一種醬香型白酒中吡嗪類(lèi)化合物的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種醬香型白酒中吡嗪類(lèi)化合物的檢測(cè)方法，屬于白酒檢測(cè)技術(shù)領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來(lái)，人們對(duì)食品中含氮化合物的興趣越來(lái)越濃厚。這主要是由于這類(lèi)化合物， 尤其是吡嗪化合物，在構(gòu)成食品風(fēng)味方面有獨(dú)特的作用，國(guó)內(nèi)白酒界逐漸將這一類(lèi)化合物 看成是構(gòu)成白酒風(fēng)味的重要成分之一，因?yàn)樗鼈兙哂袠O低的風(fēng)味閾值，還對(duì)其他香味物質(zhì) 有明顯的烘托疊加作用，可使白酒的香氣更為豐滿，對(duì)白酒的風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)。
[0003] 對(duì)于中國(guó)白酒行業(yè)而言，在歷經(jīng)清香、濃香時(shí)代之后，醬香天下已然來(lái)臨，越來(lái)越 多的消費(fèi)者青睞醬香白酒。目前關(guān)于醬香型白酒中的香味成分研究成果較少，其主體香也 還沒(méi)有定論，國(guó)內(nèi)關(guān)于醬香型酒主體香味成分的說(shuō)法主要有4種，其中吡嗪說(shuō)愈來(lái)愈受到 界內(nèi)人士的關(guān)注。吡嗪類(lèi)化合物在其他香型白酒中也存在，但醬香型酒中吡嗪類(lèi)化合物明 顯高于其他香型，其大都具有焦香、糊香或類(lèi)似"焙烤"、"醬油"的氣味，是醬香型白酒中不 可缺少的重要香氣組成。醬香型白酒中高溫制曲、高溫堆積工藝是生成吡嗪類(lèi)化合物的重 要環(huán)節(jié)。若使用低溫大曲作為糖化發(fā)酵劑或糟醅不經(jīng)過(guò)高溫堆積工序，所產(chǎn)出的醬香型白 酒的吡嗪類(lèi)化合物含量則很低，醬香風(fēng)格也很差。通過(guò)不同級(jí)別醬香調(diào)味酒的分析檢測(cè)研 究表明，在多種微量成分中酸類(lèi)、酯類(lèi)、醇類(lèi)、醛類(lèi)、酮類(lèi)無(wú)明顯規(guī)律可循，只在合理范圍內(nèi) 波動(dòng)。但吡嗪類(lèi)物質(zhì)卻有規(guī)律地波動(dòng)，橫向?qū)Ρ龋?4批基礎(chǔ)酒中的吡嗪類(lèi)物質(zhì)要比醬香調(diào)味 酒普級(jí)的低；縱向?qū)Ρ?，醬香調(diào)味酒普級(jí)、優(yōu)級(jí)、特級(jí)的吡嗪類(lèi)物質(zhì)呈上升趨勢(shì)。從數(shù)據(jù)可以 看出吡嗪類(lèi)化合物對(duì)醬香調(diào)味酒的感官特征有重要的影響。
[0004] 研究發(fā)現(xiàn)吡嗪不僅是白酒中特有的風(fēng)味成分，也是白酒的重要功能因子，定性出 的白酒中有26種吡嗪類(lèi)化合物。研究結(jié)果表明，醬香型和兼香型酒中吡嗪類(lèi)化合物種類(lèi)和 含量最高，在3000~6000 μ g/L ;濃香型次之；清香型白酒中吡嗪類(lèi)化合物的含量及其種類(lèi) 都是最少的。其中的四甲基吡嗪是從傳統(tǒng)中藥傘形科藻本屬植物川芎中分離出來(lái)的一種活 性成分，已經(jīng)被廣泛用于心臟血管和腦血管疾病的治療中。它能增加腦血管的血流量，減少 腦缺血性疾病的發(fā)作。國(guó)際上研究表明，四甲基吡嗪對(duì)中樞神經(jīng)有影響，能改善學(xué)習(xí)的障 礙，還有防止由無(wú)水乙醇引起的胃黏膜損傷、由無(wú)水乙醇引起的腎中毒、由硫代乙酰胺引起 的急性肝中毒，并能降低腦萎縮的傷害。
[0005] 目前已有的關(guān)于白酒中吡嗪類(lèi)化合物的檢測(cè)方法主要是GC和GC-MS。兩種方法 都是通過(guò)傳統(tǒng)的液液萃取對(duì)酒樣進(jìn)行前處理，樣品前處理步驟大概如下：取l〇〇〇mL酒樣， 用12N濃鹽酸將酒樣酸度調(diào)pH至1，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至20mL，濃縮液用20mL重蒸乙醚在分 液漏斗中萃取三次，去掉醚層，水相用12N NaOH調(diào)pH至7,再用IN NaOH調(diào)pH至10,加入 NaCl飽和，再用20mL重蒸乙醚在分液漏斗中萃取三次，收集醚層，用5g無(wú)水硫酸鈉干燥過(guò) 濾，濾液吹至0. 5mL，供GC或GC-MS分析。該法對(duì)于更深層次認(rèn)識(shí)白酒中的吡嗪類(lèi)化合物 有重要意義，但是定量具有一定的局限性，一是因?yàn)檫拎侯?lèi)化合物已有標(biāo)準(zhǔn)品有限，大部分 發(fā)現(xiàn)的化合物沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)品賣(mài)，只能做到半定量；二是整個(gè)前處理過(guò)程比較復(fù)雜，需要大量的 酒樣，樣品經(jīng)過(guò)多次提取轉(zhuǎn)移，影響定量的準(zhǔn)確性。用該方法處理酒樣，整個(gè)前處理時(shí)間將 近2天，步驟繁瑣，用到大量的對(duì)人體有害的有機(jī)試劑，且將已有標(biāo)樣的吡嗪類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行加 標(biāo)回收率試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該前處理方法回收率不高，不適合作為常規(guī)的檢測(cè)方法來(lái)使用。該類(lèi)研 究主要通過(guò)酒樣提取與質(zhì)譜的NIST譜庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，從而探索酒中含有的吡嗪化合物種類(lèi)。 實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，通過(guò)全掃描的方式在檢測(cè)吡嗪類(lèi)化合物的同時(shí)，也會(huì)受到酯類(lèi)、醇類(lèi)化合物的 干擾，使定量受到影響。
[0006] 2009年貴州茅臺(tái)酒股份有限公司利用氣相色譜-質(zhì)譜-離子掃描聯(lián)用法快速測(cè) 定白酒中4中吡嗪類(lèi)化合物（中國(guó)釀造，2009, 204(3)，148~150)，該法酒樣直接進(jìn)樣，測(cè) 定了茅臺(tái)酒中含量較高是四種吡嗪化合物，即2-乙基-6-甲基吡嗪、2, 3, 5-三甲基吡嗪、 2, 3, 5, 6-四甲基吡嗪和2, 3-二甲基-5-乙基吡嗪，雖然縮短了樣品的前處理時(shí)間，但是酒 樣中含有的大量水分對(duì)質(zhì)譜高真空系統(tǒng)來(lái)說(shuō)有較大損傷，為了降低對(duì)儀器的損傷選擇減小 進(jìn)樣量為0. 2 μ L，從而也降低了檢測(cè)的靈敏度，四種化合物檢出限為0. 2mg/L左右，所以該 法也只測(cè)定了茅臺(tái)酒中含量相對(duì)較高的4種吡嗪化合物。
[0007] 用GC-NH)快速測(cè)定了白酒中吡嗪類(lèi)化合物，酒樣直接進(jìn)樣分析，定量了 7種吡嗪 化合物。但是從色譜圖中可以看出，樣品分析時(shí)基線漂移較大。根據(jù)我們的檢測(cè)實(shí)踐，這種 情況難以保證檢測(cè)的精密度和準(zhǔn)確度。
[0008] 隨著樣品提取技術(shù)的發(fā)展，頂空固相微萃取技術(shù)逐漸應(yīng)用于酒類(lèi)分析中。應(yīng)用 HS-SPME和GC-MS分析了白酒大曲中微量揮發(fā)性成分，從大曲中定性23種吡嗪類(lèi)化合物； 用HS-SPME與GC-FTD相結(jié)合，采用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量8種有標(biāo)樣的吡嗪類(lèi)化合物：分別 為吡嗪、2-甲基吡嗪、2-乙基吡嗪、2, 5-二甲基吡嗪、2, 6-二甲基吡嗪、2, 3-二甲基吡嗪、 2, 3, 5-三甲基吡嗪和2, 3, 5, 6-四甲基吡嗪，8種吡嗪類(lèi)化合物相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在4. 09 %~ 11. 52%之間，其中對(duì)茅臺(tái)酒和郎酒這兩大醬香代表酒進(jìn)行了定量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)吡嗪和2-乙 基吡嗪在所測(cè)8種吡嗪中含量排在最后兩位，而在醬香酒中含量較高的2-乙基-6-甲基 吡嗪和2, 3-二甲基-5-乙基吡嗪并沒(méi)有在該研究中進(jìn)行測(cè)定。該小組的專(zhuān)利中，酒樣 需要重蒸水稀釋到最終含酒精量為12% (v/v)，放入15ml的頂空瓶中，加入2gNaCl，插 入50 μπι/30 μπι的CAR/DVB/PDMS萃取頭，置于50°C的恒溫水浴中攪拌萃取40分鐘，用 HS-SPME-GC-FTD內(nèi)標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定了九種吡嗪，他們是：吡嗪、2-甲基吡嗪、2-乙基 吡嗪、2, 5-二甲基吡嗪、2, 6-二甲基吡嗪、2, 3-二甲基吡嗪、2, 3-二乙基吡嗪、2, 3, 5-三甲 基吡嗪和2, 3, 5, 6-四甲基吡嗪。由其表一可以看出，該方法對(duì)這九種物質(zhì)的測(cè)定中，對(duì) 于模擬酒樣，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD)值大于5%的有6個(gè)，對(duì)于郎酒和茅臺(tái)酒，RSD值大于 5%的分別有6個(gè)和7個(gè)，說(shuō)明該方法的重復(fù)性還有待提高。同樣，在醬香酒中含量較高 的2-乙基-6-甲基吡嗪和2, 3-二甲基-5-乙基吡嗪在該專(zhuān)利中并沒(méi)有涉及。另外，該小 組使用了火焰熱離子檢測(cè)器，該檢測(cè)器適合對(duì)含氮磷化合物的檢測(cè)，其通用性不佳。隨后應(yīng) 用了3?1^-6015-5頂聯(lián)用檢測(cè)白酒中含氮化合物，其中定量了2-甲基吡嗪、2,5-二甲基 吡嗪、2, 6-二甲基吡嗪、2, 3-二甲基吡嗪、2, 3, 5-三甲基吡嗪和2, 3, 5, 6-四甲基吡嗪六種 吡嗪類(lèi)化合物，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2. 3%~12. 2%之間，回收率在71. 76%~117. 98%之間。 HS-SPME-GC-FID檢測(cè)可可麥汁中的三種吡嗪類(lèi)化合物分別為2, 5-二甲基吡嗪、2, 3, 5-三 甲基吡嗪和2, 3, 5, 6-四甲基吡嗪，檢測(cè)對(duì)象中沒(méi)有涉及同分異構(gòu)體，對(duì)色譜分離的要求不 高，從標(biāo)樣與樣品的色譜圖可以看出樣品中峰比較多，很多峰是重疊在一起，對(duì)測(cè)定的干擾 較大。
[0009] 頂空固相微萃?。℉S-SPME)是一種無(wú)需有機(jī)溶劑，集采樣、萃取、濃縮、進(jìn)樣于一 體的前處理方法，相對(duì)早期的液液萃取方法要簡(jiǎn)便安全得多。但是該方法需要對(duì)萃取頭進(jìn) 行預(yù)處理或活化，同時(shí)還要對(duì)酒樣進(jìn)行稀釋、鹽析和調(diào)pH值等操作，需要較長(zhǎng)的平衡和萃 取時(shí)間（1小時(shí)左右）。萃取溫度、萃取時(shí)間以及酒樣的離子強(qiáng)度這些都是影響萃取效果的 重要參數(shù)。另外，萃取纖維頭的種類(lèi)有限，選擇性較差，受影響因素多，重復(fù)性也相對(duì)較差， 該方法對(duì)有些吡嗪檢測(cè)的靈敏度、準(zhǔn)確性和精密度還有待改進(jìn)。
[0010] 因此建立一種操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確性和重復(fù)性能夠得到保證的檢測(cè)醬香型白酒中吡嗪 類(lèi)化合物的方法，很有現(xiàn)實(shí)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的在于提供一種醬香型白酒中吡嗪類(lèi)化合物的檢測(cè)方法，本發(fā)明所 述的方法能同時(shí)測(cè)定醬香型白酒中的2-甲基吡嗪、2, 3-二甲基吡嗪、2, 5-二甲基吡嗪、 2, 6-二甲基吡嗪、2, 3, 5-三甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2, 3, 5, 6-四甲基吡嗪、2, 3-二 甲基-5-乙基吡嗪8種吡嗪類(lèi)化合物。且本發(fā)明的方法對(duì)同分異構(gòu)體的分離不需要使用手 性柱或手性添加劑，樣品也不需要衍生化，前處理簡(jiǎn)單，方法靈敏度高，重復(fù)性好。
[0012] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0013] -種醬香型白酒中吡嗪類(lèi)化合物的檢測(cè)方法為：使用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的 檢測(cè)方法對(duì)醬香型白酒中的吡嗪類(lèi)化合物進(jìn)行定性和定量分析。
[0014] 前述的醬香型白酒中吡嗪類(lèi)化合物的檢測(cè)方法，所述的吡嗪類(lèi)化合物包括2-甲 基吡嗪、2, 3-二甲基吡嗪、2, 5-二甲基吡嗪、2, 6-二甲基吡嗪、2, 3, 5-三甲基吡嗪、2-乙 基-6-甲基吡嗪、2, 3, 5, 6-四甲基吡嗪和2, 3-二甲基-5-乙基吡嗪。
[0015] 前述的醬香型白酒中吡嗪類(lèi)化合物的檢測(cè)方法中，所述的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì) 譜的檢測(cè)方法中樣品前處理方法為：將酒樣搖勻后，取2mL過(guò)0. 22 μ m濾膜，即得。
[0016] 前述的醬香型白酒中吡嗪類(lèi)化合物的檢測(cè)方法中，所述的高效液相色譜-串聯(lián) 質(zhì)譜的檢測(cè)方法中高效液相色譜的檢測(cè)條件為：色譜柱：苯基柱Gemini 5 μ C6 - Phenyl 110A 250mmX4.6mm;流動(dòng)相由流動(dòng)相A和流動(dòng)相B組成，流動(dòng)相A :含0· 1%甲酸和0· 1% 三氟乙酸的水溶液；流動(dòng)相B :甲醇；梯度洗脫流動(dòng)相設(shè)置：按體積計(jì)算，Omin :含流動(dòng)相A 95%，流動(dòng)相B 5%;20min:流動(dòng)相A 80%，流動(dòng)相B 20%;25min:流動(dòng)相A 55%，流動(dòng)相B 45%;28min:流動(dòng)相 A 95%，流動(dòng)相 B 5%;35min:流動(dòng)相 A 95%，流動(dòng) B 5%;流速：1.0mL/ min ;柱溫：30°C ;進(jìn)樣量：10yL ;
[0017] 前述的醬香型白酒中吡嗪類(lèi)化合物的檢測(cè)方法中，所述的高效液相色譜-串聯(lián) 質(zhì)譜的檢測(cè)方法中質(zhì)譜的檢測(cè)條件為：APCI離子源+參數(shù)：噴霧電壓5500V，噴霧氣、輔助 氣、氣簾氣流量分別為60L/Hr、60L/Hr、35L/Hr，噴霧器溫度為650°C ;MRM優(yōu)化參數(shù)：2-甲 基吡嗪：檢測(cè)離子對(duì)：95. 1/68. Γ，95. 1/54. 1，錐孔電壓：65v，碰撞電壓：25v，27v ;2,3_二 甲基吡嗪，2, 5-二甲基吡嗪，2, 6-二甲基吡嗪：檢測(cè)離子對(duì)：109. 1/68. Γ，109. 1/82. 1， 錐孔電壓：70v，碰撞電壓：28v，27v ;2,3,5_三甲基吡嗪，2-乙基-6甲基吡嗪：檢測(cè)離子 對(duì)：123. 1/82. 0' 123. 1/107. 0,錐孔電壓：71v，碰撞電壓：32v，35v ;2, 3, 5,6-四甲基吡 嗪，2, 3-二甲基-5-乙基吡嗪：檢測(cè)離子對(duì)：137. 0/80. Γ，137. 0/121. 1，錐孔電壓：65v，碰 撞電壓：41v，38v。
[0018] 前述的醬香型白酒中吡嗪類(lèi)化