一株溶藻氣單胞菌及其在控制藍(lán)藻水華中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株溶藻氣單胞菌及其在控制藍(lán)藻水華中的應(yīng)用。從太湖水體中分離獲得了一株具有顯著溶藻活性的氣單胞菌(Aeromonas sp.)GLY?2107，保藏號(hào)為CGMCC No.8979，并且從其代謝產(chǎn)物中分離純化并鑒定出其有效溶藻成分3?苯甲基?哌嗪?2,5?二酮和3?甲基吲哚，其中3?苯甲基?哌嗪?2,5?二酮對(duì)銅綠微囊藻9110的半致死量LD50為4.72μg/mL，3?甲基吲哚對(duì)銅綠微囊藻9110的半致死量LD50為1.10μg/mL?？捎糜谛滦蜕餁⒃鍎┑难邪l(fā)和生產(chǎn)，最終應(yīng)用于湖泊藍(lán)藻水華的控制。CGMCC No.897920140328
【專利說明】
一株溶藻氣單胞菌及其在控制藍(lán)藻水華中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及環(huán)境微生物領(lǐng)域，特別涉及一株具有溶藻活性的氣單胞菌(Aeromonas sp. )GLY-2107及其在藍(lán)藻水華控制中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來太湖、巢湖、滇池等淡水水域都受到了藍(lán)藻水華的嚴(yán)重影響，湖泊富營(yíng)養(yǎng)化 導(dǎo)致的藍(lán)藻水華爆發(fā)對(duì)湖泊水系的污染日益嚴(yán)重。因此探索控制藍(lán)藻生物量和抑制藍(lán)藻水 華發(fā)生的有效途徑是非常必要的。
[0003] 藍(lán)藻水華的控制技術(shù)可歸納為物理方法、化學(xué)方法和生物方法。物理方法如機(jī)械 除藻、電磁場(chǎng)除藻等，可以作為水華爆發(fā)的輔助控制措施，但是缺點(diǎn)在于需要耗費(fèi)大量人力 物力，并且治標(biāo)不治本，處理能力有限；化學(xué)方法如除草劑等化學(xué)殺藻劑可以直接殺死藻 類，但這些化學(xué)物質(zhì)的專一性差，而且容易富集在食物鏈中造成二次污染。
[0004] 而生物處理方法因其環(huán)保、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，受到越來越多的關(guān)注。針對(duì)藍(lán)藻的溶藻細(xì) 菌(algae-lysing bacteria)是一類可以直接(菌藻細(xì)胞接觸)或者間接(分泌胞外物質(zhì))抑 制滅殺藍(lán)藻的細(xì)菌統(tǒng)稱，它們是淡水生態(tài)環(huán)境系統(tǒng)的重要組成部分，對(duì)減少藍(lán)藻的生物量， 維持生態(tài)平衡具有重要作用。
[0005] 因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員致力于篩選高效溶藻細(xì)菌或分離富集溶藻細(xì)菌代謝產(chǎn)生 的高效溶藻活性物質(zhì)，以開發(fā)微生物殺藻劑，用以安全和高效的控制藍(lán)藻水華問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 鑒于現(xiàn)有技術(shù)中物理方法和化學(xué)方法處理能力有限、容易造成二次污染的缺陷， 本發(fā)所要解決的技術(shù)問題是尋找高效溶藻細(xì)菌及分離富集溶藻細(xì)菌代謝產(chǎn)生的高效溶藻 活性物質(zhì)，用以安全和高效的控制藍(lán)藻水華問題。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一株具有溶藻活性的氣單胞菌及其代謝產(chǎn)物在藍(lán) 藻水華控制中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一株具有溶藻活性的氣單胞菌(Aeromonas sp. )GLY-2107，其為革蘭氏陰性，直短桿狀，極生單鞭毛，大小為0.6μπι~1.2μπι X 2. Ομπι~2.5μπι。在營(yíng) 養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)24h后，菌落形態(tài)為圓形，表面光滑扁平，邊緣整齊，白色，菌 落大小為2mm~3mm。經(jīng)16S rRNA基因序列分析和同源性比較，得知其與GenBank中某氣單 胞菌菌株有99 %的同源性，故鑒定為氣單胞菌屬細(xì)菌，命名為氣單胞菌GLY-2107。
[0009] 該菌保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)CGMCC No.8979,保藏日期為2014年3月28日。保藏機(jī)構(gòu)地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院中科院 微生物研究所，郵編：100101，電話:86-10-64807355。該氣單胞菌GLY-2107能發(fā)酵產(chǎn)生3-苯 甲基-哌嗪-2，5-二酮和3-甲基吲哚。
[0010] 進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了上述氣單胞菌GLY-2107在控制藍(lán)藻水華中的應(yīng)用。
[0011] 進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了上述氣單胞菌GLY-2107的發(fā)酵產(chǎn)物在控制藍(lán)藻水華中的 應(yīng)用，其中，發(fā)酵產(chǎn)物可以是發(fā)酵液、發(fā)酵液濃縮物、發(fā)酵液粗提物或發(fā)酵液提取物。
[0012]本發(fā)明的另一方面提供了上述氣單胞菌GLY-2107的發(fā)酵產(chǎn)物中兩種具有溶藻活 性的有效成分3-苯甲基-哌嗪-2,5-二酮和3-甲基吲哚在控制藍(lán)藻水華中的應(yīng)用，這兩周有 效成分分別為具有結(jié)構(gòu)式(I)和(II)所示結(jié)構(gòu)。
[0014] 本發(fā)明的再一方面提供了一種溶藻菌劑，其特征在于，所述溶藻菌劑中包含權(quán)利 要求1所述的氣單胞菌GLY-2107。
[0015] 進(jìn)一步地，本發(fā)明的再一方面提供了一種溶藻藥劑，其特征在于，所述溶藻藥劑中 包含權(quán)利要求1所述的氣單胞菌GLY-2107的發(fā)酵產(chǎn)物，所述發(fā)酵產(chǎn)物為發(fā)酵液、發(fā)酵液濃縮 物、發(fā)酵液粗提物或發(fā)酵液提取物。
[0016] 本發(fā)明的又一方面提供了一種控制藍(lán)藻水華的方法，包括如下步驟：
[0017] 1)、發(fā)酵氣單胞菌GLY-2107菌株；
[0018] 2)、萃取發(fā)酵液；
[0019] 3 )、萃取液蒸干，獲得粗提物；
[0020] 4)、粗提物水溶后用于控制藍(lán)藻水華。
[0021] 優(yōu)選地，步驟1)中，發(fā)酵條件為，氣單胞菌GLY-2107接種于pH 7.0的滅菌牛肉膏蛋 白胨培養(yǎng)基中，28°C、200rpm環(huán)境條件下發(fā)酵48h，得到所述氣單胞菌GLY-2107發(fā)酵液。 [0022]優(yōu)選地，步驟2)中，萃取劑為乙酸乙酯，萃取體系中乙酸乙酯與發(fā)酵液的體積比為 1:1，混合后，放入振蕩器中振蕩24h，分離出的上層乙酸乙酯溶液即氣單胞菌GLY-2107發(fā) 酵液的萃取液。
[0023]優(yōu)選地，步驟3)中的粗提物通過進(jìn)一步提純獲得有效溶藻物質(zhì)，用于控制藍(lán)藻水 華。其中，進(jìn)一步純化可采用柱層析的方法。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述進(jìn)一步純化利用HPLC技術(shù) 純化，將步驟3)中的粗提物加水溶解后使用0.22μπι孔徑濾膜過濾，濾液通過DIKMA公司的 Supersi 1? C18-EP半制備柱，水和甲醇為流動(dòng)相的HPLC進(jìn)行純化，獲得有效溶藻物質(zhì)2107-A和2107-B。
[0024]所述的氣單胞菌GLY-2107的代謝產(chǎn)物中有效的溶藻成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)通過LC-MS、 GC-MG和HMR分析獲得。
[0025] 有效的溶藻成分2107-4的準(zhǔn)分子離子峰為205.0981111/2，樣品分子量為204.0899， 分子式為CiiH12N2〇2，核磁共振氫譜結(jié)果是咕 NMR(600MHz，DMS〇-d6) δ8.15 (1H，s，N-H)，7.89 (lH,s,N-H) ,7.35-7.11 (5H,m,arom) ,4.06( lH,dd,J = 7.3,4.6Ηζ,Η-6) ,3.37( lH,d,J = 2.8Hz,H-3a),3.09(lH,dd,J=13.5,4.5Hz,H-7a),2.88(lH,dd,J=13.5,4.9Hz,H-7b), 2.76(lH，d，J= 17.3Hz，H-3b);有效的溶藻成分2107-B的準(zhǔn)分子離子峰為132.0807m/z，樣 品分子量為131.0735，分子式為(：9!1必，核磁共振氫譜結(jié)果是1!1匪1?(60010^，0)(：1 3)67.78 (lH，s，N-H)，7.51(lH，d，J = 7.9Hz，H-4)，7.26(lH，d，J = 8.1Hz，H-7)，7.14-7.09(lH，m，H-6)，7.07-7.03(lH，m，H-5)，6.88(lH，d，J = 1.0Hz，H-2)，2.26(3H，d，J = l.lHz，Me)。
[0026]有效的溶藻成分2107-A是所述氣單胞菌GLY-2107的代謝產(chǎn)物3-苯甲基-哌嗪-2， 5_二酮，有效的溶藻成分2107-B是所述氣單胞菌GLY-2107的代謝產(chǎn)物3-甲基吲哚。
[0027]本發(fā)明的氣單胞菌GLY-2107的溶藻效果具有廣譜性。其發(fā)酵液制備方法簡(jiǎn)單，制 備周期短。氣單胞菌GLY-2107的發(fā)酵液對(duì)太湖中的銅綠微囊藻9110、聚球藻BN60、綠藻B1、 顫藻BN35等具有很好的溶藻效果，而銅綠微囊藻是太湖藍(lán)藻水華中的一種優(yōu)勢(shì)藍(lán)藻。氣單 胞菌GLY-2107發(fā)酵液和乙酸乙酯萃取液均可用于藍(lán)藻水華或其它微藻的控制，且溶藻效果 較好。其中，氣單胞菌GLY-2107發(fā)酵液對(duì)銅綠微囊藻9110的6天溶藻率達(dá)到96.5± 1.1%，對(duì) 綠藻B1的6天溶藻率達(dá)到93.7 ± 0.8 %，對(duì)綠色微囊藻FACHB-979的6天溶藻率達(dá)到91.3 土 2.1 %。氣單胞菌GLY-2107的代謝產(chǎn)物3-苯甲基-哌嗪-2,5-二酮和3-甲基吲哚對(duì)太湖藍(lán)藻 水華中的優(yōu)勢(shì)藍(lán)藻銅綠微囊藻9110具有較好的致死作用，3-苯甲基-哌嗪-2,5-二酮對(duì)銅綠 微囊藻9110的半致死量0)50為4.72以8/111^3-甲基吲哚對(duì)銅綠微囊藻9110的半致死量0)50 為l.lOyg/mL，因此，可用于新型殺藻劑的研發(fā)和生產(chǎn)，最終應(yīng)用于湖泊藍(lán)藻水華的控制。 [0028]以下將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的氣單胞菌GLY-2107菌株及其代謝產(chǎn)物3-苯甲基-哌 嗪-2,5-二酮和3-甲基吲哚在藍(lán)藻水華控制中的效果作進(jìn)一步說明，以充分地了解本發(fā)明 的目的、特征和效果。
【附圖說明】
[0029]圖1是溶藻菌GLY-2107對(duì)銅綠微囊藻9110的溶藻效果；
[0030]圖2是溶藻菌GLY-2107的發(fā)酵液乙酸乙酯萃取液加入到銅綠微囊藻9110藻平板上 的溶藻效果(右邊為空白對(duì)照）；
[0031] 圖3是溶藻物質(zhì)3-苯甲基-哌嗪-2，5_二酮和3-甲基吲哚分別加入到銅綠微囊藻 9110藻平板上的溶藻效果(最右邊為空白對(duì)照）；
[0032] 圖4是溶藻物質(zhì)3-苯甲基-哌嗪-2,5-二酮和3-甲基吲哚分別加入到藻液中對(duì)銅綠 微囊藻9110的溶藻效果。
【具體實(shí)施方式】
[0033]實(shí)施例1溶藻細(xì)菌的篩選
[0034]將太湖梅梁灣水域采集的5mL自然水樣加入到95mL對(duì)數(shù)期的銅綠微囊藻9110的藻 液中。藻液黃化后，經(jīng)梯度稀釋并涂牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基瓊脂平板，28°C培養(yǎng)24h，取菌落密 度適中的平板，按照菌落形態(tài)的不同挑選不同菌株。
[0035]將篩選出來的菌株分別接種入8mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，28°C，220rpm培養(yǎng)24h， 將lmL培養(yǎng)好的菌液分別加入99mL對(duì)數(shù)期銅綠微囊藻的藻液中。另外將lmL滅菌后的牛肉膏 蛋白胨培養(yǎng)基同樣加入99mL藻液中作為對(duì)照。所有實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的藻液在光照培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)6天后計(jì)算其溶藻效率，選取了其中具有較高溶藻效率的一株細(xì)菌進(jìn)行進(jìn)一步研究，該 菌株代號(hào)為GLY-2107。
[0036]藻液培養(yǎng)條件:銅綠微囊藻9110用BG11液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，放置于光照培養(yǎng)箱中，25 °C，光照強(qiáng)度40μπιο1 photons m-S-1，光暗周期比為12h:12h(光照：黑暗）。
[0037]溶藻效率計(jì)算方法:溶藻效率（％ )=(對(duì)照組藻細(xì)胞密度-實(shí)驗(yàn)組藻細(xì)胞密度)/對(duì) 照組藻細(xì)胞密度X 100。其中銅綠微囊藻的藻細(xì)胞密度用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定。
[0038]圖1為加入溶藻菌GLY-2107時(shí)銅綠微囊藻9110細(xì)胞濃度隨時(shí)間的變化曲線（溶藻 菌 GLY-2107(2X104cells/mL)(A)和空白對(duì)照（_))。
[0039]實(shí)施例2氣單胞菌GLY-2107菌株的鑒定
[0040]用形態(tài)觀察、染色、生理生化反應(yīng)、16srRNA基因序列分析等方法對(duì)溶藻效果較強(qiáng) 的GLY-2107進(jìn)行鑒定，該菌株為革蘭氏陰性，直短桿狀，極生單鞭毛，大小為0 · 6μπι~1 · 2μπι X 2. Ομπι~2.5μπι。在營(yíng)養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)24h后，菌落形態(tài)為圓形，表面光滑扁 平，邊緣整齊，白色，菌落大小為2mm~3mm。經(jīng)16S rRNA基因序列分析和同源性比較，得知其 與GenBank中某氣單胞菌菌株有99%的同源性，故鑒定為氣單胞菌屬細(xì)菌，命名為氣單胞 菌GLY-2107。該菌種已經(jīng)保藏于國(guó)家微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào) 為CGMCC No.8979,保藏日期為2014年3月28日。保藏機(jī)構(gòu)地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào) 院中科院微生物研究所，郵編：100101，電話：86-10-64807355。該菌種的16srRNA基因在 GenBank中的登錄號(hào)是KP717443。
[00411實(shí)施例3氣單胞菌GLY-2107發(fā)酵液及其乙酸乙酯萃取液的制備方法 [0042]將氣單胞菌GLY-2107按照1%接種量接種于滅菌牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，28°C下 220rpm搖床培養(yǎng)48h后得到氣單胞菌GLY-2107發(fā)酵液。將乙酸乙酯按照1:1的比例加入發(fā)酵 液中，放入振蕩器中振蕩24h，分離出上層溶液，即乙酸乙酯萃取液。將乙酸乙酯蒸干，加水 溶解，再使用〇.22μπι孔徑的微孔濾膜過濾后用于進(jìn)一步純化代謝產(chǎn)物。
[0043]實(shí)施例4氣單胞菌GLY-2107對(duì)不同藍(lán)藻和真核藻類的溶藻效果
[0044]將8份培養(yǎng)好的（培養(yǎng)條件：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，28°C，220rpm培養(yǎng)24h)lmL氣單 胞菌GLY-2107菌液分別加入8株藍(lán)藻和真核藻(表1)的藻液中（99mL，所有藻液均培養(yǎng)到對(duì) 數(shù)期），同樣使用lmL無菌牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基分別加入8種藻液中（99mL，所有藻液均培養(yǎng) 到對(duì)數(shù)期)作為對(duì)照（1:99)，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6天后分別測(cè)定所有實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的藻 液的葉綠素濃度，計(jì)算其溶藻效率。每個(gè)樣品測(cè)三個(gè)平行樣，表示成平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形 式。
[0045] 實(shí)驗(yàn)中用到的藻種有3株購(gòu)自武漢水生所藻種庫(kù)，另外5株篩選自太湖水體。實(shí)驗(yàn) 結(jié)果表明，氣單胞菌GLY-2107的發(fā)酵液對(duì)于絕大部分原核藻種具有很好的溶藻效果，對(duì)色 球藻FACHB-191沒表現(xiàn)出很好的溶藻效果(表1)。此結(jié)果表明氣單胞菌GLY-2107的溶藻能力 具有廣譜性，是一種非常有潛力的溶藻細(xì)菌。
[0046] 表1.氣單胞菌GLY-2107對(duì)8株藻株的溶藻效果
[0048]注:表中用星號(hào)(*)標(biāo)記的藻株是從太湖無錫梅梁灣水體中篩選得到的，其余藻株 都是購(gòu)買自中國(guó)淡水藻種庫(kù)。
[0049]氣單胞菌GLY-2107對(duì)太湖藍(lán)藻水華中的優(yōu)勢(shì)藍(lán)藻銅綠微囊藻9110的溶藻效果如 圖1所示。圖1表明，加入氣單胞菌GLY-2107后，銅綠微囊藻9110細(xì)胞濃度隨時(shí)間的延長(zhǎng)而下 降，第六天時(shí)的溶藻率為96.5 %。而空白對(duì)照中銅綠微囊藻9110細(xì)胞濃度隨時(shí)間的延長(zhǎng)而 上升。其中氣單胞菌GLY-2107的起始濃度為2 X104cells/mL。
[0050]實(shí)施例5 GLY-2107菌株溶藻方式的研究
[0051]將氣單胞菌GLY-2107發(fā)酵液按照步驟3所述的方法制成乙酸乙酯萃取液，用離心 干燥器蒸干后，用無菌水溶解后備用。最后把滅菌牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基同樣離心干燥濃縮 作為對(duì)照。將按照上述方法制得的萃取液以及濃縮牛肉膏蛋白胨對(duì)照分別加到圓紙片(直 徑5mm)上，放置于銅綠微囊藻制成的BG11固體平板上。藻平板放入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天后 觀察圓紙片周圍的抑藻圈的形成以判斷其溶藻效果。
[0052]銅綠微囊藻瓊脂平板的制作方法：向每塊平板上倒入適量(約20mL)BGll瓊脂培養(yǎng) 基(瓊脂比例1.5%)，待其凝固后備用。將300mL培養(yǎng)好的銅綠微囊藻藻液4000g離心20min 后棄掉上清，收集藻細(xì)胞沉淀加入到l〇〇mL滅菌后的BG11軟瓊脂固體培養(yǎng)基中（1 %瓊脂，放 置于53°C水浴中防止凝固），搖勻后倒入制好的BG11固體平板上層(每塊平板約倒入20mL)， 待其凝固后放入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并備用。
[0053]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，顯示氣單胞菌GLY-2107的發(fā)酵液萃取液有很好的溶藻效果， 這表明該菌株具有分泌胞外溶藻物質(zhì)進(jìn)行溶藻的性能。
[0054]實(shí)施例6氣單胞菌GLY-2107發(fā)酵產(chǎn)物中溶藻有效成分的提取純化
[0055]利用HPLC技術(shù)將溶藻菌GLY-2107的溶藻代謝產(chǎn)物純化，得到兩種具有溶藻功能的 純化物質(zhì)2107-A和2107-B，具體步驟如下：
[0056] 將氣單胞菌GLY-2107發(fā)酵液的萃取液通過DIKMA公司的Supersil? C18-EP半制備 柱，水和甲醇為流動(dòng)相的HPLC技術(shù)手段進(jìn)行初步純化，得到溶藻有效成分。然后通過DIKMA Supersi 1? C18-EP分析柱，水和甲醇為流動(dòng)相的HPLC技術(shù)手段進(jìn)行進(jìn)一步純化，得到兩種 有效溶藻成分2107-A和2107-B，用于結(jié)構(gòu)鑒定。
[0057]實(shí)施例7氣單胞菌GLY-2107代謝產(chǎn)物中溶藻有效成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定
[0058]利用LC-MS、GC-MG和HMR分析(核磁共振氫譜分析)具有溶藻功能的代謝產(chǎn)物的化 學(xué)結(jié)構(gòu)。
[0059] 將純化后的樣品2107-A進(jìn)行LC-MS分析，得到樣品2107-A的準(zhǔn)分子離子峰為 205.0981m/z，樣品分子量為 204.0899，分子式為 CnH12N2〇2。
[0060] 將純化后的樣品2107-A進(jìn)行GC-MS分析，與GC-MS數(shù)據(jù)庫(kù)中3-苯甲基-哌嗪-2，5-二 酮的結(jié)構(gòu)相似，相似性指數(shù)>900。
[0061] 將樣品2107A進(jìn)行核磁共振氫譜分析，得到以下結(jié)果：
[0062] 4 Mffi(600MHz，DMS0-d6)S8.15(lH，s，N-H),7.89(lH，s，N-H),7.35-7.11(5H，m， arom), 4.06( lH,dd,J = 7.3,4.6Hz,H-6), 3.37( lH,d,J = 2.8Hz,H-3a) ,3.09( lH,dd,J = 13.5,4.5Hz,H-7a),2.88(lH,dd,J=13.5,4.9Hz,H-7b),2.76(lH,d,J=17.3Hz,H-3b)〇
[0063] 將樣品2107-A的LC-MSXC-MS和NMR結(jié)果進(jìn)行分析，可以確定具有溶藻效果的代謝 產(chǎn)物2107-A是3-苯甲基-哌嗪-2，5-二酮，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如下式所示。
[0064] 將純化后的樣品210 7 -B進(jìn)行LC-MS分析，得到樣品210 7-B的準(zhǔn)分子離子峰為 132.0807m/z，樣品分子量為131.0735，分子式為C9H9N。
[0065] 將純化后的樣品2107-B進(jìn)行GC-MS分析，其中2107-B與GC-MS數(shù)據(jù)庫(kù)中3-甲基吲哚 的結(jié)構(gòu)相似，相似性指數(shù)>900。
[0066]將樣品2107-B進(jìn)行核磁共振氫譜分析，得到以下結(jié)果：
[0067] ΧΗ NMR(600MHz,CDCl3)57.78(lH,s,N-H),7.51(lH,d,J = 7.9Hz,H-4),7.26(lH,d, J = 8.1Hz,H-7),7.14-7.09(lH,m,H-6),7.07-7.03(lH,m,H-5),6.88(lH,d,J=1.0Hz,H-2),2.26(3H,d ,J = l.lHz,Me)〇
[0068] 將樣品2107-B的LC-MSXC-MS和NMR結(jié)果進(jìn)行分析，可以確定具有溶藻效果的代謝 產(chǎn)物2107-B是3-甲基吲哚，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如下式所示。
[0070] 實(shí)施例8氣單胞菌GLY-2107溶藻代謝產(chǎn)物3-苯甲基-哌嗪-2，5_二酮和3-甲基吲哚 的溶藻效能研究
[0071] 使用上述GLY-2107菌株溶藻方式的研究中的方法，經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)3-苯甲基-哌嗪-2， 5-二酮和3-甲基吲哚在銅綠微囊藻制成的BG11固體平板上能形成明顯的抑藻圈，而空白對(duì) 照則不會(huì)形成抑藻圈（圖3)。
[0072] 3-苯甲基-哌嗪-2,5-二酮和3-甲基吲哚分別加入太湖的優(yōu)勢(shì)藍(lán)藻銅綠微囊藻 9110中，使3-苯甲基-哌嗪-2,5-二酮和3-甲基吲哚的濃度分別形成一個(gè)系列：50yg/mL、40y g/mL、30yg/mL、20yg/mL、1Oyg/mL、5·Oyg/mL、4·Oyg/mL、3·Oyg/mL、2·5yg/mL、2·Oyg/mL、1·5 yg/mL、1 · 0yg/mL、0 · 8yg/mL、0 · 6yg/mL、0 · 4yg/mL、0 · 2yg/mL和0 · lyg/mL。將加入3_苯甲基- 哌嗪-2,5-二酮或3-甲基吲哚的銅綠微囊藻9110放入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后測(cè)定溶藻 率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3-苯甲基-哌嗪-2，5-二酮對(duì)銅綠微囊藻9110的半致死量LD50為4.72yg/ mL;3-甲基吲哚對(duì)銅綠微囊藻9110的半致死量LD50為1.10yg/mL(圖4)。此結(jié)果表明氣單胞 菌GLY-2107的代謝產(chǎn)物3-苯甲基-哌嗪-2,5-二酮和3-甲基吲哚是十分有效的控制藍(lán)藻的 物質(zhì)。
[0073]圖4中顯示了加入不同濃度溶藻物質(zhì)3-苯甲基-哌嗪-2,5-二酮和不同濃度溶藻物 質(zhì)3-甲基吲哚時(shí)銅綠微囊藻9110存活率變化曲線。
[0074]本發(fā)明的氣單胞菌GLY-2107的溶藻效果具有廣譜性。其發(fā)酵液制備方法簡(jiǎn)單，制 備周期短。氣單胞菌GLY-2107的發(fā)酵液對(duì)太湖中的銅綠微囊藻9110、聚球藻BN60、綠藻B1、 顫藻BN35等具有很好的溶藻效果，而銅綠微囊藻是太湖藍(lán)藻水華中的一種優(yōu)勢(shì)藍(lán)藻。氣單 胞菌GLY-2107發(fā)酵液和乙酸乙酯萃取液均可用于藍(lán)藻水華或其它微藻的控制，且溶藻效果 較好。其中，氣單胞菌GLY-2107發(fā)酵液對(duì)銅綠微囊藻9110的6天溶藻率達(dá)到96.5±1.1%。氣 單胞菌GLY-2107的代謝產(chǎn)物3-苯甲基-哌嗪-2,5-二酮和3-甲基吲哚對(duì)太湖藍(lán)藻水華中的 優(yōu)勢(shì)藍(lán)藻銅綠微囊藻9110具有較好的致死作用，可用于新型殺藻劑的研發(fā)和生產(chǎn)，最終應(yīng) 用于湖泊藍(lán)藻水華的控制。
[0075]以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的較佳具體實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員無 需創(chuàng)造性勞動(dòng)就可以根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思作出諸多修改和變化。因此，凡本技術(shù)領(lǐng)域中技術(shù) 人員依本發(fā)明的構(gòu)思在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上通過邏輯分析、推理或者有限的實(shí)驗(yàn)可以得到的 技術(shù)方案，皆應(yīng)在由權(quán)利要求書所確定的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株具有溶藻活性的氣單胞菌(Aeromonas sp. )GLY-2107,保藏于中國(guó)微生物菌種 保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)CGMCC No.8979，保藏日期為2014年3月28日，所述 氣單胞菌GLY-2107能發(fā)酵產(chǎn)生3-苯甲基-哌嗪-2，5_二酮和3-甲基吲哚。2. 如權(quán)利要求1所述的氣單胞菌GLY-2107在控制藍(lán)藻水華中的應(yīng)用。3. 如權(quán)利要求1所述的氣單胞菌GLY-2107的發(fā)酵產(chǎn)物在控制藍(lán)藻水華中的應(yīng)用。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的氣單胞菌GLY-2107產(chǎn)生的具有結(jié)構(gòu)式I和II所示結(jié)構(gòu)的化合 物3-苯甲基-哌嗪-2，5_二酮和3-甲基吲哚在控制藍(lán)藻水華中的應(yīng)用。5. -種溶藻菌劑，其特征在于，所述溶藻菌劑中包含權(quán)利要求1所述的氣單胞菌GLY-2107。6. -種溶藻藥劑，其特征在于，所述溶藻藥劑中包含權(quán)利要求1所述的氣單胞菌GLY-2107 的發(fā)酵產(chǎn)物，所述發(fā)酵產(chǎn)物為發(fā)酵液、發(fā)酵液濃縮物、發(fā)酵液粗提物或發(fā)酵液提取物。7. -種控制藍(lán)藻水華的方法，包括如下步驟： 1 )、發(fā)酵權(quán)利要求1所述的氣單胞菌GLY-2107; 2) 、萃取發(fā)酵液； 3) 、萃取液蒸干，獲得粗提物； 4) 、粗提物水溶后用于控制藍(lán)藻水華。8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其中步驟1)中，發(fā)酵條件為，氣單胞菌GLY-2107接種于pH 7.0的滅菌牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，28°C、220rpm環(huán)境條件下發(fā)酵48h，得到所述氣單胞菌 GLY-2107發(fā)酵液。9. 如權(quán)利要求7所述的方法，其中步驟2)中，萃取劑為乙酸乙酯，乙酸乙酯與發(fā)酵液的 體積比為1:1。10. 如權(quán)利要求7所述的方法，其中，步驟3)中的粗提物通過進(jìn)一步提純獲得有效溶藻 物質(zhì)，用于控制藍(lán)藻水華。
【文檔編號(hào)】C12R1/01GK105950500SQ201610318656
【公開日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年5月13日
【發(fā)明人】楊虹, 郭星亮
【申請(qǐng)人】上海交通大學(xué)