本發(fā)明涉及一種貼壁細(xì)胞生長融合度自動(dòng)分析方法，該方法克服了細(xì)胞圖像前景同背景對比度弱及背景灰度分布不平衡、起伏較大等因素造成的分割難題，可實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞培養(yǎng)過程中生長融合度的自動(dòng)分析計(jì)算，屬于圖像處理技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

生長融合度是細(xì)胞培養(yǎng)過程中的重要規(guī)格參數(shù)，目前在生物醫(yī)學(xué)行業(yè)，通常依靠檢驗(yàn)員主觀直接做出判斷。由于細(xì)胞生長速度過快，需要不定時(shí)檢測生長情況，此識(shí)別方法不僅耗散大量的人力與時(shí)間，而且不同的檢驗(yàn)員經(jīng)常做出不一致的檢測結(jié)果，另外由于人眼容易疲勞，長時(shí)間的檢測任務(wù)，很容易令檢驗(yàn)員產(chǎn)生主觀錯(cuò)誤判斷。所以創(chuàng)建一種貼壁細(xì)胞生長融合度自動(dòng)分析方法，對生物醫(yī)學(xué)行業(yè)生長融合度自動(dòng)化監(jiān)測水平有著重要的意義。

圖像處理技術(shù)在貼壁細(xì)胞生長融合度自動(dòng)分析計(jì)算的應(yīng)用過程中，最為關(guān)鍵一步是實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞的良好分割。圖像中存在許多不利于細(xì)胞分割的因素，比如前景同背景對比度弱，背景灰度分布不平衡、起伏較大，隨著分化過程細(xì)胞形狀、大小的無規(guī)則變化等等。這些因素導(dǎo)致常規(guī)方法很難直接實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞的良好分割。因此尋找合適的圖像處理方法是難點(diǎn)所在。

目前圖像處理技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)行業(yè)應(yīng)用十分廣泛。針對細(xì)胞的分割方法也有許多，基本可以分為：閾值法、邊緣檢測法、活動(dòng)輪廓模型等。由于圖像前景同背景對比度弱，細(xì)胞內(nèi)像素點(diǎn)的灰度值范圍較大，導(dǎo)致使用傳統(tǒng)的閾值法進(jìn)行區(qū)域檢測時(shí)，得到的目標(biāo)不完整、錯(cuò)分割現(xiàn)象嚴(yán)重；其次由于邊緣檢測算法實(shí)際依賴的是梯度信息作為閾值條件，大于閾值的認(rèn)為是邊界，小于閾值的認(rèn)為是背景，雖然視覺特性上細(xì)胞外邊緣灰度值較高，同細(xì)胞內(nèi)灰度值區(qū)別較大，但是這一特性并不絕對，也并不是所有目標(biāo)外邊緣均呈現(xiàn)這一特性，因此應(yīng)用邊緣檢測算法分割效果不佳；而在實(shí)際應(yīng)用活動(dòng)輪廓模型時(shí)，在低融合度情況下，分割效果理想，但是隨著融合度增加，分割效果逐漸變差，因此活動(dòng)輪廓模型只適合在細(xì)胞較獨(dú)立且形狀較規(guī)則的情況下使用，并不具有普適性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提出一種能夠有效克制傳統(tǒng)貼壁細(xì)胞生長融合度識(shí)別方法弊端，實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確、自動(dòng)化程度高的融合度自動(dòng)分析方法。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的技術(shù)方案，包括下列步驟：

步驟1：判斷輸入圖像類型并做出相應(yīng)轉(zhuǎn)換；

步驟2：對待處理圖像做灰度形態(tài)學(xué)的高低帽組合變換；

步驟3：差分法結(jié)合背景估計(jì)降低背景噪聲干擾因素；

步驟4：采用改進(jìn)k-means聚類算法實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞圖像前景與背景的粗分；

步驟5：采用面積濾波實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞圖像的去噪；

步驟6：將兩幅基于面積濾波的細(xì)胞結(jié)果像素級相加；

步驟7：利用擬合函數(shù)實(shí)現(xiàn)二值形態(tài)學(xué)處理系數(shù)的自適應(yīng)分析；

步驟8：用二值形態(tài)學(xué)的方法對圖像進(jìn)行優(yōu)化；

步驟9：計(jì)算最終融合度；

實(shí)際應(yīng)用表明，本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)對貼壁細(xì)胞生長融合度較高精度的自動(dòng)分析計(jì)算，有效提高了生物醫(yī)學(xué)行業(yè)融合度自動(dòng)化檢測水平，有著良好的使用價(jià)值。本發(fā)明技術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn)：

1.本發(fā)明操作簡便、自動(dòng)化程度高，同傳統(tǒng)培養(yǎng)過程細(xì)胞生長融合度分析方式相比，能夠減輕檢驗(yàn)員工作量，并提高檢測精度。

2.本發(fā)明針對細(xì)胞灰度分布特性，提出采用形態(tài)學(xué)高低帽組合變換增強(qiáng)前景同背景的對比度，改善圖像質(zhì)量。

3.本發(fā)明借助改進(jìn)k-means聚類算法，可實(shí)現(xiàn)對前景同背景的粗略區(qū)分，克服傳統(tǒng)分割方法的過分割及無效分割缺點(diǎn)。

4.本發(fā)明有效借助origin軟件數(shù)據(jù)分析功能，實(shí)現(xiàn)對二值形態(tài)學(xué)系數(shù)的自適應(yīng)判斷。

附圖說明

圖1：本發(fā)明的操作流程圖。

圖2：原始圖像經(jīng)相應(yīng)類型轉(zhuǎn)換、灰度形態(tài)學(xué)高低帽組合變換和差分法結(jié)合背景估計(jì)的處理過程。

(a)原始圖像；(b)灰度形態(tài)學(xué)高低帽組合變換圖像；(c)差分法結(jié)合背景估計(jì)得到背景含部分噪聲的細(xì)胞內(nèi)圖像；(d)差分法結(jié)合背景估計(jì)得到背景含部分噪聲的細(xì)胞外邊緣圖像。

圖3：改進(jìn)k-means聚類算法實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞圖像前景與背景粗分結(jié)果。

(a)是圖2(c)的分割結(jié)果圖像；(b)是圖2(d)的分割結(jié)果圖像。

圖4：面積濾波及二值形態(tài)學(xué)的處理過程。

(a)是圖3(a)的面積濾波結(jié)果圖像；(b)是圖3(b)的面積濾波結(jié)果圖像；(c)是圖4(a)、(b)的像素點(diǎn)逐點(diǎn)相加結(jié)果圖像；(d)是圖4(c)二值形態(tài)學(xué)變換圖像。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提出方法的整套操作流程圖如附圖1所示。下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明技術(shù)方案的具體實(shí)施過程加以說明。

步驟1：判斷輸入圖像類型并做出相應(yīng)轉(zhuǎn)換；

依據(jù)實(shí)際應(yīng)用過程所遇情況分析，本發(fā)明首先對輸入圖像做如下相應(yīng)類型轉(zhuǎn)換操作。若輸入圖像為彩色圖像，則比較r、g、b通道灰度圖像的像素點(diǎn)灰度值是否均相等，是則選擇提取r通道灰度圖像作為待處理圖像，否則將原輸入圖像轉(zhuǎn)換成灰度圖像；若輸入圖像為灰度圖像，不做任何類型轉(zhuǎn)換操作。

步驟2：對待處理圖像做灰度形態(tài)學(xué)的高低帽組合變換；

對圖2(a)做灰度形態(tài)學(xué)的高低帽組合變換操作得到結(jié)果圖2(b)。

設(shè)f(x，y)是待處理灰度圖像，b(x，y)是結(jié)構(gòu)元素，定義膨脹、腐蝕運(yùn)算如下：

(fθb)(s，t)＝min{f(s+x，t+y)+b(x，y)|(s+x，t+y)∈df，(x，y)∈db}

定義為輸入圖像f在結(jié)構(gòu)元素是b情況下的閉運(yùn)算。

定義為輸入圖像f在結(jié)構(gòu)元素是b情況下的開運(yùn)算。

定義高低、帽運(yùn)算如下：

top(f，b)＝f-(f·b)

本發(fā)明提出的經(jīng)高低帽組合變換處理后的圖像為f(f)，即：

f(f)＝f+top(f，b)-bottom(f，b)

灰度形態(tài)學(xué)高低帽組合變換能夠使圖像中灰度值較大點(diǎn)向更高灰度級靠近，使圖像中灰度值較小點(diǎn)向更低灰度級靠近。依據(jù)細(xì)胞圖像灰度分布特性，該組合變換能夠增強(qiáng)背景同前景的對比度，有效改善圖像質(zhì)量。

步驟3：差分法結(jié)合背景估計(jì)降低背景噪聲干擾因素；

讀取圖2(b)，求出尺寸大小m×n。對圖2(b)進(jìn)行遍歷，將其所有像素點(diǎn)灰度值累加，得到累加結(jié)果sum，計(jì)算圖2(b)灰度均值avg，公式如下：

同時(shí)創(chuàng)建尺寸為m×n、灰度值為avg的預(yù)估背景圖像。

將圖2(b)同預(yù)估背景圖像做差分法，得到圖2(c)和圖2(d)。

步驟4：采用改進(jìn)k-means聚類算法實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞圖像前景與背景的粗分；

應(yīng)用arthur和vassilvitskii提出的改進(jìn)k-means聚類算法分別對圖2(c)、圖2(d)進(jìn)行細(xì)胞分割，結(jié)果分別為圖3(a)、圖3(b)。

k-means聚類算法，即利用迭代處理過程將輸入數(shù)據(jù)集分類成類間獨(dú)立、類內(nèi)緊湊的聚類集合。算法核心是找到使類內(nèi)方差最小化的聚類中心，即當(dāng)聚類內(nèi)數(shù)據(jù)到聚類中心的平方和距離最小時(shí)所對應(yīng)的聚類中心。本發(fā)明采用改進(jìn)k-means聚類算法，該算法很好的解決了初始種子點(diǎn)的獲取問題，提高了運(yùn)行速度、聚類質(zhì)量。

步驟5：采用面積濾波實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞圖像的去噪；

采用面積濾波分別對圖3(a)、圖3(b)進(jìn)行去除噪聲處理，結(jié)果分別為圖4(a)、圖4(b)。

步驟6：將兩幅基于面積濾波的細(xì)胞結(jié)果像素級相加；

圖4(a)圖4(b)相加結(jié)果如圖4(c)所示。對應(yīng)像素的值相加，公式如下：

i(x，y)＝ia(x，y)+ib(x，y)

步驟7：利用擬合函數(shù)實(shí)現(xiàn)二值形態(tài)學(xué)處理系數(shù)的自適應(yīng)分析；

圖4(c)中目標(biāo)像素點(diǎn)灰度值為1，將圖4(c)進(jìn)行遍歷，統(tǒng)計(jì)灰度值為1的像素點(diǎn)個(gè)數(shù)sum，計(jì)算初始融合度rate，計(jì)算公式如下：

通過origin軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析計(jì)算，得到關(guān)于形態(tài)學(xué)處理系數(shù)par同初始融合度rate之間的擬合函數(shù)關(guān)系，如下：

其中，參數(shù)par為形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)元素的大小。

步驟8：用二值形態(tài)學(xué)的方法對圖像進(jìn)行優(yōu)化；

圖4(c)分割結(jié)果中細(xì)胞部分位置產(chǎn)生斷點(diǎn)，通過二值圖像通用形態(tài)學(xué)運(yùn)算中的膨脹處理將其連接，得到結(jié)果圖4(d)。其中x用b膨脹記作如下公式：

結(jié)果集合d是結(jié)構(gòu)元素b平移后與集合x的交集不為空集的那些結(jié)構(gòu)元素參考點(diǎn)x(x1，x2)的集合。

步驟9：計(jì)算最終融合度；

圖4(d)中細(xì)胞像素點(diǎn)灰度級值為1，將圖4(d)進(jìn)行遍歷，統(tǒng)計(jì)灰度值為1的像素點(diǎn)個(gè)數(shù)sum，得到最終融合度rate，計(jì)算公式如下：

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的原代和前四代由于細(xì)胞密度較小，能較好地分割出圖像中細(xì)胞，而其后代由于細(xì)胞密度較大，細(xì)胞融合現(xiàn)象很嚴(yán)重而較難分割，因此，本文采用第六代的貼壁細(xì)胞圖像(放大40倍)來進(jìn)行圖像分割，分析其融合度。

附圖4(d)是使用了本發(fā)明方法操作的結(jié)果圖，同原始圖像圖2(a)相比較，可以明顯的看出，細(xì)胞得到了很好的分割，融合度誤差在10％以內(nèi)。本發(fā)明所提出的一種貼壁細(xì)胞生長融合度自動(dòng)分析方法，有效解決了細(xì)胞培養(yǎng)過程中傳統(tǒng)生長融合度分析方式帶來誤差較大的問題。實(shí)際應(yīng)用表明，本發(fā)明可以快速、便捷、實(shí)時(shí)、高精度地實(shí)現(xiàn)對培養(yǎng)過程中生長融合度的分析計(jì)算，提高了生物醫(yī)學(xué)行業(yè)融合度自動(dòng)化檢測水平，具有很好的使用價(jià)值。