高效液相色譜串聯(lián)二級質(zhì)譜技術(shù)檢測尿液中8-羥基脫氧鳥苷和8-羥基鳥苷的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生化檢測領(lǐng)域，具體涉及一種高效液相色譜串聯(lián)二級質(zhì)譜技術(shù)檢測尿 液中8-羥基脫氧鳥苷和8-羥基鳥苷的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] DNA和RNA氧化損傷應(yīng)激產(chǎn)物作為生物標記物的潛在用途和價值是生物醫(yī)學研究 的一個重要方面。8-羥基脫氧鳥苷和8-羥基鳥苷作為兩種重要的氧化標記物，在組織細胞 內(nèi)產(chǎn)生，經(jīng)血液運輸，由腎臟隨尿液排出體外。由于兩種物質(zhì)在體內(nèi)較為穩(wěn)定，且尿液樣本 易得，可以實現(xiàn)無創(chuàng)檢測，通過對尿液中兩種物質(zhì)的監(jiān)測可以為有效評價機體各種因素引 起的氧化損傷提供幫助。此外，通過對健康人體內(nèi)兩種生物標記物的含量檢測，可以評估性 另IJ、年齡和吸煙等潛在因子的影響作用。因此，開發(fā)一種經(jīng)濟、高效的8-羥基脫氧鳥苷和8-羥基鳥苷檢測方法至關(guān)重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種高效液相色譜串聯(lián)二級質(zhì)譜技術(shù)檢測尿液 中8-羥基脫氧鳥苷和8-羥基鳥苷的試劑盒，以解決現(xiàn)有技術(shù)存在的特異性較差和靈敏度低 的問題。
[0004] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0005] 高效液相色譜串聯(lián)二級質(zhì)譜技術(shù)檢測尿液中8-羥基脫氧鳥苷和8-羥基鳥苷的試 劑盒，它包括如下試劑：
[0006] (1)洗脫液：
[0007] 洗脫液A: 0.1 % v/v甲酸水溶液；
[0008] 洗脫液B:乙腈；
[0009] (2)標準品溶液:含8-羥基脫氧鳥苷和8-羥基鳥苷的空白人工尿液基質(zhì)溶液；
[0010] (3)內(nèi)標物工作液:含[13C，15N2]-8-羥基脫氧鳥苷的甲醇溶液；
[0011] (4)稀釋液：
[0012] 稀釋液1:空白人工尿液基質(zhì)；
[0013] 稀釋液2:甲醇；
[0014] (5)有機溶劑：甲醇；
[0015] (6)質(zhì)控品：含有8-羥基脫氧鳥苷和8-羥基鳥苷的空白人工尿液基質(zhì)溶液，分高中 低三個濃度，分別為QC(H)、QC(M)、QC(L);
[0016] 其中，QC(H)、QC(M)、QC(L)中8-羥基脫氧鳥苷和8-羥基鳥苷質(zhì)控品對應(yīng)濃度見表 1;
[0017]表1 8-羥基脫氧鳥苷和8-羥基鳥苷質(zhì)控品對應(yīng)濃度(單位ng/mL)
[0018]
[0019] 其中，所述的標準品溶液包括混合標準液C2和混合標準液C3;其中，所述的混合標 準液C2為含濃度為96ng/mL的8-羥基脫氧鳥苷和濃度為97ng/mL的8-羥基鳥苷的空白人工 尿液基質(zhì)溶液，所述的混合標準液C3為含濃度為9.6ng/mL的8-羥基脫氧鳥苷和濃度為 9.7ng/mL的8-羥基鳥苷的空白人工尿液基質(zhì)溶液。
[0020] 其中，所述的內(nèi)標物工作液為含濃度為0.991yg/mL的[13C，15N2]-8-羥基脫氧鳥苷 的甲醇溶液。
[0021] 其中，所述的空白人工尿液基質(zhì)為含0.5586g//L二水合氯化鈣、0.6099g/L六水合 氯化鎂、4.2077g/L氯化鈉、2.0596g/L硫酸鈉、0.6470g/L檸檬酸鈉二水合物、0.0201g/L草 酸鈉、2 · 5449g/L磷酸二氫鉀、1 · 4388g/L氯化鉀、0· 9200g/L氯化銨、2 · 4985g/L尿素和 1.0520g/L肌酐的水溶液。
[0022] 其中，所述的尿液為人或動物的尿液。
[0023] 上述高效液相色譜串聯(lián)二級質(zhì)譜技術(shù)檢測尿液中8-羥基脫氧鳥苷和8-羥基鳥苷 的試劑盒的制備方法，
[0024] (1)洗脫液：
[0025] 洗脫液A:配制0.1 % v/v甲酸水溶液；
[0026] 洗脫液B:乙腈；
[0027] (2)標準品溶液：
[0028] 分別準確稱量5mg的8-羥基脫氧鳥苷和8-羥基鳥苷，于甲醇中溶解定容至10mL，配 制成濃度分別為〇. 48mg/mL和0.485mg/mL的儲備液A和B，-20°C保存;取儲備液A和B各100yL 混合后用甲醇稀釋后定容至10mL，配制成8-羥基脫氧鳥苷濃度為4.8yg/mL，8-羥基鳥苷濃 度為4.85yg/mL的混合標準液Cl，-20°C保存;取100yL混合標準液C1用空白人工尿液基質(zhì)稀 釋后定容至5mL，配制得到8-羥基脫氧鳥苷濃度為96ng/mL，8-羥基鳥苷濃度為97ng/mL的混 合標準液C2;取500yL混合標準液C2用空白人工尿液基質(zhì)稀釋后定容至5mL，配制得到8-羥 基脫氧鳥苷濃度為9.6ng/mL，8-羥基鳥苷濃度為9.7ng/mL的混合標準液C3;
[0029] (3)內(nèi)標物工作液：
[0030] 準確稱量5mg的[13C，15N2]-8-羥基脫氧鳥苷，用甲醇溶解定容至10mL后得到濃度為 49.55yg/mL的內(nèi)標物儲備液，內(nèi)標物儲備液經(jīng)甲醇稀釋至0.99 lyg/mL得到內(nèi)標物工作液D; 內(nèi)標物儲備液和內(nèi)標物工作液D均于_20°C下保存；
[0031] (4)稀釋液：
[0032] 稀釋液1:分別取0.5586g二水合氯化鈣、0.6099g六水合氯化鎂、4.2077g氯化鈉、 2 · 0596g硫酸鈉、0 · 6470g檸檬酸鈉二水合物、0 · 020 lg草酸鈉、2 · 5449g磷酸二氫鉀、1 · 4388g 氯化鉀、0.9200g氯化銨、2.4985g尿素和1.0520g肌酐用水溶解并定容至1L;
[0033] 稀釋液2:甲醇；
[0034] (5)有機溶劑：甲醇；
[0035] (6)質(zhì)控品：分別取1 OyL、60yL、120yL步驟(2)中得到的混合標準品C1用空白人工 尿液基質(zhì)定容至10mL得到。
[0036] 上述試劑盒在利用高效液相色譜串聯(lián)二級質(zhì)譜技術(shù)檢測尿液中8-羥基脫氧鳥苷 和8-羥基鳥苷中的應(yīng)用也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0037]具體檢測方法如下：
[0038]采用高效液相色譜串聯(lián)二級質(zhì)譜技術(shù)分別檢測標準品溶液和經(jīng)過預處理的尿液 樣品中的8-羥基脫氧鳥苷和8-羥基鳥苷，先利用高效液相色譜技術(shù)將8-羥基脫氧鳥苷和8-羥基鳥苷分離，再利用二級質(zhì)譜同位素內(nèi)標定量法，以標準品與內(nèi)標物的濃度比為X軸，標 準品與內(nèi)標物的峰面積比為Y軸，建立校準曲線，計算出8-羥基脫氧鳥苷和8-羥基鳥苷的含 量，具體色譜條件為：
[0039] (1)高效液相色譜條件：
[0040] 流動相A: 0.1 % v/v的甲酸水溶液；
[0041 ]流動相B:乙腈；
[0042] 色譜柱為Ultimate Polar_RP，2· 1 X 100mm，3μηι;
[0043] 流速為 0.4mL/min;
[0044] 柱溫為 30°C;
[0045] 進樣量為10yL;
[0046] 采用梯度洗脫方式，見表1;
[0047]表1液相梯度洗脫參數(shù)
[0048]
[0049] (2)質(zhì)譜條件：
[0050]在電噴霧電離正離子檢測模式下，采用多反應(yīng)監(jiān)測的質(zhì)譜掃描模式;噴霧針電壓 為5500V;碰撞氣為5psi;氣簾氣為50psi;離子源霧化氣和加熱輔助氣均為65psi;脫溶劑氣 溫度為550°C。
[0051 ]其中，所述的標準品溶液按照如下方法制備得到：
[0052] 分別準確稱量5mg的8-羥基脫氧鳥苷和8-羥基鳥苷，于甲醇中溶解定容至10mL，配 制成濃度分別為〇. 48mg/mL和0.485mg/mL的儲備液A和B，-20°C保存;取儲備液A和B各100yL 混合后用甲醇稀釋后定容至10mL，配制成8-羥基脫氧鳥苷濃度為4.8yg/mL，8-羥基鳥苷濃 度為4.85yg/mL的混合標準液Cl，-20°C保存;取100yL混合標準液C1用空白人工尿液基質(zhì)稀 釋后定容至5mL，配制得到8-羥基脫氧鳥苷濃度為96ng/mL，8-羥基鳥苷濃度為97ng/mL的混 合標準液C2;取500yL混合標準液C2用空白人工尿液基質(zhì)稀釋后定容至5mL，配制得到8-羥 基脫氧鳥苷濃度為9.6ng/mL，8-羥基鳥苷濃度為9.7ng/mL的混合標準液C3;
[0053] 準確稱量5mg的[13C，15N2]-8-羥基脫氧鳥苷，用甲醇溶解定容至10mL后得到濃度為 49.55yg/mL的內(nèi)標物儲備液，內(nèi)標物儲備液經(jīng)甲醇稀釋至0.99 lyg/mL得到內(nèi)標物工作液D; 內(nèi)標物儲備液和內(nèi)標物工作液D均于_20°C下保存；
[0054] 分別取25μ1、50μL和100yL混合標準液C2用空白人工尿液基質(zhì)稀釋并定容至100yL 作為標準校準點S5、S6和S7;分別取5yL、10yL、50yL和100yL混合標準液C3用空白人工尿液 基質(zhì)稀釋并定容至100μL，得到標準校準點S1、S2、S3和S4;這7個濃度點體積均為100yL;然 后向各組標準校準點中加入15yL 0.99lyg/mL內(nèi)標物工作液D，混合均勻后用甲醇定容至 〇.5mL，然后渦旋20秒后振蕩lOmin，于4°C下12000g離心5min后取10yL上清液，即得標準品 溶液；
[0055] 其中，
[0056] SI、S2、S3、S4、S5、S6和S7作為8-羥基脫氧鳥苷的校準點，S2、S3、S4、S5、S6和S7作 為8-羥基鳥苷的校準點。
[0057]其中，所述的空白人工尿液基質(zhì)為實驗室人工配置的模擬尿液;其中，所述的空白 人工尿液基質(zhì)由如下方法制備得到：
[0058] 分別取0.5586g二水合氯化鈣、0.6099g六水合氯化鎂、4.2077g氯化鈉、2.0596g硫 酸鈉、0 · 6470g檸檬酸鈉二水合物、0 · 0201g草酸鈉、2 · 5449g磷酸二氫鉀、1 · 4388g氯化鉀、 0.9200g氯化銨、2.4985g尿素和1.0520g肌酐用去離子水溶解并定容至1L。
[0059] 其中，尿液樣品的預處理方法為:取100yL尿液至1.5mL離心管中，加入15yL內(nèi)標物 工作液D后混勾，再用甲醇定容至0.5mL，漩禍振蕩lmin，于4°C下12000g離心5min，取10yL上 清