢子。一旦在花瓣上定植，目標就是在足夠的花瓣凋落后促進病害向葉片及莖上發(fā)展。這種轉(zhuǎn)移在具有延長的潮濕或濕潤狀況的年份里可自然發(fā)生。葉片濕度感應器通過在冠層干燥時觸發(fā)灌溉來調(diào)節(jié)冠層中的濕度。病害的轉(zhuǎn)移可被地下水所抑制(尤其是在更低溫度時)，因此，如果可行，應使用收集的雨水或者去離子地下水。直至敏感參照的莖感染重復發(fā)展之前，豆需要保持冠層的濕度。當環(huán)境對于病害發(fā)展非常重要時，實現(xiàn)病害發(fā)病率及嚴重度同下列因素的時機直接相關有利的環(huán)境、生長階段及接菌壓力?？墒褂镁W(wǎng)狀圍欄來維持潮濕或濕潤條件，使得病害得以發(fā)展。##,務/乂工^染使用人工接菌作為主要接菌，以定點增加病害壓力，并使得病害發(fā)展與極端病害壓力下的相似。在這種情況下自然接菌為補充接菌。為了該目的可使用定植了核盤菌的Niger種子作為載體?？砂聪铝胁襟E進行1.如實施例6所述，制備核盤菌的PDA平亞，于19°C(+/-3°C)溫育3-6天，或者直至菌落接近平皿邊緣。2.將5到6個菌絲塞狀物(直徑2-4mm)置于含按0.5g/1添加了鏈霉素的200ml(+/-100ml)PDB的燒瓶內(nèi)，開始產(chǎn)生新鮮的菌絲體。3.在暗處于搖床上以1.2rpm、19C(+/-3C)溫育2-3天。4.從菌絲群中取走PDB,在攪拌器中使菌絲群均勻化，加入TweenTM(約0.5ml/1)并稀釋到l-3g(最優(yōu)為2g)新鮮菌絲/lL水，用于田間接菌。稱出菌絲體后，可加回PDB。為了使接菌物定植在Niger種子上，可采用下述流程按H20:Niger為1:2的比例將種子高壓滅菌2次。在Niger冷卻后，加入約100ml的PDB:500gNiger并在暗中于室溫下溫育?？梢灾苯邮褂肞DB或者按需要進行稀釋。一旦完成溫育以及真菌接種物在種子上的發(fā)育，干燥接種物并打散種子結(jié)塊。典型地，這需要花費5至15天時間。為了模擬并增強自然感染，可在有效的花瓣凋落期間進行接菌。5.保證在開花前有足夠的Niger接種物。6.在使用前先篩一下定植了核盤菌的Niger種子。可以用手將定植了的種子鋪在植物品種上。對于大規(guī)模接菌，可使用肥料撒施機或其它撒放設備，例如鼓風噴霧器來散播Niger種子。應在每個行列的前面或者后面使用這些設備。7.使用約5-20kg/ha的Niger種子。應確認散播的一致性與質(zhì)量。8.應用Niger的目標是在每個植抹上產(chǎn)生很多可發(fā)展為莖感染的葉片枯斑。9.如果需要，應重復應用定植了核盤菌的Niger種子。分i^一旦在敏感和/或抗性參照上出現(xiàn)了預期的發(fā)病率以及癥狀擴展到莖部，便可對感染植林的百分比及病害嚴重度進行分級(表2和15)。當有了預期的分化時，推薦進行分級。后續(xù)分級的可靠性降低，因為其結(jié)果會受到在初次分級期間的冠層及群落地段物理效應的影響。相對于癥狀在受影響植物的產(chǎn)量上的作用來調(diào)整分級。例如，在較低莖部的環(huán)狀剝皮要比在較高莖部的環(huán)剝對產(chǎn)量有更大影響。影響側(cè)總狀花序會降低只是在該總狀花序上的莢的產(chǎn)量，而影響主總狀花序會影響整個植林上的莢。這可通過SSDS得分反映出來；參見表15。每行或每塊用地上分級植抹的數(shù)目及位置可通過相對于實驗中該植物以及病害的發(fā)展來確定。在橫排或者用地中間，病害壓力趨于最大一致。在計數(shù)中應排除非典型的及小的植抹，優(yōu)選地，在計數(shù)前或者計數(shù)時應將其從橫排中排除。在時節(jié)早期進行疏苗可以解決這個問題。如果可能，出界植抹不應被分級。為了能夠?qū)ζ贩N進行可行的比較，并說明環(huán)境變化，試驗應包括諸如46A65和46A76這樣的連續(xù)參照。表15.對田間-PioneerSSDS田間-菌核病嚴重度-田間方面單個植林的癥狀嚴重度進行記分的指導方針。括號中的數(shù)字是指公共等級。<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>實施例6和7中的方法需要重要的人類技術干預，用于開發(fā)本發(fā)明的核盤菌抗性系中。重要的人類技術干預可以進行全年的選擇試驗，并提供一致的且可重復的結(jié)果。此外，實施例7中的方法不管自然環(huán)境如何均可在每一年都產(chǎn)生極端病害條件。實施例8:產(chǎn)生對核盤菌具有抗性的近交系表13略述了在開發(fā)近交系中的工作，并在在2003和2004年成功開發(fā)了原種近交系。其性狀是綜合的，包含了來自2003/2004年試驗的原種雜交品種中的約3-4個基因。由于種群T中的品種屬于卡諾拉品系(表12),因此在表13中略述的不同方法都可使用。在原種近交系承擔了50%遺傳的直接雜交中(F2),性狀回復(即核盤菌抗性)是可行的?？剐詠碓粗杏蠦C1可使性狀回復更加容易，但危害是降低了原種近交系遺傳背景的比例。如果首要目標是恢復抗性，而不怎么考慮其它繁育結(jié)果，例如品系、雜種優(yōu)勢等，則可通過繁育BC2來完全回復抗性，或者利用抗性背景使其更高。將BC1引入敏感原種的目的是回復原種背景(75%)與核盤菌抗性性狀，但核盤菌抗性性狀的回復會變得更加復雜。一旦回復了具有田間抗性的原種系，就可以使用新的育種方法，其中抗性回復會變得更為可行(例如，田間抗性原種與田間抗性原種雜交)。在這類雜交中回復抗性相對簡單，并可用Fl品種進行加倍單倍體化，并且抗性后代在遺傳上是穩(wěn)定的——即固定了，可產(chǎn)生重復的且可預期的應答。實施例9:產(chǎn)生對核盤菌具有抗性的雜種由于實際情況是部分抗性并非是顯性的，所以對于涉及雜種種子生產(chǎn)的父系與母系近交系而言均有必要具有抗性。因此，田間抗性近交系一定是從父系及母系遺傳素材庫中開發(fā)的。已知雜種農(nóng)作物由于存在基于雜種中父系與母系組分遺傳距離的雜種優(yōu)勢，因此相比其先天組分具有更高產(chǎn)量，通過將充分建立起來的敏感父系及母系近交系(表13)與具有本發(fā)明中的核盤菌抗性系進行雜交，回復了具有多種原種背景與抗性背景組合(例如如表13中所示的25-75%原種背景)的有田間抗性的原種系。這種新開發(fā)的父系及母系近交系同時具有田間抗性以及先前在其原種而不是敏感親本中所確定的遺傳距離。與正規(guī)雜交育種類似，隨后進行了廣泛的田間試驗以確定哪一種近交組合可提供高產(chǎn)量并對核盤菌提供足夠水平的田間抗性。一旦鑒定出很多可產(chǎn)生具有高產(chǎn)量以及對核盤菌有田間抗性的雜種的原種父系與母系，可通過將這些品系與開發(fā)中的可進一步提高產(chǎn)量以及對核盤菌的田間抗性的近交系來進行雜交，以獲得更多進展。因此，本發(fā)明不但包括那些在本文中特別描述過的品系，還包括其任何后裔或后代，尤其是通過選取加倍單倍體系所產(chǎn)生的具有核盤菌抗性性狀的后代。本發(fā)明還包括任何使用本文中所描述的品系所產(chǎn)生的雜種。此外，本發(fā)明包括來源于改良的植物、品系或后代的種子、植物細胞及包括花粉與胚珠在內(nèi)的細胞素材。植物細胞可以按照本領域技術人員所知的方法從植物上進行分離。例如，參見ChuongW"/.,(1985);Barsby,T丄.，w"/.,(Spring1996);Kartha,JC.Wa/.,(1974);Narasimhulu,S.,"a/.,(Spring1988);andSwanson,E.,(1990)?？砂凑毡绢I域技術人員已知的方法，使用本發(fā)明中的植物來栽培農(nóng)作物。此外，可使用本發(fā)明中的植物來進行油類與膳食的生產(chǎn)?？砂凑毡绢I域技術人員已知的方法，使用本發(fā)明中的植物種子來生產(chǎn)卡諾拉油。該方法包括碾碎種子，從種子中提取原油，并對所述原油進行精煉、脫色及除臭，以產(chǎn)生卡諾拉油?？砂凑毡绢I域技術人員已知的方法來生產(chǎn)卡諾拉膳食。因此，本發(fā)明也包括碾碎來自本發(fā)明中的植物的種子。最后，可按照本領域技術人員已知的方法，使用本發(fā)明中的植物來進行育種，尤其是下述的實施例。V.本發(fā)明的進一步的實施方案實施例8和9中的自交和雜交系可用本領域:技術人員已知的如上和如下所述的植物育種方法獲得。除了開發(fā)自交和雜交系，本發(fā)明也指導用本發(fā)明的抗核盤菌系來滿足其它植物育種目的的方法。該方法的一個實施方案是將本發(fā)明的核盤菌抗性系與其它卡諾拉植林雜交，以形成第一代F1植物種群。由本方法產(chǎn)生的第一代F1植物種群也是本發(fā)明的一個實施方案。該第一代F1植物種群含有本發(fā)明的必需的完整的核盤菌抗性系等位基因。典型地，在本領域中，F(xiàn)l雜合子被認為具有每個純合親本的所有等位基因。本領域普通技術人員可通過生的Fl植抹，任何這種單個植抹也包括在本發(fā)明中。這些實施方案也包括對本發(fā)明核盤菌抗性系使用了轉(zhuǎn)基因或單基因轉(zhuǎn)換的這些方法的用途。本發(fā)明的另一個實施方案是在育種中使用本發(fā)明的核盤菌抗性系的方法，它涉及與本發(fā)明的核盤菌抗性系進行任意次數(shù)的重復回交。通過回交方法，或此處所述的轉(zhuǎn)基因方法，此處所述的單基因轉(zhuǎn)換方法，或其它本領域普通技術人員已知的育種方法，可開發(fā)至少保留25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%本發(fā)明中核盤菌抗性系的遺傳譜的單個植抹和植物種群。在后代中保留的遺傳圖語的百分比可通過鐠系分析或通過基因技術，例如分子標記或電泳進行測定。在諳系分析中，平均約50%的起始種質(zhì)在與另一個品系雜交后可傳遞到后代品系中，與不同品系再次雜交后約25%可被傳遞，等等。分子標記也可用于驗證和/或測定后代系的譜系。下面是產(chǎn)生來源于本發(fā)明的核盤菌抗性系的品系的特定方法。本領域普通技術人員可將本發(fā)明的核盤菌抗性系與另一種卡諾拉植林，例如原種系雜交。來源于該雜交的Fl種子含有單拷貝100%來源于本發(fā)明的核盤菌抗性系的等位基因和單拷貝100%其它植抹的等位基因。培養(yǎng)F1種子，以形成純合種群，并進行自交，從而得到F2種子。F2種子平均具有50%來自本發(fā)明的核盤菌抗性系和50%來自其它卡諾拉植株的等位基因，但來自種群的多個個體植抹其更大比例的等位基因是來自本發(fā)明的核盤菌4元寸生系(WangJ.andR.Bernardo,2000andBernardo,R.andA丄.Kahler,2001)。培養(yǎng)F2種子，并根據(jù)纟見覺觀測和/或性狀測定來進行植林的篩選。用于篩選的性狀可以是與本發(fā)明的核盤菌抗性系相關的性狀。篩選具有所需的本發(fā)明的核盤菌抗性系的性狀的衍生后代，并對每個植抹單獨進行收獲。將來自每個植株的F3種子在單獨的行進行培養(yǎng)，并允許自交。然后收獲所選擇的行或來自這些行的植株，并分別脫粒。再次根據(jù)視覺觀測和/或植抹所需性狀的測定來進行篩選。重復多次進行培養(yǎng)和篩選過程，直到獲得本發(fā)明中的核盤菌抗性系的自交系。本發(fā)明的核盤菌抗性系的自交系將具有核盤菌抗性性狀。如果與核盤菌抗性系雜交的其它卡諾拉植抹也含有核盤菌抗性基因，則從后代發(fā)育的自交系具有等于或高于在本發(fā)明的核盤菌抗性系中的表達水平的核盤菌抗性水平。自交系平均50%的基因來自本發(fā)明的核盤菌抗性系，但來自種群的多種個體植抹其更大比例的等位基因是來自本發(fā)明的核盤菌抗性系。雜交、自交和篩選的繁育過程可重復進行，以產(chǎn)生另一個本發(fā)明的核盤菌抗性系衍生的卡諾拉植抹的種群，其平均25%的基因來自本發(fā)明的核盤菌抗性系，但來自種群的多種個體植抹其更大比例的等位基因是來自本發(fā)明的核盤菌抗性系?？稍诙鄠€方面修改先前的實施例；例如，在每次自交代中可進行或不進行篩選，可在實際自花授粉過程之前或之后進行篩選，或可通過收獲所述育種過程中任何點上對個體的莢、植抹、行、或用地進行單獨篩選。另外，可在流程的任何步驟使用二倍體化單倍體育種方法。在自交的每一代和任何代產(chǎn)生的植物種群也是本發(fā)明的實施方案。本發(fā)明的另一個實施方案是通過將本發(fā)明的核盤菌抗性系與另一個卡諾拉植物雜交，并對通過該雜交的自交所獲得的本發(fā)明的核盤菌抗性系的Fl種子或F2種子或任何后代使用二倍體化單倍體方法，從而獲得純合的核盤菌抗，性系的方法。而且本發(fā)明進一步也指導通過將本發(fā)明的核盤菌抗性系與卡諾拉植抹雜交、培養(yǎng)后代種子，并用本發(fā)明的核盤菌抗性系重復雜交和培養(yǎng)步驟1到2次、1到3次、1到4次或1到5次，并在第一、第二、笫三、第四或第五次雜交后進行任何次數(shù)的自交，從而產(chǎn)生本發(fā)明的核盤菌抗性系的方法。因此，任何和所有用一個或多個本發(fā)明的核盤菌抗性系進行育種的方法都是本發(fā)明的一部分，包括自交、語系繁育、回交、雜合子產(chǎn)生和與種群雜交。所有以一個或多個本發(fā)明的核盤菌抗性系為親本產(chǎn)生的植抹和種群均在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本領域普通技術人員可使用特定的分子錄來鑒定來源于一個或多個本發(fā)明中核盤菌抗性系的后代品系或后代種。所有以一個或多個本發(fā)明的核盤菌抗性系為親本產(chǎn)生的植株均在本發(fā)明的范圍內(nèi)，包括那些從來源于本發(fā)明的核盤菌抗性系的自交系所產(chǎn)生的后代。本發(fā)明的另一個實施方案是本發(fā)明的核盤菌抗性系的單基因轉(zhuǎn)換。當通過傳統(tǒng)的(非轉(zhuǎn)化)育種技術，例如回交引入DNA序列時會發(fā)生DNA序列。通過該過程所轉(zhuǎn)移的所需性狀包括，但不限定于，育性改變、脂肪酸圖譜改變、其它的營養(yǎng)增強、產(chǎn)業(yè)增強、病害抗性、昆蟲抗性、除草劑抗性和產(chǎn)量增強。目的性狀從供體親本轉(zhuǎn)移到循環(huán)親本，在這種情況下，卡諾拉植抹也包括在內(nèi)。單基因性狀從顯性等位基因或隱性等位基因的轉(zhuǎn)移而獲得。可通過直接篩選與顯性等位基因相關的性狀來進行含目的性狀的后代的篩選。對通過隱性等位基因轉(zhuǎn)移的性狀的后代篩選需要培養(yǎng)和自交第一次回交，以測定哪個植林攜帶隱性等位基因。隱性性狀需要在連續(xù)回交世代中進行另外的后代檢測，以測定目的基因的存在。在篩選目的性狀時，根據(jù)循環(huán)親本的表型篩選后代。應理解，偶爾另外的多核苷酸序列或基因可與目的單基因轉(zhuǎn)換性狀一起被轉(zhuǎn)移。所含有來自本發(fā)明所示的卡諾拉植抹輪回親本中至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%基因的后代，加上含有單基因轉(zhuǎn)換性狀的后代，被認為是本發(fā)明的核盤菌抗性系的單基因轉(zhuǎn)換。應理解本發(fā)明的核盤菌抗性系可通過常規(guī)的胞質(zhì)基因、核基因或其它因子的操作而在上述參考文獻中所述的雄性不育形式中產(chǎn)生。這種實施方案也在本權利要求的范圍內(nèi)。本發(fā)明的核盤菌抗性系可通過本領域已知的各種方法，包括使用機械方法、化學方法、自體不兼容、胞質(zhì)雄性不育(甘藍或其它系統(tǒng))或核雄性不育來制備為雄性不育。術語"制備為雄性不育"是指用任何可用技術產(chǎn)生本發(fā)明中核盤菌抗性系的雄性不育系。雄性不育可以是部分或完全雄性不育。該發(fā)明也針對使用本發(fā)明的核盤菌抗性系所產(chǎn)生的Fl雜合種子及植抹。本發(fā)明也針對在組織培養(yǎng)中使用本發(fā)明的核盤菌抗性系。此處所用術語植物細胞包括來自可再生卡諾拉植林、植物愈傷組織、植物叢植的植物原生質(zhì)體、植物穗、長角果、葉片、莖、根、根尖、花藥、子葉等這樣的植物或植物部分中完整的植物細胞。已成功進行了卡諾拉植林再生的組織培養(yǎng)和微孢子培養(yǎng)(Chuong1985);Barsby,T丄.，efSpring1996);Kartha,K."(1974);Narasimhulu,S.,""/.,(Spring1988);Swanson,E.,(1990)。因此，從文獻中可得知本領域的情況是這些獲得植林的方法從其可常規(guī)使用并具有很高成功率的意義上而言，是并且曾經(jīng)是"傳統(tǒng)的"。本發(fā)明中核盤菌抗性系的用途也延伸到了與其它物種雜交。通常，合適的物種是蕓苔科。特別是，在育種工程中可用核盤菌抗性越冬品系作為春季或半越冬品系的來源。在育種工程中，核盤菌抗性春季品系可作為半越冬或越冬品系的來源。所有這些用途也是本發(fā)明的一部分。新的分子生物學技術的出現(xiàn)可以分離和檢測諸如編碼特定代表產(chǎn)物這樣的具有特定功能的遺傳元件。植物學領域的科學家對改造植物基因組產(chǎn)生強烈興趣，使其含有和表達外源遺傳元件，或另外的或修飾的天然或內(nèi)源遺傳元件，從而以特定方式改變植物的性狀。任何通過轉(zhuǎn)化插入到物種基因組中的DNA序列，無論是來自不同物種或相同物種，都統(tǒng)稱為"轉(zhuǎn)基因"。"轉(zhuǎn)化"過程是將DNA插入到基因組中。在過去的15到20年，已開發(fā)出幾種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，本發(fā)明在特定的實施方案中，也與本發(fā)明的核盤菌抗性系的轉(zhuǎn)化形式相關。已開發(fā)了多種植物轉(zhuǎn)化方法，包括生物和物理的植物轉(zhuǎn)化流程。參見，例如MikiWa/.(1988)。另外，也可4吏用表達載體和體外培養(yǎng)植物細胞或組織轉(zhuǎn)化。參見，例如Evans"(1983),Binding(1985)和Weissbach"a/.,1988。最常用的植物轉(zhuǎn)化類型包括構建表達載體。這種載體包括含有位于諸如啟動子這樣的調(diào)控元件控制下、或與調(diào)控元件可操作連接的基因的DNA序列。載體可含有一個或多個調(diào)控元件。可用植物育種領域周知的傳統(tǒng)育種技術，將通過轉(zhuǎn)化技術在特定的卡諾拉植株中構建遺傳性狀轉(zhuǎn)移到另一個品系中。例如，可使用回交方法將轉(zhuǎn)基因從轉(zhuǎn)化的卡諾拉植抹轉(zhuǎn)移到原種自交系，則得到的后代含有轉(zhuǎn)基因。而且，如果用自交系進行轉(zhuǎn)化，則轉(zhuǎn)基因植抹可與不同的品系雜交，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雜合卡諾拉植抹。此處所用"雜交"根據(jù)上下文是指簡單的X被Y雜交，或回交過程。可通過轉(zhuǎn)化向植物基因組中引入各種遺傳元件。這些元件包括但不限定于基因；編碼序列；誘導型、組成型和組織特異性啟動子；增強序列；和信號及定位序列。參見美國專利6,222，101，此處通過參考整合在文中。根據(jù)本發(fā)明用轉(zhuǎn)基因植物可產(chǎn)生具有商業(yè)化品質(zhì)的外源蛋白。因此，本領域周知的轉(zhuǎn)化植物的篩選和繁殖技術可產(chǎn)生大量的以傳統(tǒng)方式進行收獲的轉(zhuǎn)基因植物，從而可從目標組織或從總生物量提取外源蛋白。可通過例如HeneyandOrr(1981)所述的已知方法/人;f直物生物量中進行蛋白提取?？赏ㄟ^鑒定所整合的用于編碼外源蛋白的DNA分子在染色體上的合適位置的傳統(tǒng)的限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、聚合酶鏈反應(PCR)分析和簡單序列重復(SSR)來構建基因圖語。在這方面的示例方法參見GlickandThompson(1993)。關于染色體位置的圖譜信息可用于對目標轉(zhuǎn)基因植物進行產(chǎn)權保護。如果進行了未授權的培育及與其它種系雜交，則可將整合區(qū)域的圖譜與目標植物的相似圖譜進行比較，以測定是否后者具有與目標植物共同的來源。圖i普比較包括雜交、RFLP、PCR、SSR和測序，這些方法都是傳統(tǒng):t支術。同樣，根據(jù)本發(fā)明，可構建表達各種農(nóng)藝學目的的表型的植物。在這方面所使用的轉(zhuǎn)基因示例包括但不限定于以下那些類別。l.賦予對害蟲或病害抗性的基因，它編碼(A)植物病害抗性基因。植物防御通常由植物的病害抗性基因(R)產(chǎn)物與病原體對應的無毒(Avr)基因產(chǎn)物的特定相互作用而激活。可用克隆的抗性基因轉(zhuǎn)化植物變異體，從而構建出對特定病原體具有抗性的才直才朱。參見，例如Jones"a/.,(1993);Mindrmos"a/。(B)對真菌病原體賦予抗性的蛋白，例如草酸氧化酶或草酸脫羧酶(Zhou"(1998),US3,303,846andUS6,297,425)。(C)蘇云金芽孢桿菌蛋白，其衍生物或以其微模板合成的多肽。參見，例如Geiser"H986),描述了價5內(nèi)毒素基因的克隆和核苷酸序列。另外，可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Manassas,VA)購買例如ATCC登錄號40098、67136、31995和31998的編碼5內(nèi)毒素基因的DNA分子，。(D)凝集素。參見，例如VanDamme"a/.,0994)描述了幾種君子蘭甘露糖結(jié)合凝集素基因的核苷酸序列。(E)維生素結(jié)合蛋白，例如親和素。參見PCT申請US93/06487,其內(nèi)容通過參考整合在文中。其應用包括親和素及親和素同源物作為抗昆蟲害蟲的殺幼蟲劑。(F)酶抑制劑，例如，蛋白酶或蛋白酶抑制劑或淀粉酶抑制劑。參見，例如Abe^a/.,H987)(鼠半胱氨酸蛋白酶抑制劑的核苷酸序列)、HuubWH993)(編碼煙草蛋白酶抑制劑I的cDNA的核苷酸序列)、Sumitanie/a/.,(1993)(硝孢鏈霉菌a-淀粉酶抑制劑的核苷酸序列)和美國專利5,494,813(HepherandAtkinson,1996年2月27曰授權)。(G)昆蟲特異的激素或外激素，例如蛻皮激素和保幼激素，其變異體、基于其的模擬物、或其拮抗劑或竟爭劑。參見，例如，//"mmocA:(1990)描述了克隆的保幼激素酯酶的桿狀病毒表達，及保幼激素的失活。(H)表達后可破壞所影響的害蟲的生理功能的昆蟲特異性肽或神經(jīng)肽。例如，參見Regan,./.(1994)的描述(表達產(chǎn)生編碼昆蟲利尿激素受體的DNA的克隆)，及Pmtt""/.,H989)(在Z),p/o/^era/柳toto中鑒定出allostatm」。也參見美國專利5,266,317及Tomalski"，描述了編碼昆蟲特異的麻痹神經(jīng)毒素的基因。(I)由自然界中蛇、蜂等產(chǎn)生的昆蟲特異的毒液。例如，參見Pang"a/.,(1992)，描述了在植物中編碼蝎昆蟲毒素肽的基因的異源表達。(J)負責高積累具有殺蟲活性的單萜、倍半萜、類固醇、異羥肟酸、aphenylpropanoid衫亍生物或其它非蛋白分子的酵。(K)參與生物活性分子修飾，包括翻譯后修飾的酶，例如，天然或合成的糖酵酶、蛋白水解酶、脂肪水解酶、核酸酶、環(huán)化酶、轉(zhuǎn)氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合酶、彈性蛋白酶、幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶。參見PCT申請WO93/02197，由Scottet"/.描述了葡聚糖酶基因的核苷酸序列。例如，可從ATCC登錄號39637和67152獲得含幾丁質(zhì)酶編碼序列的DNA分子。也參見Kmmere,"/.，H993),描述了編碼煙草鉤蟲幾丁質(zhì)酶cDNA的核苷酸序列，和KawalleckWa/.，H993),提供了歐芽w/h4-2多聚泛肽基因的核苷酸序列。(L)刺激信號傳導的分子。例如，參見Botellaw"/.,H994)，描述了綠豆釣調(diào)素cDNA克隆的核苷酸序列，及Griess"a/""994),提供了玉米釣調(diào)素cDNA克隆的核苷酸序列。(M)疏水鉅肽(hydrophobicmomentp印tide)。參見PCT申請W095/16776(描述了抑制真菌植物病原體的抗菌肽衍生物)及PCT申請W095/18855(描述了賦予病害抗性的合成抗微生物肽)，其相關內(nèi)容通過參考整合在文中。(N)膜透性酶、通道形成體或通道阻斷劑。例如，參見Jayneseta/.，H993)描述了抗菌肽-P裂解肽類似物的異源表達，以使轉(zhuǎn)基因煙草植株對茄假單胞菌有抗性。(0)病毒侵入蛋白或其衍生的復合物毒素。例如，病毒外殼蛋白在轉(zhuǎn)化植物細胞中的積累可對由外殼蛋白基因來源的病毒及相關病毒造成的病毒感染和/或病害發(fā)展具有抗性。參見BeachyWa/.，O990)。外殼蛋白介導的抗性已賦予轉(zhuǎn)化的植物具有抗紫花苜?；ㄈ~病毒、黃瓜花葉病毒、煙草條紋病毒、馬鈴薯病毒X、馬鈴薯病毒Y、煙草蝕刻病毒、煙草脆裂病毒和煙草花葉病毒的抗性。(P)昆蟲特異的抗體或其衍生的免疫毒素。這樣，針對昆蟲腸道中關鍵代謝功能的抗體可使受影響的酶失活，從而殺死昆蟲。C/Taylor"a/.，H994)(通過產(chǎn)生單鏈抗體片段在轉(zhuǎn)基因煙草中的酶學失活).。(Q)病毒特異性抗體。參見，例如Tavladomki"a/.,0993),描述了表達重組抗體基因的轉(zhuǎn)基因植物可防御病毒的攻擊。(R)自然界中由病原體或寄生蟲產(chǎn)生的發(fā)育停止蛋白。這樣真菌內(nèi)源a-l,4-D-多聚半乳糖醛酸酶利于真菌定植，通過溶解植物細胞壁的同-a-l,4-D-半乳糖醛酶而釋放植物的營養(yǎng)。參見Lamb"a/.,H992)。ToubartWa/.,0992)描述了編碼大豆內(nèi)源多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的基因的克隆和鑒定。(S)自然界中由植物產(chǎn)生的發(fā)育停止蛋白。例如Logemann"W.，廣1992)描述了表達大麥核糖體失活基因的轉(zhuǎn)基因植物對真菌病害的抗'性i曾力口。(T)參與系統(tǒng)性獲得性抗性(SAR)應答的基因產(chǎn)物和/或病原體相關基因產(chǎn)物。Briggs,S.(1995)。(U)抗真菌基因產(chǎn)物(CornelissenandMelchers,(1993)andParijs(1991)andBushnellWa/.,(1998))。2.賦予對除草劑抗性的基因，例如(A)抑制生長點或分生組織的除草劑，例如咪唑啉酮或磺酰脲。這種示例基因編碼如Leee/a/.,H988)和MikiW"/.,H990)分別所述的突變ALS和AHAS酶。(B)抗草甘膦(分別由突變的5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSP)和wov4基因賦予抗性)和其它磷基化合物，例如草銨膦(草胺膦乙酰轉(zhuǎn)移酶PAT)和吸水鏈霉菌草胺膦乙酰轉(zhuǎn)移酶6w基因)，及氧化吡啶(pyndinoxy)或苯氧基丙酸和cycloshexones(ACCase抑制劑編碼基因)。參見，例如美國專利4,940,835,ShahW"/.描述了賦予草甘磷抗性的EPSP形式的核普酸序列。可從ATCC登錄號39256獲得編碼突變的araA基因的DNA分子，突變基因的核苷酸序列描述在Comai的美國專利4,769,061中。KumadaWa/.歐洲專利申請0333033和Goodman"a/.美國專利4,975,374,描述了賦予對除草劑例如L-草胺膦抗性的谷氨酸合成酶基因。草胺膦乙酰轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列描述在LeemansWa/.,。989)歐洲專利申請0242246,可產(chǎn)生表達編碼草胺膦乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的模擬6"r基因的轉(zhuǎn)基因植物。賦予對苯氧基丙酸和cycloshexones,例如稀禾定和氟吡曱禾靈抗性的示例基因是Marshallwa/.,"992)所述的爿cc7-^S7、爿^/-5^和/4^'/-53基因。(C)抑制磷酸合成的除草劑，例如三。秦(/w/M和w+基因)和苯基氰(腈水解酶基因)。Przibilla"a/.,)描述了用編碼突變，Z^4基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化衣藻。腈水解酶基因的核苷酸序列描述在Stalker美國專利No.4,810,648,含這些基因的DNA分子可在ATCC登錄號53435、67441和67442獲得。編碼谷光甘肽S轉(zhuǎn)移酶的DNA的克隆和表達描述在HayesWa/.，(1992)中。3.賦予或產(chǎn)生附加性狀的基因，例如(A)改變脂肪酸代謝，例如，用硬脂酰ACP脫飽和酶的反義基因轉(zhuǎn)化植物，以增加植物中硬脂酸含量。參見KnultzonWa/.，0992)。(B)降低的植酸含量(1)引入編碼植酸酶的基因可在轉(zhuǎn)化的植林中增強植酸的降解，增加更多的自由磷酸。例如，參見VanHartingsveldt(1993),描述了黑曲霉植酸酶基因的核苷酸序列。(2)引入可降低植酸含量的基因。例如，在玉米中，可通過克隆并再引入與負責以低水平植酸為特征的玉米突變抹的單個等位基因相關的DNA。參見Raboy"W.O990)。(C)例如，通過用編碼改變淀粉分枝模式的酶的基因轉(zhuǎn)化植物而改變碳水化合物的組成。參見ShirozaWa/.，H988)(變形鏈球菌果糖基轉(zhuǎn)移酶基因的核苷酸序列)、Steinmetz""/.，「1985)(枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因的核苦酸序列)、Pen""/.,H992)(產(chǎn)生可表達地衣芽孢桿菌a-淀粉酶的轉(zhuǎn)基因植物)、ElliotWa/.，H993)(番茄轉(zhuǎn)化酶基因的核苷酸序列)、Sogaarda/.,(1993)(大麥a-淀粉酶基因的定點突變)和Fisher"a/.,"993)(玉米胚乳淀粉分枝酶II)。(D)還原的綠色種子，通過在卡諾拉種子中下調(diào)CAB基因而產(chǎn)生(Morisette1997)。(E)通過FAD-2基因修飾提高油酸和/或通過FAD-3基因修飾而降低亞油酸(參見美國專利6,063,947;6,323,392和WO93/11245)。4.控制授粉或雜合種子產(chǎn)生的基因;例如，加拿大專利2,087,703。工業(yè)應用性本發(fā)明中核盤菌抗性系的種子、由這類種子所產(chǎn)生的植抹、由本發(fā)明中核盤菌抗性系雜交所產(chǎn)生的雜種卡諾拉植林、所獲得的雜種種子、以及雜種卡諾拉植抹的不同部位均可根據(jù)已知技術用于生產(chǎn)可食用的蔬菜油或其它食物產(chǎn)品。例如，生產(chǎn)卡諾拉油的方法可包括(a)碾碎卡諾拉種子；(b)提取原油；及(c)對所述原油進行精煉、脫色及除臭，以產(chǎn)生卡諾拉油。殘余的來自這些種子的固體食物成分可用作營養(yǎng)家畜伺料。VI.保藏已經(jīng)由美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC),馬納薩斯，弗吉尼亞州20852對某些種子進行了保藏，保藏物包括來自02SN41269(F4)、PTA-6777;04DHS12921(加倍單倍體)、PTA-6781;03SN40341(F4)、PTA-6776;04DHS11319(加倍單倍體)、PTA-6780;03SN40441(F4)、PTA國6779;04DHS11418(加倍單倍體)、PTA-6778中的每一個的2500粒種子。自先于本發(fā)明的申請日起，由ATCC保藏的種子就已屬于PioneerHi-BredInternational,Inc.,800CapitalSquare,400LocustStreet,DesMoines，Iowa50309-2340,并由其來保持。保藏物將由作為^^共保藏中心的ATCC保藏中心保持30年、或者在最近申請后保持5年、或者在專利的有限期之內(nèi)都保持一_擇其長者，如果保藏物在此期間內(nèi)無法存活可以進行替換。此外，申請人滿足37C.F.R.Sections1.801-1.809的所有要求。申請人對來自ATCC的保藏品種的有效性方面沒有強加任何限制；不過，申請人無權放棄法律所規(guī)定的有關轉(zhuǎn)移生物品種或其商業(yè)運輸上的限制。對本專利所賦予的權利的侵權行為，申請人不會放棄追究。在本申請的未決期間，對于專利與商標官員以及該官員確認為有資格去處理申請的人員，可以接觸這些保藏物。對本專利和/或植物品種保護法(7USC2321ets叫.)所賦予的權利的侵權行為，申請人不會放棄追究。在2006年5月由蘇格蘭阿伯丁的NCIMB公司在布達佩斯條約所承認的公共保藏中心進行了另外的種子保藏，如下NCIMB41388Srass/canap"s04SN41415NCIMB41389Srass/canapt/s04SN41433NCIMB413908rass/canap"s05DHS12879NCIMB413918rass/canap"s05DHS12897保藏日期為2006年5月12曰NCIMB413928rassi'canapus04CWB930015NCIMB413935rass,canapc/s04CWB930081NCIMB41394Srass/'canapt/s04CWB930111NCIMB41395SrassZcanapus04CWB930127NCIMB413965廠ass,canapus04CWB930128NCIMB41397Srass/'canap"s04CWB930135NCIMB41398Srass/'canapus04CWB930144保藏日期為2006年5月15曰關于這些保藏品系的細節(jié)如表11所示。在每個實例中，均保藏了3000粒種子，只有NCIMB41393例外，由于供應有限它僅保藏了400粒種子。如果需要，可以進行追加保藏。此外，于2006年5月17日由馬尼托巴省Winnipeg的加拿大國際寄存主管當局對核盤菌分離林SS糾進行保藏，其序列號為170506-01。在本文所述的所有室內(nèi)篩選及選方法以及極端病害壓力田間實馬全條件中均可使用該分離株。諸如在表9中所列出的這樣的自然田間研究數(shù)據(jù)，通過使用SS#4分離株來反映針對核盤菌天然種群的試驗并確認育種工作的有效性。出于舉例的目的，通過圖例與實施例的方式詳細描述了前述發(fā)明。不過，4艮明顯，可認為諸如單基因修飾與突變、季節(jié)性變種、從所述品系植林種群中選擇的變異個體以及其它類似物這樣的改變及修飾，仍在本發(fā)明的范疇之內(nèi)。本文所使用的參考文獻，無論是期刊、專利、公開申請或者其它類似物，均通過參考的方式完全整合在本文中。應當理解到，對于本領域普通技術人員而言，某些修飾應該是而且也的確是顯而易見的，這類對于本發(fā)明中所述的具體的品系、變種及流程的修飾，被認定為仍在本發(fā)明的范疇之內(nèi)。參考文獻Abeefa/.,J.傷o/.C/7e/r.262:16793(1987)Ahmadi，M,R.,S.Raeisi,A.M,N.Dawaji,(2000)Introductionofrapes的d(BrassicanapusL.),cultlvarTalaye.SeedandPlant.16(1>:Pe127-Pe129,en14.SeedandPlantImprovementInstitute,P.O.Box4119,Karaj31585,Iran.Ahmadi,M.R.,G.Arab,S.Raeisi,E.Mohammadi,M.Khiavi，S.Pourdad,M.丄Fagheeh,A.Hekmat-Gharabagh,A.Taee,(2000)Introductionof鄰eseed(Brassiesnspus匕.),cultivarEsteghlal,SeedandPlant.16(1》Pe127-Pe126,en13.SeedandPlantImprovementInstitute,P.O.Box4119,Karaj31585,Iran.BaochengHu,FChen,QLi,XWu,SHou,WFejandXWang1999.Effectofculturalcontrolonrapeseedstemrot(Sc/e廠oft"/'asclerotiorum)inBrassicanapus.Proceedingsofthe10thInternationalRap的的dCongress,CanberraAustra卩a.BaoMing,Tian,ZhangShuFen,SongWenGung,WenYanGheng,RenLeJian,WangJjanPing,LiuJlanMing,(1999)Breedingof"YuYou4"-anewdouble-lowhybridofrapeseed(BrassicanapusL).ChineseJournalofOilCropSciences.4:12-14.InstituteofIndustrialCrops,H的3nAcademyofAgriculturalSciences,Zhengzhou,Hensin450002,China.Bardin,S.D.andH,C.Huang,(2001)ResearchonbiologyandcontrolofSc/eraf''n/'adiseasesinCanada.CanadianJournalofPlantPathology23:88-98,Barsby,T丄.,a/.,"ARapidandEfficientAlternativeProcedurefortheRegenerationofPlantsfromHypocotylProtoplastsof8rassfcanapt;s",PlantCellReports,(Spring1996)Beachye〖a/,,A肌fev,Phytopa歸28:451(1990)Bernardo,R.andA丄.Kahler,2001,Theor.Appl.Genet102:986-992Binding(1985)RegenerationofPlants,PlantProtoplasts,CRCPressBacoRatonppSITSBolandandHall(1987)EvaluatingsoybeancultivarsforresistancetoSc/ero加/asc/eroWon/munderfieldconditions.PlantDisease7"1:934-936.BolandandHallIndexofplanthostsofSc/eraf/"/asc/eraf/o/w.Can.丄PlantPathol.16:93-108(1的4)Botellaa/"P/an〖Mo/ec.8/o/.24:757(額)Bradleya/.PlantDisease90(2):215—219(2006)Briggs,S.,CurrentBiology,5(2)(1995)Brun,H.,M.Tribodet,M.Renard,丄PlesisandX.Tan'guy,(1987)Afieldstudyofrapes的d(Brassiesnspus)resistancetoSc/e/tiW"/asclerotiorum-7thIntern曰tion31RapeseedCongress,Poznan,PolandBushnellefa/.,Can.丄ofPlantPath.20(2》:137-149(1998)Buzzell,R丄，Welacky,T.W.，andAnderson,T.R.(1993)SoybeancultivarreactionandrowwidtheffectonSc/e/ioto/astemrot.Can.丄PintSci.73:1169-1175."CellCulturetechniquesandCanolaimprovement"丄Am,OilChem.Soc.66,4，455ChunYun,Guan，F(xiàn)angQIuLi,XunLi,SheYuanChen,GuoHuaiWang,ZhongSongUu,(2003)Resistanceofthedouble-lowrapessedcultivarXiangyou15(B.napus)toSc/erof/n/'asclerotiorum.ActaAgronomicaSinica.29(5):715-718.OilseedCorpsInstitute,HunanAgriculturalUniversity,Changsha,Hunan410128,China.Chuonga/.,"ASimpleCultureMethodfor8rass/cahypocotylProtoplasts",PlantCellReports4:4-6(1985)CornelissenandMelchers,PI.Physiol.101:709-712,(1993〉Delourmee〖a/,,(1991)RadishCytoplasmicMaleSterilityinRapeseed:BreedingRestorerLineswithgoodFemaleFertilityProc.8thInt.Rap的eedConf.SaskatoonCanada1506-1510.Elliota/.,P/anf/Wotec.8/'o/.21:515(1993)Evansa/.,(1983)ProtoplastisolationandCulture,HandbookofPlantCellCultureMac國anPublishingCompanypp.124-176,Fishere〖a/.,P/aWP/ys,'o/.102:1045(1993)Fltta/.World-wideImportanceofphomastemcanker(Lepfosphae〃'amacu/a/wandLWg/o6osa)onoilseedrape(Srass/ca卿"5)(2006)EuropeanJofPlantPathology114:3-15Fu,S.Z,(1990)Newthinkingonrapebreedingforhighyield曰nddiseaseresistance-breedingapetallessgenotype.ActaAgricultureShanghai.6(3):76-77,EconomicCropR的earchInstitute,JiangsuProvinceAcademyofAgriculturalSciences,Nanjing210024,China.Geisere〖s/.,Ge"e48:1090,GHckandThompson,METHODSINPLANTMOLECULARBIOLOGYANDBIOTECHNOLOGY269-284(CRCPress,BocaRaton,1的3)Glick,B.R.andGeneticTransformationfortheimprovementofCanolaWorldConf,日iotechnolFatsandOilsInd.43哉1988.Griessa/"P/a"fP/7ys/0/.104:1467(1994)Grubera/.,"VectorsforPlantTransformation"inMe仿ocfs/nP/anf/Wo/ecu/ar8/'0,0gya/7cf5/otec//no/ogy,Glick,B.R.andThompson,丄E.Eds.(CRCPress,Inc.,BocaRaton,1993)pages89-119Hammo汰efa/.,Nature344:458(1990》Hansen,N.丄P,&Andersen,S.B.1996Invitrochromosomedoublingpotentialofcolchicine'oryzalln.trifluralinandAPMinSrass/canapusmicrosporeculture.Euohvtica88:159-164HanZhong,Wang,GuiHuaLiu,YuanBenZheng,XinFaWang,QingYang,(2004)BreedingoftheBrassicanapuscultivarZhongsh咖g9withhighresistancetoSc/柳麵sclerotlorumanddynamicsofitsimportantdefenseenzymeactivity,Scienti3Agric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諾拉油。52.權利要求1中的植物進一步代表在相同的環(huán)境及病害條件下，平均黑脛病抗性水平高于PioneerHi-Bred變種46A76的種群。53.權利要求1中的植物，進一步包括轉(zhuǎn)基因。54.權利要求1中的植物，其中所述植物是雄性不育的。55.在包括可控的濕度在內(nèi)的可控環(huán)境條件下篩選對核盤菌具有抗性的植物的方法，包括(a)用含核盤菌菌絲體的低營養(yǎng)PDA塞狀物對培養(yǎng)在可控的環(huán)境條件下的植物進行接種；及(b)篩選對核盤菌具有抗性的植物。56.權利要求55中的方法，其中塞狀物通過昆蟲針附著在植物上。57.權利要求55中的方法，其中塞狀物的直徑約3mm。全文摘要本發(fā)明提供了平均菌核病發(fā)病率(SSDI％)得分比合適的參照變種的SSDI％得分低約60％的蕓苔系。也提供了在溫室、小溫室和田間篩選核盤菌抗性的方法學。文檔編號A01H1/04GK101243188SQ200680029592公開日2008年8月13日申請日期2006年6月7日優(yōu)先權日2005年6月9日發(fā)明者D·沙內(nèi),I·法拉克,J·帕特爾,L·圖爾西拉姆申請人:先鋒高級育種國際公司