專(zhuān)利名稱(chēng)：一種熒光標(biāo)記的氨基糖苷類(lèi)腺苷修飾酶及其檢測(cè)抗生素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種熒光標(biāo)記的氨基糖苷類(lèi)腺苷修飾酶及其檢測(cè)抗生素的方法，主要用于食品安全、醫(yī)療衛(wèi)生和環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域的抗生素藥物殘留的檢測(cè)和定量分析。
背景技術(shù)：
自1940年青霉素發(fā)現(xiàn)以來(lái)，數(shù)以千計(jì)的抗生素被開(kāi)發(fā)用以傳染性疾病的臨床治療，挽救了無(wú)數(shù)人的生命。但是隨著抗生素廣泛而大量地使用，許多細(xì)菌已經(jīng)對(duì)它的對(duì)手產(chǎn)生了耐藥性，很多藥物不再像以前那樣有效，甚至產(chǎn)生毒副作用。2010年8月11日，世界著名醫(yī)學(xué)期刊《柳葉刀》刊文報(bào)道，帶有一種特殊基因NDM-1 (新德里一號(hào)金屬酶)的腸桿菌科細(xì)菌，對(duì)絕大多數(shù)常用抗生素耐藥[Kumarasamy K K, et al., The Lancet InfectiousDiseases, 2010， 9， 597—602， French G L， International Journal of AntimicrobialAgents, 2010，36，S3-S7]。該報(bào)道立即引起廣泛關(guān)注，媒體稱(chēng)之為“超級(jí)細(xì)菌”。隨著全球感染人數(shù)的不斷增加，引起人們對(duì)其全球蔓延趨勢(shì)的擔(dān)憂(yōu)甚至恐慌。其實(shí)耐藥型的細(xì)菌并非新事物，它們一直存在并且隨著人類(lèi)濫用抗生素而進(jìn)化出強(qiáng)大耐藥性，在這場(chǎng)特殊博弈中，人類(lèi)是超級(jí)細(xì)菌的幕后推手?？股氐臑E用是一個(gè)全球性的問(wèn)題，特別是中國(guó)已成為世界上濫用抗生素最為嚴(yán)重的國(guó)家之一。據(jù)2006-2007年度衛(wèi)生部全國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，全國(guó)醫(yī)院抗菌藥物年使用率高達(dá)74%。而在美英等發(fā)達(dá)國(guó)家，醫(yī)院的抗生素使用率僅為22% 25%。中國(guó)的住院患者中，抗生素的使用率則高達(dá)70%，其中外科患者幾乎人人都用抗生素，比例高達(dá)97%。我國(guó)每年因藥物不良反應(yīng)死亡20萬(wàn)人，其中因?yàn)E用抗生素死亡人數(shù)就達(dá)8萬(wàn)人[Andreas H, et al., The Lancet, 2009, 373, 30]。除了醫(yī)療衛(wèi)生，動(dòng)植物養(yǎng)殖，食品以及水質(zhì)、環(huán)境中抗生素的濫用也日益嚴(yán)重，其影響不容小覷，特別是動(dòng)物源性食品中抗生素嚴(yán)重超標(biāo)，長(zhǎng)期食用有抗食品，可在體內(nèi)積累，抗生素的負(fù)作用會(huì)使身體器官受損，破壞體內(nèi)的正常菌群，致使消費(fèi)者的耐藥性在不知不覺(jué)中增強(qiáng)，等于在人體內(nèi)埋下“隱形炸彈”，將來(lái)一旦患病，很可能無(wú)藥可醫(yī)[Broughton E I, et al., Food Policy, 2010, 35,471-478]。瑞典傳染病控制研究所的安德里亞斯.赫迪尼(Andreas Heddini)警告說(shuō),如果濫用抗生素的勢(shì)頭不能得到有效遏制，人類(lèi)很可能重返前抗生素時(shí)代。世界衛(wèi)生組織已成立了慎用抗生素聯(lián)盟，其成員包括90多個(gè)國(guó)家，各國(guó)采取嚴(yán)厲的手段限制使用抗生素。我國(guó)主管部門(mén)也加強(qiáng)了對(duì)抗生素使用的監(jiān)管，例如，國(guó)家藥監(jiān)局規(guī)定在零售藥店銷(xiāo)售必須憑執(zhí)業(yè)醫(yī)師處方才能銷(xiāo)售抗生素類(lèi)處方藥，對(duì)食品、水質(zhì)環(huán)境中抗生素類(lèi)藥品所占的比例限定標(biāo)準(zhǔn)；加強(qiáng)藥物、食品中抗生素的檢測(cè)。這些措施在促進(jìn)抗生素合理使用方面發(fā)揮了一定的作用。目前食品、環(huán)境中常 用的抗生素檢測(cè)方法為高效液相色譜、串聯(lián)質(zhì)譜方法，這些方法比較標(biāo)準(zhǔn)，具有分離能力強(qiáng)和較高的靈敏度，但是都要用到大型昂貴儀器，如色譜儀、質(zhì)譜儀，且耗時(shí)長(zhǎng)，技術(shù)流程較為復(fù)雜，需要專(zhuān)業(yè)人員操作，對(duì)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，初選來(lái)說(shuō)，很不現(xiàn)實(shí)[Holzgrabe U, et al., Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2011,56，271-279]。還有較快速的方法，如酶聯(lián)免疫法以及微生物檢測(cè)法，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求也比較高，且試劑易受污染，準(zhǔn)確度和專(zhuān)屬性不高，時(shí)間性強(qiáng)等特點(diǎn)，也不理想[Makvand1-NejadS，et al., Journal of Immunological Methods, 2010, 360, 103-118]。因此，一種實(shí)時(shí)快速、便捷靈敏的抗生素檢測(cè)方法和便攜設(shè)備亟待開(kāi)發(fā)，這對(duì)于食品安全、環(huán)境衛(wèi)生監(jiān)管等尤為迫切，將在遏制抗生素濫用方面發(fā)揮重要的作用。氨基糖苷類(lèi)腺苷修飾酶(ANT (4’ ))是細(xì)菌產(chǎn)生的一種鈍化酶，共價(jià)修飾抗生素的某些特定基團(tuán)，干擾抗生素和核糖體的結(jié)合，從而使抗生素失去藥效。它修飾的底物具有廣譜性，多達(dá)數(shù)十種，是一個(gè)很好的模型蛋白[Revuelta J, et al.J.AM.CHEM.S0C.2008，130，5086 - 5103，WuCH, et al.J.Phys.Chem.B, 2012，116，5644 - 5652]。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提出一種熒光標(biāo)記的氨基糖苷類(lèi)腺苷修飾酶及其檢測(cè)抗生素的方法。使其用于氨基糖苷類(lèi)抗生素的檢測(cè)和定量分析；該檢測(cè)方法具有檢測(cè)速度快，操作便捷，靈敏度高的特點(diǎn)，可以滿(mǎn)足食品、水質(zhì)和環(huán)境中殘留抗生素檢測(cè)工作的要求。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為:一種熒光標(biāo)記的氨基糖苷類(lèi)腺苷修飾酶:在氨基糖苷類(lèi)腺苷修飾酶的自由巰基Cysl98上，標(biāo)記有含有或修飾巰基的熒光基團(tuán)。所述標(biāo)記含有或者修飾巰基的熒光基團(tuán)為熒光素-5-馬來(lái)酰亞胺(Fluorescein-5-maleimide),其結(jié)構(gòu)如圖 2 所不。一種熒光標(biāo)記的氨基糖苷類(lèi)修飾酶檢測(cè)抗生素的方法，該方法包括如下步驟: (I)將含有或者修飾巰基的熒光基團(tuán)標(biāo)記在氨基糖苷類(lèi)腺苷修飾酶的自由巰基CyS198
上；
(2 )制備反應(yīng)體系:將步驟(I)制得的標(biāo)記有熒光基團(tuán)的氨基糖苷類(lèi)腺苷修飾酶與ATP溶液和二價(jià)金屬離子溶液配置成混合溶液，混合溶液為中性，30°C水浴，備用；本步驟中，通過(guò)熒光檢測(cè)裝置檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度，使用標(biāo)記熒光基團(tuán)的特征激發(fā)光源和發(fā)射波段，如熒光基團(tuán)為熒光素-5-馬來(lái)酰亞胺，其中激發(fā)光源為494nm，檢測(cè)波長(zhǎng)為515nm ；
(3)將一系列不同濃度的已知氨基糖苷類(lèi)抗生素樣品分別加入步驟(2)制得的反應(yīng)體系，根據(jù)產(chǎn)生的熒光信號(hào)強(qiáng)度不同，制定抗生素濃度和熒光強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；
(4)將含有氨基糖苷類(lèi)抗生素的待測(cè)樣本溶液加入步驟(2)制得的反應(yīng)體系中，記錄熒光信號(hào)的變化；
(5)將步驟(4)得到的熒光信號(hào)和步驟(3)得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)比，判斷待測(cè)樣品中氨基糖苷類(lèi)抗生素的殘留以及定量分析。步驟(I)中所述含有或者修飾巰基的熒光基團(tuán)為熒光素-5-馬來(lái)酰亞胺(Fluorescein-5-maleimide)ο所述混合溶液中標(biāo)記熒光基團(tuán)的氨基糖苷類(lèi)腺苷修飾酶的濃度為0.l-ΙΟμΜ，二價(jià)金屬離子的濃度為7.5mM, ATP的濃度為2.5mM。所述步驟(4)中待測(cè)樣本溶液中的含有氨基糖苷類(lèi)抗生素的濃度為 μΜ-ΙπιΜ。
所述二價(jià)金屬離子為Mg2+、Zn2+、Ca2+或Mn2+。在步驟(3)中，抗生素濃度與熒光強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)建立:
權(quán)利要求
1.一種熒光標(biāo)記的氨基糖苷類(lèi)腺苷修飾酶，其特征在于:在氨基糖苷類(lèi)腺苷修飾酶的自由疏基Cysl98上，標(biāo)記有含有或修飾疏基的突光基團(tuán)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種熒光標(biāo)記的氨基糖苷類(lèi)腺苷修飾酶，其特征在于:所述標(biāo)記含有或者修飾巰基的熒光基團(tuán)為熒光素-5-馬來(lái)酰亞胺。
3.一種熒光標(biāo)記的氨基糖苷類(lèi)修飾酶檢測(cè)抗生素的方法，其特征在于該方法包括如下步驟: (I)將含有或者修飾巰基的熒光基團(tuán)標(biāo)記在氨基糖苷類(lèi)腺苷修飾酶的自由巰基Cysl98上； (2 )制備反應(yīng)體系:將步驟(I)制得的標(biāo)記有熒光基團(tuán)的氨基糖苷類(lèi)腺苷修飾酶與ATP溶液和二價(jià)金屬離子溶液配置成混合溶液，混合溶液為中性，30°C水浴，備用； (3)將一系列不同濃度的已知氨基糖苷類(lèi)抗生素樣品分別加入步驟(2)制得的反應(yīng)體系，根據(jù)產(chǎn)生的熒光信號(hào)強(qiáng)度不同，制定抗生素濃度和熒光強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)； (4)將含有氨基糖苷類(lèi)抗生素的待測(cè)樣本溶液加入步驟(2)制得的反應(yīng)體系中，記錄熒光信號(hào)的變化； (5)將步驟(4)得到的熒光信號(hào)和步驟(3)得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)比，判斷待測(cè)樣品中氨基糖苷類(lèi)抗生素的殘留以及定量分析。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述一種熒光標(biāo)記的氨基糖苷類(lèi)腺苷修飾酶，其特征在于:步驟(I)中所述含有或者修飾巰基的熒光基團(tuán)為熒光素-5-馬來(lái)酰亞胺。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種熒光標(biāo)記的氨基糖苷類(lèi)修飾酶檢測(cè)抗生素靶標(biāo)分子的方法，其特征在于:混合溶液中標(biāo)記熒光基團(tuán)的氨基糖苷類(lèi)腺苷修飾酶的濃度為0.1-ΙΟμΜ二價(jià)金屬離子的濃度為7.5mM, ATP的濃度為2.5mM。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種熒光標(biāo)記的氨基糖苷類(lèi)修飾酶檢測(cè)抗生素靶標(biāo)分子的方法，其特征在于:步驟(4)中待測(cè)樣本溶液中的含有氨基糖苷類(lèi)抗生素的濃度為I μΜ-1mM0
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種熒光標(biāo)記的氨基糖苷類(lèi)修飾酶檢測(cè)抗生素的方法，其特征在于:所述二價(jià)金屬離子為Mg2+、Zn2+、Ca2+或Mn2+。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種熒光標(biāo)記的氨基糖苷類(lèi)修飾酶檢測(cè)抗生素的方法，其特征在于:在步驟(3)中，抗生素濃度與熒光強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)建立:
全文摘要
一種熒光標(biāo)記的氨基糖苷類(lèi)腺苷修飾酶及其檢測(cè)抗生素的方法。本發(fā)明公開(kāi)了一種熒光標(biāo)記的氨基糖苷類(lèi)腺苷修飾酶，在氨基糖苷類(lèi)腺苷修飾酶的自由巰基Cys198上，標(biāo)記有含有或修飾巰基的熒光基團(tuán)，標(biāo)記含有或者修飾巰基的熒光基團(tuán)為熒光素-5-馬來(lái)酰亞胺。本發(fā)明還公開(kāi)了一種用上述熒光標(biāo)記的氨基糖苷類(lèi)修飾酶檢測(cè)抗生素的方法，本發(fā)明制得的熒光標(biāo)記的修飾酶試劑配制簡(jiǎn)單，成本低，酶催化反應(yīng)快速、靈敏，因此可以方便、快捷、高效的檢測(cè)食品、環(huán)境中殘留的抗生素藥物，不局限于實(shí)驗(yàn)室操作。
文檔編號(hào)G01N21/64GK103074313SQ20131000999
公開(kāi)日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2013年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月11日
發(fā)明者武靈芝, 胡棟 申請(qǐng)人:南京郵電大學(xué)