一種同時測定食品中5種氨基糖苷類藥物殘留量的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種可同時檢測多種氨基糖苷類抗生素殘留量的測定技術方法，具體 地說是鏈霉素、雙氫鏈霉素、卡那霉素、壯觀霉素、慶大霉素5種氨基糖苷類藥物殘留量測定 方法，屬于色譜檢測技術領域。
【背景技術】
[0002] 氨基糖苷類抗生素 (aminoglycoside antibiotics，AGs)是由氨基糖與氨基環(huán)醇 形成的苷。自1944年Waksman等發(fā)現(xiàn)鏈霉菌產生鏈霉素以來，氨基糖苷類抗生素的研究與開 發(fā)已經過了半個多世紀。由于該類藥物具有性質穩(wěn)定、抗菌譜廣、殺菌力強、水溶性好，排泄 迅速完全，對許多致病菌有抗生素后效應，目前在臨床上仍然是重要的抗感染藥，廣泛用于 各種革蘭陰性菌感染和結核病的治療。但是，由于AGs藥物具有耳毒性和腎毒性等毒副作 用，且極易產生耐藥性，歐盟明確規(guī)定禁止將AGs藥物作為畜禽促生長添加劑使用；美國及 我國對動物源性食品中該類藥物的殘留監(jiān)控都極為關注。
[0003] 目前，AGs的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法、液相色譜法、氣相色譜-質譜法和液相色 譜-串聯(lián)質譜法。酶聯(lián)免疫法作為AGs的篩查方法，有著快速、高效、高通量等儀器方法不可 比擬的優(yōu)勢。AGs抗生素結構中不含共輒雙鍵，缺少發(fā)色基團，但結構中含有較多的活性或 極性基團可供設計衍生化檢測方法或分離方法。采用液相色譜法檢測AGs，一般需要柱前或 柱后衍生化，熒光檢測器檢測。另外，由于該類化合物易溶于水，極性強，在C18柱上保留很 弱，通常需要在流動相中加入改性劑，增加目標物在柱子上的保留。目前，使用最多的是通 過加入離子對試劑來增強保留。絕大多數(shù)的液相色譜-串聯(lián)質譜檢測AGs的方法中，也都采 用離子對試劑增加化合物的保留和響應。但離子對試劑在質譜檢測中有離子抑制作用，一 旦使用了離子對試劑，很難沖洗干凈，嚴重干擾儀器對其他化合物的檢測。
[0004] 在以上AGs的幾種檢測方法中，酶聯(lián)免疫法由于簡單快速的優(yōu)勢，作為定性篩查方 法應用較為普遍;液相色譜法和氣相色譜-質譜法前處理都需要衍生化，操作復雜，靈敏度 也很難達到要求，應用越來越少;液相色譜-串聯(lián)質譜法相對而言，靈敏度更高，選擇性更 強，而且不需要衍生化，但由于離子對試劑的加入，對其他化合物的干擾問題嗜待解決。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種可以同時測定食品中鏈霉素、雙氫鏈霉 素、卡那霉素、壯觀霉素、慶大霉素5種氨基糖苷類藥物殘留量的測定方法，以彌補現(xiàn)有技術 的不足。
[0006] 本發(fā)明所要解決的另一個技術問題是提供一種儀器分析方法，以解決現(xiàn)有方法中 由于離子對試劑的加入，對其他化合物檢測的干擾問題。
[0007] 本發(fā)明的測定首先是對樣品的前處理的補充和改進。目前的文獻報道及相關檢測 標準中，氨基糖苷類抗生素的提取基本都采用磷酸溶液或磷酸鹽緩沖液提取，三氯乙酸除 蛋白，采用離子交換型固相萃取小柱凈化。但是由于離子交換型固相萃取小柱較難平衡，操 作有一定難度，容易造成方法重現(xiàn)性差、檢測結果準確度不高的問題。本發(fā)明采用在磷酸鹽 緩沖提取液中加入離子對試劑的方法，使得氨基糖苷類化合物與離子對試劑輒合，極性降 低，然后直接采用C18柱凈化，大大降低了前處理的操作難度，提高了方法的重現(xiàn)性和準確 性。
[0008] 本發(fā)明的測定通過采用一種集傳統(tǒng)反相色譜柱的作用和離子交換功能于一體的 混合色譜柱，使得色譜體系采用與質譜兼容更好的流動相體系，而不需要采用離子對試劑， 就可以很好的分離氨基糖苷類藥物，而且峰形良好、靈敏度良好。
[0009] 本發(fā)明的測定方法包括如下步驟：
[0010] ⑴提取
[0011]稱取打碎后的樣品至離心管中，加入提取液，均質、混勻、離心，上清液轉移至另一 新的離心管中，在提取液中加入正已烷，蝸旋振蕩混勻，離心，棄去上層液體，取下層提取液 過柱凈化。
[0012] ⑵凈化
[0013] 提取液加貯液器中通過預處理過的SPE柱，待液體完全流出后，用水淋洗小柱，棄 去所有流出液，正壓吹干，最后用甲醇洗脫，收集洗脫液至氮吹管，50°C水浴氮氣吹干， 1. 〇ml流動相蝸旋溶解，過0.22μπι濾膜至進樣小瓶，供高效液相色譜一串聯(lián)質譜儀測定。
[0014] (3)配制基質標準工作溶液
[0015]將空白樣品按上述步驟（1)、（2)處理，用該空白樣品基質溶液在50~lOOOyg/L范 圍內，配制至少五個濃度的氨基糖苷系列基質標準工作溶液；
[0016 ] (4)液相色譜-串聯(lián)質譜法(LC-MS/MS)測定
[0017] 質譜檢測使用多反應監(jiān)測掃描模式，鏈霉素的母離子582.4,子離子分別為263.3 和407.4，雙氫鏈霉素的母離子584.3，子離子分別為263.3和409.3，卡那霉素的母離子 485.3，子離子分別為163.2和324.2 ;壯觀霉素的母離子333.3，子離子分別為140.2和 189.2;慶大霉素的母離子478.4，子離子分別為205.2和160.2。
[0018] a)定量測定:將步驟(3)中系列基質標準工作液進行LC-MS/MS測定，以基質標準工 作液的色譜峰面積對其相應濃度進行回歸分析，得到標準工作曲線;在相同條件下將步驟 (2)中樣品液注入LC-MS/MS進行測定，測得樣品液中氨基糖苷類化合物的色譜峰面積，代入 標準曲線，得到樣品液中氨基糖苷類藥物含量，然后根據(jù)樣品液所代表試樣的質量計算得 到樣品中氨基糖苷類藥物殘留量；
[0019] b)定性測定:檢測步驟(2)中樣品液中目標化合物母離子和子離子對，若其離子色 譜峰保留時間與標準工作溶液一致;且樣品液中目標化合物的兩個子離子的相對豐度與濃 度相當基質標準溶液的相對豐度偏差滿足歐盟657指令的要求時，則判斷該樣品中存在該 種目標化合物;若上述兩個條件不能同時滿足，則判斷不含該種目標化合物。
[0020] 上述步驟(1)中提取液為10mL磷酸鹽緩沖液(PH= 2.0，含50mM庚烷磺酸鈉、25mM磷 酸三鈉，用磷酸調PH值至2.0)。
[0021 ] 上述步驟（1)中正己烷體積為10mL。
[0022] 上述步驟(2)中固相萃取小柱為C18。
[0023] 上述步驟(2)中樣品通過SPE時流速要< 3ml/min。
[0024] 上述步驟(2)中SPE小柱用5ml甲醇、5ml水預處理。
[0025] 上述步驟(2)甲醇洗脫體積為5mL。
[0026] 上述步驟(4)中液相色譜的流動相為A:乙腈，流動相B:1 %甲酸水溶液(含10mM甲 酸銨），流速〇.5mL/min，進樣量10yL。
[0027] 上述步驟(4)中液相色譜使用梯度洗脫的方法，梯度洗脫的程序為： Γηηοο?
[0030] 上述步驟(4)中液相色譜的色譜柱為Obelise R，該色譜柱具有傳統(tǒng)反相色譜柱功 能及離子交換功能。柱溫為30°C。
[0031] 上述步驟(4)中質譜檢測使用電噴霧質譜檢測，離子源：電噴霧離子源;掃描方式： 正離子掃描;檢測方式：多重反應監(jiān)測(MRM);電噴霧電壓:5500V;霧化氣壓力:0.344MPa;氣 簾氣壓力:0.172MPa;輔助氣流速:0.413MPa;離子源溫度:550°C。
[0032] 上述步驟(1)和(2)中的渦旋振蕩時間lmin。
[0033] 上述步驟(1)~(4)中樣品接觸到的包括離心管在內的容器均應為塑料材質制成。
[0034] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0035] 本發(fā)明采用具有傳統(tǒng)反相柱和離子吸附兩種作用的色譜柱，建立了一種不需要在 流動相中加入離子對試劑的液相色譜-串聯(lián)質譜方法，有效解決了離子對試劑在質譜檢測 中對其他化合物的影響，同時通過優(yōu)化前處理方法，解決了AGs化合物由于極性大、易吸附 造成的回收率低的難題。
[0036]本發(fā)明能有效降低食品中鏈霉素、雙氫鏈霉素、卡那霉素、壯觀霉素、慶大霉素殘 留檢測中的基質干擾，采用優(yōu)化的前處理方法和色譜條件，結合串聯(lián)質譜檢測器應用于食 品中鏈霉素、雙氣鏈霉素、卡那霉素、壯觀霉素、慶大霉素定性確證和定量檢測，平均回收率 63.5%~76.4%，相對標準偏差(1?0)為7.9%~13.5%，定量限為5(^8/1^。
[0037] 本發(fā)明具有操作簡便、準確、靈敏度高及重復性好的優(yōu)點。完全能滿足我國和歐 盟、美國、日本對相應產品安全檢測的技術要求，將為保障我國人民食品安全及對外出口貿 易健康發(fā)展提供有力的技術支撐。
【附圖說明】
[0038] 圖1為以魚為基質，濃度為50.0ng/mL的鏈霉素多反應監(jiān)測色譜圖。
[0039] 圖2為以魚為基質，濃度為50.0ng/mL的雙氫鏈霉素多反應監(jiān)測色譜圖。
[0040]圖3為以魚為基質，濃度為50.0ng/mL的卡那霉素多反應監(jiān)測色譜圖。
[0041 ]圖4為以魚為基質，濃度為50.0ng/mL的壯觀霉素多反應監(jiān)測色譜圖。
[0042]圖5為以魚為基質，濃度為50.Ong/mL的慶大霉素多反應監(jiān)測色譜圖。
【具體實施方式】
[0043]現(xiàn)以以下實施實例來說明本發(fā)明，但并不是限制本發(fā)明的范圍。
[0044]實施例中使用的儀器與試劑如下：
[0045] CR21GIII型高速冷凍離心機(Hitachi，Japan) ;MS3型旋渦混合器（IKA，Germany); 1290快速高效液相色譜(Agilent，USA)-5500三重四極桿質譜儀(AB Sciense，USA);C18固 相萃取柱(J.T.Baker，USA)。
[0046] 試劑：甲醇、乙腈(HPLC級，Merke，Germany);甲酸銨（HPLC級，CNW，Germany);庚燒 磺酸鈉、磷酸、磷酸三鈉(分析純，均購自國藥集團化學試劑有限公司）。
[0047] 標準物質:鏈霉素，純度大于96% ;雙氫鏈霉素，純度大于99 % ;卡