具有縮短的Raphanus片段(SRF)的新的蕓苔屬Ogura恢復(fù)系的制作方法
【專利摘要】提供了具有縮短的Raphanus片段的新的蕓苔屬Ogura育性恢復(fù)系。該新的系缺乏OPC2標(biāo)記并能夠在Ogura細(xì)胞質(zhì)雄性不育(cms)植物中完全恢復(fù)能育性。改良的系使用新的育種方法培育。新的育種方法可以用于縮短任何植物中包含目的基因的外源插入物。
【專利說明】具有縮短的Raphanus片段（SRF)的新的蕓苔屬Ogura恢復(fù) 系 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及具有縮短的Raphanus片段的新的蕓苔屬系，該縮短的Raphanus片段 包括用于Ogura細(xì)胞質(zhì)雄性不育的育性恢復(fù)基因。本發(fā)明還涉及縮短任何植物中包含目的 基因的外源插入物的新的育種方法。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 來自蕓苔屬（Brassica)植物的含油種子是日益重要的作物。作為植物油的來源， 其目前在商業(yè)市場容量中只位于大豆和棕櫚科之后。油可以用于多種用途，例如沙拉油或 烹調(diào)油。提取油時，柏可以用作飼料來源。
[0004] 稱為油菜籽的蕓苔屬種子，在其最初形式時，對人體是有害的，這是由于其油中相 對高水平的芥酸和柏中相對高水平的硫代葡萄糖苷。芥酸在天然栽培品種中是普遍存在 的，含量為總脂肪酸成分重量的30-50%。硫代葡萄糖苷在蕓苔屬種子中是不需要的，因為 其在油的提取和消化過程中，通過酶的裂解可以導(dǎo)致抗?fàn)I養(yǎng)物分解產(chǎn)物的產(chǎn)生。植物科研 工作者鑒定出低芥酸菜籽油的種質(zhì)來源，攻克了芥酸問題（Stefansson, "The Development of Improved Rapeseed Cultivars(改良油菜桿栽培品種的培育）· " "High and Low Erucic Acid Rapeseed Oils (高芥酸和低芥酸菜桿油）"中（第6章），由 John K. G. Kramer, Frank D. Sauer 和 Wallace J. Pigden 編輯.加拿大學(xué)術(shù)出版社（Academic Press Canada)，多倫多 (1983))。最近，植物科研工作者致力于將總硫代葡萄糖苷在含水量8. 5%的整粒種子中的 含量降低至少于20ymol/g的水平。這可以通過核共振成像（NRI)或高效液相色譜（HPLC) 來測定（國際標(biāo)準(zhǔn)化組織，參考號IS091671:1992)。
[0005] 特別吸引植物科研工作者的是所謂的"雙低（double-low) "品種：該品種油中的 芥酸低并且在油提取后殘留的固體柏中硫代葡萄糖苷低（即芥酸含量低于總脂肪酸成分 重量的2%，并且硫代葡萄糖苷在無油柏中的含量低于30 μ mol/g)。在加拿大首次培育出 的這些更高品質(zhì)的油菜種類，稱為加拿大油菜（canola)。
[0006] 另外，植物科研工作者已經(jīng)嘗試改善菜籽油的脂肪酸特征（profile) (Robbelen, "Changes and Limitations of Breeding for Improved Polyenic Fatty Acids Content in Rapeseed (油菜籽中改良的多烯脂肪酸含量的育種改變和局限 性）· " "Biotechnology for the Oils and Fats Industry (用于油類和脂肪產(chǎn)業(yè)的生物 技術(shù)）"（第 10 章 ），edited by Colin Ratledge，Peter Dawson and James Rattray (Colin Ratledge、Peter Dawson 和 James Rattray 編輯），American Oil Chemists' Society (美 國石油化學(xué)家學(xué)會），（1984) ;Ratledge, Colin, Dawson, Peter 和 Rattray, James, (1984) (用于油類和脂肪產(chǎn)業(yè)的生物技術(shù)）.American Oil Chemists' Society (美國石油化 學(xué)家學(xué)會），Champaign ;328pp ;Robbelen and Nitsch.Genetical and Physiological Investigations on Mutants for Polyenic Fatty Acids in Rapeseed, Brassica napus L.(甘藍(lán)型油菜菜籽中多烯脂肪酸突變體的遺傳學(xué)和生理學(xué)調(diào)查）Z. Planzenzuchta.，75 :93-105, (1975) ；Rako and McGregor. "Opportunities and Problems in Modification of Levels of Rapeseed C18Unsaturated Fatty Acids (油菜桿C18不飽和脂肪酸的水平的改變 的機遇和問題）."J. Am. Oil Chem. Soc. (1973)50(10) :400-403)。這些參考文獻(xiàn)是該嘗試的 代表。
[0007] 目前，自由授粉品種和蕓苔屬雜種都在栽培。在培育改良的蕓苔屬雜種中，育種 者可以利用不同的授粉控制系統(tǒng)，例如自交不親和（SI)、細(xì)胞質(zhì)雄性不育（CMS)和核雄性 不育（NMS)蕓苔屬植物作為母本。在雜種作物育種中，植物育種者探索從雄性系和雌性系 的結(jié)合或雜交中能導(dǎo)致更高作物產(chǎn)量（谷類或生物質(zhì)）的雜種優(yōu)勢（heterosis或hybrid vigor)現(xiàn)象。使用這些植物，育種者嘗試改善種子生產(chǎn)的效率和F1雜種的品質(zhì)以及降低育 種成本。當(dāng)在二元雜交中不使用SI、CMS或匪S植物進(jìn)行雜交時，在子代（pr 〇geny，F(xiàn)l代） 獲得和分離所需要的性狀更為困難，因為親本能夠經(jīng)歷異花授粉和自花授粉。如果親本中 的一個是不能產(chǎn)生花粉的SI、CMS或匪S植物，那么只會發(fā)生異花授粉。如果親本是相同品 質(zhì)的并且育種者進(jìn)行單交，那么通過在二元雜交中去除一個親本品種的花粉，植物育種者 可以保證獲得相同品質(zhì)的雜種種子。
[0008] 在一個實例中，F(xiàn)1雜種的產(chǎn)生包括將CMS蕓苔屬母本和產(chǎn)生花粉的蕓苔屬父本進(jìn) 行雜交。但是為了有效繁殖，F(xiàn)1雜種的父本必須具有育性恢復(fù)基因（Rf基因）。Rf基因的 存在意味著F1代不會完全地或部分地不育，以便可以發(fā)生自花授粉或異花授粉。F1代的自 花授粉對于確保F1植物為種植者提供優(yōu)異的產(chǎn)量來說是理想的。F1代的自花授粉對于確 保所需要的性狀是可遺傳的和穩(wěn)定的來說也是理想的。
[0009] -種細(xì)胞質(zhì)雄性不育并用于育種的蕓苔屬植物是Ogura (0GU)細(xì)胞質(zhì) 雄性不育（Pellan-Delourme，et al.，（1987)Male fertility restoration in Brassica napus with radish cytoplasmic male sterility Proc.7th Int. Rapeseed Conf.，Poznan, Poland, 199-203)。Ogura細(xì)胞質(zhì)雄性不育植物的育性恢復(fù)系已經(jīng)被 位于法國雷恩市（Rennes)的法國國力農(nóng)業(yè)科學(xué)院（Institut National de Recherche Agricole(INRA))從蘿卜（Raphanus sativus (radish))轉(zhuǎn)移到蕓苔屬（Pelletier and Pr imard, (1987) "Molecular, Phenotypic and Genetic Characterization of Mitochondrial Recombinants in Rapeseed(油菜籽內(nèi)線粒體重組體的分子、表型和遺傳特征）."Proc. 7th Int Rapeseed Conf.，Poznau, Polandl 13-118)。源自蘿卜的恢復(fù)基因 Rfl 的描述見 于 W092/05251 和 Delourme，et al·， （1991) "Radish Cytoplasmic Male Sterility in Rapeseed:Breeding Restorer Lines with a Good Female Fertility (油菜桿中的蘿卜細(xì)胞 質(zhì)雄性不育：具有良好雌性能育性的育種恢復(fù)系）."Proc8th Int. Rapeseed Conf.，Saskat oon,Canada. 1506-1510。
[0010] 但是，當(dāng)Ogura Raphanus恢復(fù)基因從蘿卜轉(zhuǎn)移到蕓苔屬時，大段Raphanus基因 組也滲入到蕓苔屬中。這個大Raphanus基因組片段不但攜帶了恢復(fù)基因而且還攜帶了很 多不希望的性狀。例如，早期恢復(fù)系種質(zhì)是不適當(dāng)?shù)?，因為攜帶該大Raphanus片段的近 交種和雜種恢復(fù)系的硫代葡萄糖苷水平升高并且該恢復(fù)系與結(jié)籽-每個長角果胚珠的數(shù) 目的降低有關(guān)（Pellan-Delourme and Renard, (1988) "Cytoplasmic male sterility in rapeseed (Brassica napus L. ) :Female fertility of restored rapeseed with "Ogura''and cybrids cytoplasms)，'，Genome30:234-238 ;Delourme，et al.，（1994)，"Identification of RAPD Markers Linked to a Fertility Restorer Gene for the Ogura Radish Cytoplasmic Male Sterility of Rapeseed(Brassica napus L. )，'，Theor. Appl. Gener. 88:741-748) 〇 在 雜種的情況下，即使母本具的硫代葡萄糖苷含量降低時，硫代葡萄糖苷水平依然升高。所述 水平通常大于無油柏的30 μ mol/g，超過世界上大部分監(jiān)管機構(gòu)所允許的種子注冊的硫代 葡萄糖苷水平。因此，早期恢復(fù)系種質(zhì)可以用于研究用途，不能直接培育加拿大油菜品質(zhì)的 商業(yè)雜種品種。
[0011] 對于Ogura細(xì)胞質(zhì)不育，INRA列出了與獲具有低硫代葡萄糖苷水平的恢復(fù)系有關(guān) 的困難（Delourme, et al.，（1994)"Identification of RAH) Markers Linked to a Fertility Restorer Gene for the Ogura Radish Cytoplasmic Male Sterility of Rapeseed(Brassica napus L.)，'，Theor. Appl. Gener. 88:741-748 ;Delourme，et al.，（1995) "Breeding Double Low Restorer Lines in Radish Cytoplasmic Male Sterility of Rapeseed(Brassica Napus L.(油菜籽（甘藍(lán)型油菜）的蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育中雙低恢復(fù)系的育種））"，Proc.9th Int. Rapeseed Conf.，Cambridge, England)。IRNA表明這些困難是由于在其育種材料 中雄性育性恢復(fù)和硫代葡萄糖苷含量的關(guān)聯(lián)造成的。IRNA建議更多的蘿卜的遺傳信息 需要從其恢復(fù)系中去除。（Delourme, et al.，（1995) "Breeding Double Low Restorer Lines in Radish Cytoplasmic Male Sterility of Rapeseed(Brassica Napus L.)(油 菜籽（甘藍(lán)型油菜）的蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育雙低恢復(fù)系的育種）"，？1"〇(：.9也1拉· Rapeseed Conf.，Cambridge, England)。盡管在前些年對恢復(fù)系進(jìn)行了改良，但是對恢復(fù) 系進(jìn)行的同工酶研究表明，該大段蘿卜遺傳信息仍然保留在恢復(fù)基因周圍（Delourme，et al. , (1994) ''Identification of RAPD Markers Linked to a Fertility Restorer Gene for the Ogura Radish Cytoplasmic Male Sterility of Rapeseed (Brassica napus L. ) Theor. Appl. Gener. 88:741-748)〇
[0012] INRA嘗試培育硫代葡萄糖苷水平降低的恢復(fù)系。其報道了具有15μπι〇1/ g 的雜合恢復(fù)系（Delourme, et al·，（1995) "Breeding Double Low Restorer Lines in Radish Cytoplasmic Male Sterility of Rapeseed(Brassica Napus L.)(油菜桿（甘 藍(lán)型油菜）的蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育雙低恢復(fù)系的育種）"，Proc. 9th Int. Rapeseed Conf.，Cambridge, England)。但是，（i)該恢復(fù)系對于恢復(fù)基因是雜合（Rfrf)的不是純合 (RfRf)的，（ii)該恢復(fù)系是單交植物（single hybrid plant)而不是近交系，（iii)只有單 獨的數(shù)據(jù)點表明該恢復(fù)系具有低硫代葡萄糖苷水平，而不是多數(shù)據(jù)點來支持低硫代葡萄糖 苷水平，（iv)沒有數(shù)據(jù)證明低硫代葡萄糖苷性狀是否會傳遞給該恢復(fù)系的子代，并且（v) 該恢復(fù)系是在單一環(huán)境中選擇和評價的-即沒有證明在田間試驗時所述低硫代葡萄糖苷 性狀在連續(xù)代中是穩(wěn)定的。因此，該最初的蕓苔屬Ogura恢復(fù)系不適于商業(yè)用途。出于本 公開的目的，該材料稱為"最初的（original) "蕓苔屬恢復(fù)系。
[0013] 改良的恢復(fù)系由 Charne, et al·，（1"8)恥98/278〇6 "Oilseed fcassica Containing an improved fertility restorer gene for Ogura cytoplastic male sterility (含有針對Ogura細(xì)胞質(zhì)雄性不育的改良的育性恢復(fù)基因的含油種子蕓苔屬）" 制造。所述改良的恢復(fù)系具有Ogura細(xì)胞質(zhì)雄性不育的純合的（固定的）恢復(fù)基因（RfRf) 并且含油種子是低硫代葡萄糖苷的。因為該恢復(fù)系是純合的（RfRf)，所以其可以用于培育 恢復(fù)系近交種，或者作為雄性近交種，用于制造用于商業(yè)產(chǎn)品培育的單交種（single cross hybrid)組合。硫代葡萄糖苷水平低于不同國家在加拿大油菜標(biāo)準(zhǔn)中制定的硫代葡萄糖苷 水平，并且育種者可以使用改良的恢復(fù)系來生產(chǎn)具有低硫代葡萄糖苷水平含油種子的蕓苔 屬近交種和雜種。這對于農(nóng)作業(yè)者是有益的，他們可以種植授粉后產(chǎn)生具有低硫代葡萄糖 苷水平含油種子的蕓苔屬雜種。該育種成果去除了約三分之二的最初的Raphanus片段。這 是基于14個RFLP、AFLP和SCAR標(biāo)記中丟失了 10個而估計的（W098/56948Tulsieram, et al.，1998-12-17)。但是，該材料中的Raphanus片段仍然是不必要地大。為了本公開的目 的，該材料稱為"第一期重組（first phase recombinant) "蕓苔屬恢復(fù)系或種質(zhì)。
[0014] 盡管在"第一期重組"恢復(fù)系種質(zhì)中有所改良，但是仍然與不利的農(nóng)藝學(xué)性能 有關(guān)。這些不利的性狀可以來自該Raphanus片段內(nèi)與能育性無關(guān)的基因。實際上，只 有Raphanus片段中的恢復(fù)基因是加拿大油菜CMS授粉系統(tǒng)所需要的。因此，恢復(fù)系中的 Raphanus片段越短，該恢復(fù)系預(yù)期的表現(xiàn)就越好。
[0015] Ogura 恢復(fù)基因已經(jīng)被 DNA LandMarks Inc./McGill University (美國專利申請 公開第2003/0126646A1號，W003/006622A2)、三菱（Mitsubishi)(美國專利申請公開第 2004/0117868A1號）和INRA(W02004/039988A1)分離和克隆。該基因可以用于轉(zhuǎn)化蕓苔屬 植物。
[0016] 其他人已嘗試產(chǎn)生具有縮短的Raphanus片段的恢復(fù)系。例如，法國國力農(nóng)業(yè) 科學(xué)院（INRA)通過將具有Pgi-2等位基因缺失的恢復(fù)系"R211"雜交并與雙低甘藍(lán)型 油菜（B. napus)系Drakkar雜交而培育了具有縮短的Raphanus片段的系。子代植物 在減數(shù)分離前用Y射線照射以誘導(dǎo)重組。這產(chǎn)生了一種子代植物"R2000"，其中來自 甘藍(lán)（Brassica oleracea)的 Pgi_2 基因發(fā)生重組（W02005/002324 和 Theor. Appl. Genet(2005)lll:736-746)。但是，R2000中的Raphanus片段大于本 申請人:培育的并在上 文描述的第一期重組恢復(fù)系材料中的Raphanus片段。
[0017] 另一個實例，即Syngenta的W005074671描述了在其BLR1重組事件中縮短的 Raphanus片段。該BLR1重組事件只是通過雜交和選擇來產(chǎn)生，然后用分子標(biāo)記篩選；沒有 使用誘變。但是Raphanus片段可以進(jìn)一步縮短。
[0018] 發(fā)明概述
[0019] 本發(fā)明一方面提供了包含用于Ogura細(xì)胞質(zhì)雄性不育的育性基因的蕓苔屬植物， 其中所述育性基因位于從蘿卜基因滲入的Raphanus片段上，并且所述Raphanus片段缺乏 選自以下的標(biāo)記：RMA01、RMA02、RMA03、RMA04、RMA05、RMA06、RMA07、RMA08、RMA09、RMA10、 RMC24、0PC2、RMC25、RMC26、RMC27、RMC28、RMC29、RMC30、RMC31、RMC32 和 RMC33。所述蕓苔 屬植物可以缺乏Raphanus片段中的0PC2標(biāo)記。
[0020] 本發(fā)明另一方面提供了包含用于Ogura細(xì)胞質(zhì)雄性不育的育性基因的蕓苔屬植 物，其中所述育性基因位于從蘿卜基因滲入的Raphanus片段上，并且所述Raphanus片段 (i) 缺乏選自以下的標(biāo)記：RMA01、RMA02、RMA03、RMA04、RMA05、RMA06、RMA07、RMA08、RMA09、 RMA10、RMC24、0PC2、RMC25、RMC26、RMC27、RMC28、RMC29、RMC30、RMC31、RMC32 和 RMC33，并且 (ii) 包含選自以下的分子標(biāo)記：RMB01、E35M62、RMB02、RMB03、RMB04、RMB05、RMB06、RMB07、 RMB08、RMB09、RMB10、0PF10、RMB11、RMB12、RMC01、RMC02、RMC03、E38M60、RMC04、RMC05、 RMC06、RMC07、RMC08、RMC17、RMC18、RMC19、RMC20、RMC21、RMC22 和 RMC23。所述蕓苔屬植 物可以稱為R1439或其后代或通過將R1439與另一植物雜交產(chǎn)生的植物，R1439的代表性 種子已經(jīng)進(jìn)行了保藏，NCMB登錄號為41510。該蕓苔屬植物的子代（progeny)或后代植物 (descendent plant)可以包含缺乏選自以下的標(biāo)記的Raphanus片段：RMA01、RMA02、RMA03、 RMA04、RMA05、RMA06、RMA07、RMA08、RMA09、RMA10、RMC09、RMC10、RMC11、RMC12、RMC13、 RMC14、RMC15、RMC16、RMC24、0PC2、RMC25、RMC26、RMC27、RMC28、RMC29、RMC30、RMC31、RMC32 和 RMC33。
[0021] 本發(fā)明的另一方面是提供包含針對Ogura細(xì)胞質(zhì)雄性不育的育性基因的蕓苔屬 植物，其中所述育性基因位于從蘿卜基因滲入的Raphanus片段上，并且所述Raphanus片段 (i) 缺乏選自以下的標(biāo)記：RMA01、RMA02、RMA03、RMA04、RMA05、RMA06、RMA07、RMA08、RMA09、 RMA10、RMC24、0PC2、RMC25、RMC26、RMC27、RMC28、RMC29、RMC30、RMC31、RMC32 和 RMC33，并且 (ii) 包含選自以下的分子標(biāo)記：RMB01、E35M62、RMB02、RMB03、RMB04、RMB05、RMB06、RMB07、 RMB08、RMB09、RMB10、0PF10、RMB11、RMB12、RMC01、RMC02、RMC03、E38M60、RMC04、RMC05、 RMC06、RMC07、RMC08、RMC09、RMC10、RMC11、RMC12、RMC13、RMC14、RMC15、RMC16、RMC17、 RMC18、RMC19、RMC20、RMC21、RMC22和RMC23。所述蕓苔屬植物可以稱為R1815或其后代 或通過將R1815與另一植物雜交產(chǎn)生的植物，R1815的代表性種子已經(jīng)進(jìn)行了保藏，NCMB 登錄號為41511。子代或后代植物可以包含缺乏選自以下的標(biāo)記的Raphanus片段：RMA01、 RMA02、RMA03、RMA04、RMA05、RMA06、RMA07、RMA08、RMA09、RMA10、RMC24、0PC2、RMC25、RMC26、 RMC27、RMC28、RMC29、RMC30、RMC31、RMC32 和 RMC33。
[0022] 本發(fā)明另一方面提供了包含用于Ogura細(xì)胞質(zhì)雄性不育的育性基因的蕓苔屬植 物，其中所述育性基因位于從蘿卜基因滲入的Raphanus片段上，并且所述Raphanus片段 (i) 缺乏選自以下的標(biāo)記：RMA01、RMA02、RMA03、RMA04、RMA05、RMA06、RMA07、RMA08、RMA09、 RMA10、RMC24、0PC2、RMC25、RMC26、RMC27、RMC28、RMC29、RMC30、RMC31、RMC32 和 RMC33，并且 (ii) 包含選自以下的分子標(biāo)記：RMB01、E35M62、RMB02、RMB03、RMB04、RMB05、RMB06、RMB07、 RMB08、RMB09、RMB10、0PF10、RMB11、RMB12、RMC01、RMC02、RMC03、E38M60、RMC04、RMC05、 RMC06、RMC07、RMC08、RMC09、RMC10、RMC11、RMC12、RMC13、RMC14、RMC15 和 RMC16。所述蕓 苔屬植物可以稱為R1931或其后代或通過將R1931與另一植物雜交產(chǎn)生的植物，R1931的代 表性種子已經(jīng)進(jìn)行了保藏，NCMB登錄號為41512。子代或后代植物可以包含缺乏選自以下 的標(biāo)記的 Raphanus 片段：RMA01、RMA02、RMA03、RMA04、RMA05、RMA06、RMA07、RMA08、RMA09、 RMA10、RMC17、RMC18、RMC19、RMC20、RMC21、RMC22、RMC23、RMC24、0PC2、RMC25、RMC26、RMC27、 RMC28、RMC29、RMC30、RMC31、RMC32 和 RMC33。
[0023] 任何上述蕓苔屬植物可以是甘藍(lán)型油菜、蕪菁（B. rapa)或芥菜（B. juncea)。所述 植物可以是近交種或雜種。
[0024] 本發(fā)明另一方面提供了來自任何上述蕓苔屬植物的蕓苔屬種子。另一方面提供了 來自任何上述蕓苔屬植物的植物細(xì)胞或上述植物的部分，所述部分可以選自：核酸序列、組 織、細(xì)胞、花粉、胚珠、根、葉、含油種子、小孢子、營養(yǎng)部分，無論是成熟的還是胚的。
[0025] 本發(fā)明另一方面提供了任一上述蕓苔屬植物的壓碎的蕓苔屬種子的集合 (assemblage)〇
[0026] 本發(fā)明另一方面提供了任何上述蕓苔屬植物的種子在制備油和/或柏中的用途。
[0027] 本發(fā)明另一方面提供了生產(chǎn)油的方法，其包括：（i)壓碎稱為R1439、R1815或 R1931且NCMB登錄號分別為41510、41511和41512的植物系所產(chǎn)生的的種子，或者R1439、 R1815或R1931的后代所產(chǎn)生的種子或者通過將R1439、R1815或R1931與另一植物雜交產(chǎn) 生的植物所產(chǎn)生的種子；并且（ii)從所述種子中提取油。所述方法還可以包括（i)將所述 油精煉、漂白和除臭的步驟。
[0028] 本發(fā)明另一方面提供了任何上述植物在栽培農(nóng)作物中的用途。
[0029] 本發(fā)明另一方面提供了栽培蕓苔屬植物的方法，其包括（i)播種稱為R1439、 R1815或R1931且NCMB登錄號分別為41510、41511和41512的種子，或者來自R1439、 R1815或R1931的后代的種子或者來自將R1439、R1815或R1931與另一植物雜交所產(chǎn)生的 植物的種子；并且（ii)在蕓苔屬生長條件下，栽培所得到的植物。
[0030] 本發(fā)明另一方面提供了任何上述植物在蕓苔屬系育種中的用途。所述育種可以選 自常規(guī)育種、系譜育種、雜交、自花授粉、加倍單倍體、單粒傳法、回交和通過遺傳轉(zhuǎn)化育種。
[0031] 本發(fā)明另一方面提供了具有用于Ogura細(xì)胞質(zhì)雄性不育的育性基因的蕓苔屬 植物的育種方法，其中所述育性基因位于從蘿卜基因滲入的Raphanus片段上，并且所 述 Raphanus 片段缺乏選自以下的分子標(biāo)記：RMA01、RMA02、RMA03、RMA04、RMA05、RMA06、 RMA07、RMA08、RMA09、RMA10、RMC24、0PC2、RMC25、RMC26、RMC27、RMC28、RMC29、RMC30、RMC31、 RMC32和RMC33,所述育種方法包括（i)將任何上述植物與另一蕓苔屬植物雜交，產(chǎn)生第一 代子代植物；（ii)篩選所述第一代子代植物的Ogura Raphanus恢復(fù)基因；以及（iii)任選 地重復(fù)步驟（i)和（ii)。所述第一代子代植物可以是近交植物。所述第一代子代植物可以 是雜種植物。還提供通過此方法所產(chǎn)生的子代植物。
[0032] 本發(fā)明另一方面提供了與第一植物中的Raphanus片段相比，具有縮短的 Raphanus片段的新系的育種方法，其中新系中縮短的Raphanus片段包括Ogura育性恢復(fù) 基因，所述方法包括（i)誘變具有Raphanus片段的第一植物的第一種群，所述Raphanus片 段具有用于細(xì)胞質(zhì)雄性不育的Ogura育性恢復(fù)基因；（ii)篩選在所述Raphanus片段中缺 失Ogura育性恢復(fù)基因的第一種群，從而鑒定在Raphanus片段中缺失Ogura育性恢復(fù)基因 的第二植物；（iii)將在Raphanus片段中缺失Ogura恢復(fù)基因的第二植物與包含Raphanus 片段的所述第一植物雜交，所述Raphanus片段具有用于細(xì)胞質(zhì)雄性不育的Ogura育性恢復(fù) 基因；（iv)鑒定與第一植物相比，具有縮短的Raphanus片段的第三植物，其中所述縮短的 Raphanus片段包括所述恢復(fù)基因，以及（v)對第三植物進(jìn)行育種以產(chǎn)生具有縮短的、包括 Ogura育性恢復(fù)基因的Raphanus片段的新系。第一植物可以是R1439、R1815或R1931。第 三植物可以缺乏選自以下的分子標(biāo)記：RMA01、RMA02、RMA03、RMA04、RMA05、RMA06、RMA07、 RMA08、RMA09、RMA10、RMC24、0PC2、RMC25、RMC26、RMC27、RMC28、RMC29、RMC30、RMC31、RMC32 和RMC33。還提供了通過此方法所產(chǎn)生的新系。
[0033] 本發(fā)明另一方面提供了包含SEQ ID NO: 1至SEQ ID N0:158中列出的任何序列所示 的序列的分離的核酸。
[0034] 本發(fā)明另一方面了提供了包含SEQ ID NO: 1至SEQ ID N0:158中列出的任何序列所 不的序列的分尚的核酸在分子標(biāo)記開發(fā)中的用途。
[0035] 本發(fā)明另一方面提供了包含SEQ ID NO: 1至SEQ ID N0:158中列出的任何序列所示 的序列的分離的核酸作為引物的用途。
[0036] 本發(fā)明另一方面提供了包含SEQ ID NO: 1至SEQ ID N0:158中列出的任何序列所示 的序列的分離的核酸作為探針的用途。
[0037] 本發(fā)明另一方面提供了用一個或多個SEQ ID NOS: 1至158的序列篩選植物以表征 Raphanus片段的用途。
[0038] 本發(fā)明另一方面提供了篩選植物來表征Raphanus片段的方法，其包括：（i)將至 少一個選自SEQ IDN0:1至SEQ IDN0:158的引物序列與植物基因組雜交；（ii)實施PCR檢 測；以及（iii)表征Raphanus片段。
[0039] 本發(fā)明另一方面提供了在具有Raphanus片段的基因組中產(chǎn)生缺失突變體的方 法，所述Raphanus片段具有Ogura育性恢復(fù)基因，所述方法包括：（i)提供細(xì)胞群，其中所 述細(xì)胞對于Raphanus片段是雜合的并且所述細(xì)胞具有Ogura CMS細(xì)胞質(zhì)；（ii)誘變所述細(xì) 胞進(jìn)行以產(chǎn)生誘變的細(xì)胞；（iii)由誘變的細(xì)胞產(chǎn)生植物；以及（iv)篩選所述植物的不育 性以鑒定缺失突變體中缺失的Ogura育性恢復(fù)基因，其中所述誘變的Ogura基因不能恢復(fù) 具有Ogura CMS細(xì)胞質(zhì)的植物中的能育性。誘變細(xì)胞的步驟可以包括照射。還提供通過此 方法所產(chǎn)生的缺失突變體。
[0040] 本發(fā)明另一方面提供了使具有Ogura恢復(fù)基因的Raphanus片段重組的方法，其 包括：（i)提供在核基因組中具有Raphanus片段的植物，該Raphanus片段具有Ogura恢復(fù) 基因；（ii)將（i)的植物與核基因組中具有Raphanus片段的植物雜交，該Raphanus片段 中的Ogura恢復(fù)基因已經(jīng)缺失；以及（iii)鑒定Raphanus片段已經(jīng)發(fā)生重組的子代。（i) 的植物對于具有Ogura恢復(fù)基因的Raphanus片段可以是純合的（RfRf)，（ii)的植物對于 Ogura恢復(fù)基因缺失的Raphanus片段可以是純合的（Rf~Rf~)，來自對于Raphanus片段是 雜合的（Rf Rf~)第一子代種群的子代，以允許（a)具有Ogura恢復(fù)基因的Raphanus片段 (Rf)和（b) Ogura恢復(fù)基因缺失的Raphanus片段（Rf~)以有效速率進(jìn)行重組。該方法還可 以包括，將（a)不含有Raphanus片段（rfrf)且具有Ogura CMS細(xì)胞質(zhì)的植物用（b)來自 對于核基因組中具有Ogura恢復(fù)基因的Raphanus片段和沒有Ogura恢復(fù)基因的Raphanus 片段都是雜合的（RfRf~)的上述子代植物的花粉進(jìn)行授粉，以產(chǎn)生在Ogura CMS細(xì)胞質(zhì)中 對于Raphanus基因是雜合的第二子代種群，其中第二種群包含約50%具有rfRf基因型的 植物，約50%具有rfRf~基因型的植物以及Raphanus片段發(fā)生重組的一些子代（rfRf*)， 并且其中第二子代中Raphanus片段的分析得以促進(jìn)，因為在分析Raphanus片段時沒有干 擾。分析前，可以篩選第二種群子代植物的能育性。該方法還可以包括鑒定包含純合的重 組Raphanus片段的植物的步驟。還提供了此方法所產(chǎn)生的具有重組Raphanus片段的子代 植物。
[0041] 本發(fā)明另一方面提供了用于縮短第一植物中外源插入物的方法，其中外源插入物 包括目的基因，所述方法包括：（i)誘變具有包括目的基因的外源插入物的第一植物，以產(chǎn) 生具有缺乏目的基因的、部分缺失的外源插入物的第二植物；（ii)將第二植物與第一植物 雜交以產(chǎn)生第一種群，其中來自第一植物的外源插入物和來自第二植物的部分缺失的外源 插入物都可以重組；（iii)將第一種群的植物與不具有外源插入物的植物雜交以產(chǎn)生第二 植物種群；以及（iv)篩選第二植物種群以鑒定具有比第一植物中的外源插入物更短的外 源插入物的第三植物，其中所述第三植物中更短的外源插入物包括目的基因。
[0042] 本發(fā)明另一方面提供了具有比第一植物中的外源插入物短的外源插入物的新系 的育種方法，其中外源插入物包括目的基因，所述方法包括：（i)誘變具有包括目的基因的 外源插入物的第一植物，以產(chǎn)生具有缺乏目的基因的、部分缺失的外源插入物的第二植物； (ii)將第二植物與所述第一植物雜交以產(chǎn)生第一種群，其中來自第一植物的外源插入物和 來自第二植物的部分缺失的外源插入物都可以重組；（iii)將第一種群的植物與不具有外 源插入物的植物雜交以產(chǎn)生第二植物種群；以及（iv)篩選第二植物種群，以鑒定具有比第 一植物中的外源插入物短的外源插入物的第三植物，其中第三植物中更短的外源插入物包 括目的基因。
[0043] 之前的兩個方法還可以包括產(chǎn)生包圍并包括外源插入物的基因組區(qū)的遺傳信息 的步驟。遺傳信息的產(chǎn)生可以選自產(chǎn)生分子標(biāo)記、序列信息和遺傳圖譜。第一植物經(jīng)歷步 驟（i)中的誘變后對于目的基因可以是雜合的。第一植物在步驟（ii)中與第二植物雜交 后對于目的基因可以是純合的。第二植物在步驟（ii)中與第一植物雜交后對于缺乏目的 基因的、部分缺失的外源插入物可以是純合的。所述方法在步驟（ii)后還可以包括使用所 述遺傳信息鑒定具有來自第一植物的外源插入物和來自第二植物的部分缺失的外源插入 物的植物的步驟。所述方法還可以包括增加步驟（ii)的種子的步驟。所述方法還可以包 括對第三植物進(jìn)行育種以產(chǎn)生商業(yè)系的步驟。外源插入物可以是Raphanus插入物，并且目 的基因可以是Ogura育性恢復(fù)基因。外源插入物可以包括選自以下的目的基因：抗病性、抗 蟲性、耐旱性、耐熱性、抗裂莢性和改善的谷物質(zhì)量。還提供了以上兩方法中任一方法所產(chǎn) 生的第三植物。
[0044] 本發(fā)明另一方面提供了選自SEQ ID N0S: 159至237的分子標(biāo)記。
[0045] 本發(fā)明另一方面提供了一個或多個SEQ ID N0S: 159至237的序列篩選植物以表征 Raphanus片段的用途。
[0046] 本發(fā)明另一方面提供了表征具有包含Ogura育性恢復(fù)基因的Raphanus片段的植 物基因組的方法，其包括：⑴利用選自SEQ ID N0:159至SEQ ID N0:237的序列篩選所述植 物基因組，以及（ii)表征Raphanus片段。
[0047] 本發(fā)明另一方面提供了用于表征包含選自SEQ ID N0S: 159至237的標(biāo)記的 Raphanus片段的標(biāo)記/引物的組合。
[0048] 本發(fā)明另一方面提供了用于表征包含選自SEQ ID N0S:1至158的引物的Raphanus 片段的試劑盒。所述試劑盒還可以包含標(biāo)記信息。
[0049] 本發(fā)明另一方面提供了包含R1439、R1815或R1931重組事件的蕓苔屬植物。
[0050] 附圖簡要說明
[0051] 本發(fā)明將結(jié)合附圖進(jìn)行描述，其中：
[0052] 圖1說明在⑴最初的蕓苔屬Ogura恢復(fù)系（NW3002)、（ii)第一期重組蕓苔屬 Ogura恢復(fù)系（NW1717)和（iii)具有縮短的Raphanus片段（SRF)的新的第二期重組蕓苔 屬Ogura恢復(fù)系中所作的改良。
[0053] 圖2表示與NW1717中第一期重組Raphanus片段和最初的系NW3002相比，突變體 系Rl、R2和R5以及SRF系R1439、R1815和R1931中丟失的分子標(biāo)記。
[0054] 圖3表示縮短的Raphanus片段（SRF)開發(fā)的雜交圖。
[0055] 圖4表示描述用于縮短外源插入物的一般方法的連續(xù)圖。
[0056] 定義
[0057] CMS :表示細(xì)胞質(zhì)雄性不育并且是一類可用于雜種種子生產(chǎn)的雄性不育。
[0058] 重疊群：是通過組裝染色體的重疊的測序片段而生成的DNA的連續(xù)序列。重疊群 還是代表基因組的重疊區(qū)的一組克隆。術(shù)語重疊群還可以用于表示顯示染色體重疊區(qū)位置 的染色體圖譜，連續(xù)的DNA節(jié)段在該位置處重疊。重疊群圖譜很重要，因為其提供了通過檢 查一系列重疊克隆來研究基因組的完整并通常大的節(jié)段的能力，然后所述重疊克隆提供關(guān) 于該區(qū)的完整連續(xù)的信息，例如物理尺度和方向。
[0059] 保持系（也稱為 B-系）（Maintainer line (also known as B-line)):保持系是攜 帶天然細(xì)胞質(zhì)（即非CMS)并且攜帶與細(xì)胞質(zhì)雄性不育（CMS)系相同的核遺傳性的系。當(dāng) 與CMS系雜交時，其"保持"CMS系子代的不育性。因此，其與CMS系具有基本上相同的核遺 傳信息，但不是雄性不育。所述保持系是能育植物并且可以產(chǎn)生其自身的能育子代。
[0060] 最初的恢復(fù)系（也稱為最初的蕓苔屬Ogura恢復(fù)系）：這些系是最初的蕓苔屬 Ogura恢復(fù)系，并且當(dāng)恢復(fù)基因在純合條件下存在時，攜帶高硫代葡萄糖苷性狀。因此這些 系不能商業(yè)化或用于商業(yè)種子生產(chǎn)。這些系的實例是圖1所示的NW3002。
[0061] 第一期重組恢復(fù)系或種質(zhì)（也稱為第一期重組蕓苔屬Ogura恢復(fù)系或種質(zhì)）： 基于標(biāo)記測量，這些系含有小于最初的恢復(fù)系的Raphanus片段。當(dāng)恢復(fù)基因在純合條件 下時，這些系不攜帶高硫代葡萄糖苷性狀。因此，這些系可在商業(yè)上使用。這些系的實例 公開于 Charne, et al.，（1998)W098/27806 "Oilseed Brassica Containing an improved fertility restorer gene for Ogura cytoplastic male sterility (含有針對Ogura細(xì)胞質(zhì) 雄性不育的改良的育性恢復(fù)基因的含油種子蕓苔屬）"中。另一實例是圖1所示的NW1717。 第一期重組恢復(fù)系與具有縮短的Raphanus片段的第二期重組恢復(fù)系的區(qū)別在于存在很多 標(biāo)記，例如（i)圖1所示的0PC2標(biāo)記和（ii)圖2所示的標(biāo)記RMC24至RMC33,包括RMC24 和 RMC33,以及 RMA01 至 RMA10,包括 RMA01 和 RMA10。
[0062] 缺失突變體系（Rf~):這些系含有突變的Raphanus片段，其中所述片段上的 Raphanus恢復(fù)基因和其他Raphanus基因缺失。為本 申請人:的教導(dǎo)的目的，這些系稱為Rf~。 當(dāng)突變的Raphanus片段（除去恢復(fù)基因）在純合條件下時，突變體系稱為Rf~Rf~，并且當(dāng) 其細(xì)胞質(zhì)是Ogura CMS時，這些系是不育的。當(dāng)突變的Raphanus片段在雜合條件下時，所述 系稱為Rf'Rf或Rf'rf，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。例如，Rf'Rf表示一個等位基因包含 所述突變的Raphanus片段（除去恢復(fù)基因），并且另一等位基因包含第一期重組Raphanus 片段（具有恢復(fù)基因）。在Rf~Rf的情況下，當(dāng)其細(xì)胞質(zhì)是Ogura CMS時，所述系是能育的。 Rf~rf表示一個等位基因包含突變的Raphanus片段（除去恢復(fù)基因），并且另一等位基因 根本不含有Raphanus片段。對于Rf~rf，當(dāng)其細(xì)胞質(zhì)是Ogura CMS時，所述系是不育的。這 些突變體系用于產(chǎn)生具有縮短的Raphanus片段（SRF)的系，所述Raphanus片段包含恢復(fù) 基因（參見下文）。
[0063] 第二期重組恢復(fù)系或種質(zhì)（也稱為第二期重組蕓苔屬Ogura恢復(fù)系，具有縮短的 Raphanus片段（SRF)的第二期重組蕓苔屬Ogura恢復(fù)系或Rf*):這些系含有約一半的第一 期重組恢復(fù)系中發(fā)現(xiàn)的Raphanus片段（通過丟失的標(biāo)記的數(shù)目估計），并且包括Raphanus 恢復(fù)基因。這些系的實例包括圖1所示的本發(fā)明的R1439、R1815和R1931。為本 申請人:教 導(dǎo)的目的，這些系稱為Rf*。當(dāng)SRF在純合條件下時，所述系稱為Rf*Rf*。當(dāng)SRF在雜合條 件下時，所述系稱為Rf*Rf或Rf*rf，其中Rf*Rf是指包含具有SRF的一個等位基因和具有 來自第一期重組系的Raphanus片段的另一等位基因的系，Rf*rf指包含具有SRF的等位基 因和根本不含有Raphanus片段的另一等位基因的系。無論Rf*Rf*、Rf*Rf或Rf*rf，當(dāng)其 細(xì)胞質(zhì)是Ogura CMS時，所有這些SRF系都是能育的。
[0064] 不同實施方案的描述
[0065] 最初的蕓苔屬Ogura恢復(fù)系由INRA通過將Ogura恢復(fù)基因從蘿卜轉(zhuǎn)移到甘 藍(lán)型油菜而培育（Pelletier,et al·，（1987) "Molecular, Phenotypic and Genetic Characterization of Mitochondrial Recombinants in Rapeseed (油菜桿內(nèi)線粒體重組體 的分子、表型和遺傳特征）"Proc. 7th Int Rapeseed Conf. , Poznau, Polandll3_118)。這 些系包括賦予高硫代葡萄糖苷性狀的一個基因或多個基因。在圖1中，這些最初的系以 NW3002作為示例。
[0066] 第一期重組蕓苔屬Ogura恢復(fù)系由不同研究所培育，本 申請人:是其中之一。第 一期重組恢復(fù)系去除了賦予高硫代葡萄糖苷性狀的一個基因或多個基因。在圖1中，這 些第一期重組恢復(fù)系以NW1717作為示例。但是，所述第一期重組恢復(fù)系仍然攜帶大量的 Raphanus基因組（圖1)。此外，某些系伴有不希望的農(nóng)藝學(xué)特性。這些不希望的性狀可以 來自剩余的Raphanus片段中的基因或者來自蕓苔屬染色體上基因的去除/破壞。
[0067] 本教導(dǎo)涉及具有縮短的Raphanus片段（SRF)的第二期重組蕓苔屬Ogura恢復(fù)系。 第二期重組蕓苔屬Ogura恢復(fù)系通過以下步驟培育：（i)使用細(xì)菌人工染色體（BAC)重疊 群為第一期重組恢復(fù)系中的Raphanus片段制備物理圖譜（數(shù)據(jù)未顯示），（ii)用高密度 標(biāo)記在第一期重組恢復(fù)系中對Raphanus片段作圖，（iii)產(chǎn)生第一期重組蕓苔屬Ogura恢 復(fù)系的敲除突變種群，（iv)篩選敲除突變種群并鑒定具有第一期重組Raphanus片段包括 Ogura恢復(fù)基因的不同缺失的突變體系，（v)將突變體系與第一期重組恢復(fù)系雜交以提供 在Raphanus基因座重組的機會，并產(chǎn)生具有縮短的Raphanus片段（SRF)的第二期重組恢 復(fù)系，（vi)在具有Ogura恢復(fù)基因和縮短的Raphanus片段（SRF)的系中鑒定新的重組， (vii)表征具有縮短的Raphanus片段（SRF)的第二期重組恢復(fù)系，（viii)測試具有SRF的 第二期重組恢復(fù)系的更好的能育性、胚胎發(fā)生和農(nóng)藝學(xué)，以及（ix)將新的第二期重組恢復(fù) 系與另外的系雜交以產(chǎn)生商業(yè)系。
[0068] 提供了以下實施例，作為本發(fā)明的具體示例。但是，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不限于實施 例中所示的具體細(xì)節(jié)。
[0069] 實施例1.制備第一期重組蕓苔屬Ogura恢復(fù)系NW1717中Raphanus片段的高密 度標(biāo)記圖。
[0070] 圖2顯示了第一期重組蕓苔屬Ogura恢復(fù)系NW1717上的高密度標(biāo)記。標(biāo)記特異 性用一組系譜系即6個恢復(fù)系和6個非恢復(fù)系進(jìn)行了研究。只有那些對Ogura恢復(fù)系是特 異的標(biāo)記才用于篩選敲除突變種群和隨后本發(fā)明的SRF材料（參見下文）。
[0071]
【權(quán)利要求】
1. 產(chǎn)生蕓苔屬植物的方法，所述方法包括： (i) 誘變具有Raphanus片段的第一植物的第一種群，所述Raphanus片段具有Ogura育 性恢復(fù)基因； (ii) 篩選在所述Raphanus片段中缺失所述Ogura育性恢復(fù)基因的所述第一種群，從而 鑒定在所述Raphanus片段中缺失所述Ogura育性恢復(fù)基因的第二植物； (iii) 將在所述Raphanus片段中缺失Ogura恢復(fù)基因的所述第二植物與包含具有所述 Ogura育性恢復(fù)基因的所述Raphanus片段的所述第一植物進(jìn)行雜交； (iv) 鑒定與所述第一植物相比，具有縮短的Raphanus片段的第三植物，其中所述縮短 的Raphanus片段包括所述Ogura育性恢復(fù)基因；以及 (v) 對所述第三植物進(jìn)行育種以產(chǎn)生具有包括所述Ogura育性恢復(fù)基因的縮短的 Raphanus片段的后代。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一植物是R1931。
3. 分離的核酸，包含SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 158中列出的任何序列所示的序列。
4. 權(quán)利要求3所述的分離的核酸在分子標(biāo)記開發(fā)中的用途。
5. 權(quán)利要求3所述的分離的核酸在篩選植物以表征Raphanus片段中的用途。
6. 產(chǎn)生蕓苔屬植物的方法，所述方法包括： (i) 提供細(xì)胞群，其中所述細(xì)胞對于具有Ogura育性恢復(fù)基因的Raphanus片段是雜合 的，并且所述細(xì)胞具有Ogura CMS細(xì)胞質(zhì)； (ii) 誘變所述細(xì)胞以產(chǎn)生誘變的細(xì)胞； (iii) 由所述誘變的細(xì)胞產(chǎn)生植物；和 (iv) 篩選所述植物的不育性以鑒定缺失突變體中缺失的Ogura育性恢復(fù)基因，其中所 述誘變的Ogura基因不能恢復(fù)具有所述Ogura CMS細(xì)胞質(zhì)的植物中的能育性。
7. 產(chǎn)生蕓苔屬植物的方法，所述方法包括： (i) 提供在核基因組中具有Raphanus片段的植物，所述Raphanus片段具有Ogura恢復(fù) 基因； (ii) 將（i)的植物與在核基因組中具有其中Ogura恢復(fù)基因已經(jīng)缺失的Raphanus片 段的植物雜交；以及 (iii) 鑒定其中所述Raphanus片段已經(jīng)發(fā)生重組的后代。
8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其中（i)的植物對于所述具有Ogura恢復(fù)基因的 Raphanus片段是純合的（RfRf), (ii)的植物對于所述其中Ogura恢復(fù)基因已經(jīng)缺失的 Raphanus片段是純合的（Rf~R〇，且第一子代種群中的子代是雜合的（Rf Rf~)，以允許（a) 所述具有Ogura恢復(fù)基因的Raphanus片段（Rf)和（b)所述其中Ogura恢復(fù)基因已經(jīng)缺失 的Raphanus片段（Rf~)以有效的速率進(jìn)行重組。
9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其還包括將（a)不含有Raphanus片段（rfrf)并且具 有Ogura CMS細(xì)胞質(zhì)的植物用（b)來自權(quán)利要求8所述的對于Raphanus片段Ogura恢 復(fù)基因是雜合的（RfRO子代植物的花粉進(jìn)行授粉，以產(chǎn)生第二子代種群，其中所述第二 種群包含約50%具有rfRf基因型的植物，約50%具有rfRf~基因型的植物以及其中所 述Raphanus片段已發(fā)生重組（rfRf*)的一些子代，并且其中促進(jìn)了所述第二種群中所述 Raphanus片段的分析，因為在分析所述Raphanus片段時沒有干擾。
10. 產(chǎn)生蕓苔屬植物的方法，所述方法包括： (i) 誘變具有包括目的基因的外源插入物的第一植物以產(chǎn)生具有缺乏所述目的基因的 部分缺失的外源插入物的第二植物； (ii) 將所述第二植物與所述第一植物雜交以產(chǎn)生第一種群，其中來自所述第一植物的 所述外源插入物和來自所述第二植物的所述部分缺失的外源插入物都可以發(fā)生重組； (iii) 將所述第一種群的植物與不具有所述外源插入物的植物雜交以產(chǎn)生第二植物種 群； (iv) 篩選所述第二植物種群以鑒定具有比所述第一植物中的所述外源插入物更短的 外源插入物的第三植物，其中所述第三植物中更短的外源插入物包括目的基因。以及 (v) 繁殖所述第三植物以產(chǎn)生后代。
11. 如權(quán)利要求10所述的方法，其還包括產(chǎn)生包圍并包括所述外源插入物的基因組區(qū) 的遺傳信息的步驟。
12. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述產(chǎn)生遺傳信息可以選自產(chǎn)生分子標(biāo)記、序列 信息和遺傳圖譜。
13. 如權(quán)利要11所述的方法，其還包括在步驟（ii)后使用所述遺傳信息鑒定具有來自 所述第一植物的外源插入物和來自所述第二植物的部分缺失的外源插入物的植物的步驟。
14. 如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述外源插入物包括選自以下的性狀的目的基 因：抗病性、抗蟲性、耐旱性、耐熱性、抗裂莢性和改善的谷物質(zhì)量。
15. 權(quán)利要求10所述的后代在進(jìn)一步育種中的用途。
16. 選自SEQ ID NOS: 159至237的分子標(biāo)記。
17. -個或多個權(quán)利要求16所述的標(biāo)記在篩選植物以表征Raphanus片段中的用途。
【文檔編號】A01H1/02GK104041403SQ201410242019
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2009年2月5日 優(yōu)先權(quán)日:2008年2月6日
【發(fā)明者】張永平, 賈揚提拉勒·D·帕特爾, 洛馬斯·塔爾斯?fàn)柭? 申請人:先鋒國際良種公司