一種用于檢測塑化劑的酶聯(lián)免疫試劑盒的制備
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種用于定量檢測白酒樣本中的塑化劑(DBP)殘留量的酶聯(lián)免疫試劑盒及檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]塑化劑是一種增加材料的柔軟性或是材料液化的添加劑。鄰苯二甲酸酯類塑化劑被歸類為疑似環(huán)境荷爾蒙，其生物毒性主要屬雌激素與抗雄激素活性，會造成內(nèi)分泌失調(diào)，損害生物體生殖機能，包括生殖率降低、流產(chǎn)、天生缺陷、異常的精子數(shù)、睪丸損害，還會引發(fā)惡性腫瘤、造成畸形兒，導(dǎo)致兒童性早熟。
[0003]鄰苯二甲酸二丁酯(Dibutyl phthalate, DBP)是一種常用的塑化劑，也用作膠粘劑和印刷油墨的添加劑，也可用作一種殺體外寄生蟲藥。它具有較強的生殖毒性，可引起男性生育能力下降，尤其對兒童的毒性更大。DBP主要存在于人造革、塑料制品、化妝品、香精及農(nóng)藥中。
[0004]目前，檢測塑化劑的方法主要有高效液相色譜法HPLC、氣相色譜法GC等。其中，高效液相色譜法HPLC、氣相色譜法GC是定量的檢測方法，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，缺點是檢出限較高、儀器設(shè)備較為昂貴，以及復(fù)雜的樣本前處理方法，限制了該方法的廣泛應(yīng)用。酶聯(lián)免疫吸附ELISA法是一種準(zhǔn)確、可靠、快速、特異的檢測方法，適合于大批樣品的快速篩選，近年來已廣泛應(yīng)用。本發(fā)明旨在建立一種檢測塑化劑(DBP)的ELISA試劑盒的制備及檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供了檢測塑化劑(DBP)的ELISA試劑盒，其檢測靈敏、準(zhǔn)確、快速，操作簡便、特異性強，適用于大批樣品的檢測。本發(fā)明提供了一種用于檢測塑化劑(DBP)的ELISA試劑盒的制備。
[0006]檢測塑化劑(DBP)的ELISA試劑盒的制備，包括酶標(biāo)板、塑化劑(DBP)標(biāo)準(zhǔn)品、塑化劑(DBP)酶標(biāo)抗體工作液、底物液A、底物液B、終止液和濃縮洗滌液。
[0007]檢測塑化劑(DBP)的ELISA試劑盒的制備，包括以下步驟:酶標(biāo)板的制備、塑化劑(DBP)標(biāo)準(zhǔn)品的制作、塑化劑(DBP)酶標(biāo)抗體工作液的制備、洗滌液的制備、底物液A的制備、底物液B的制備、終止液的制備。
[0008]其進一步特征在于:所述的塑化劑(DBP)包被抗原是將塑化劑(DBP)半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到的，該載體蛋白為牛血清白蛋白(BSA);用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸鹽(CBS)緩沖液作為包被液，將塑化劑(DBP)抗原稀釋成1:30000比例，100 μ?7孔，37°C放置2 h，取出酶標(biāo)板甩掉板內(nèi)液體，用稀釋后的濃縮洗滌液300 μ?/孔，洗板2次，30 s/次；然后加入0.3%牛血清白蛋白(BSA)封閉，160 μ?7孔，37°C放置2 h，棄去封閉液，拍干后的酶標(biāo)板放置恒溫間(25°C )晾干；抽檢合格后將酶標(biāo)板真空密封后置4°C下保存。
[0009]所述的塑化劑(DBP)標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為0 ppm、0.05 ppm、0.15 ppm、0.45 ppm、1.35 ppm、4.05 ppm。
[0010]塑化劑(DBP)酶標(biāo)抗體工作液的制備:采用辣根過氧化酶偶聯(lián)塑化劑單克克隆抗體所得到，該酶標(biāo)抗體工作液用抗體稀釋液稀釋成1:20000。
[0011 ] 所述底物液A為含有0.5 mmol/L的過氧化氫脲的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液；所述底物液B為四甲基聯(lián)苯二胺的乙醇溶液；所述終止液為2 mol/L的硫酸；所述濃縮洗滌液是10倍濃縮洗滌液，其包含0.5%吐溫-20，0.01mol/L的PBST，pH值范圍7.0-7.5之間。
[0012]塑化劑(DBP)的ELISA試劑盒的檢測方法，基于抗原抗體進行直接競爭酶聯(lián)免疫反應(yīng)，該方法包括以下步驟:
(1)預(yù)處理待測樣品，即將待測試的樣品處理為液體樣品，或者用有機溶劑提取待測樣品，并將其復(fù)溶于樣品稀釋液工作液中；
(2)將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫(20?25°C)平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻；
(3)取包被有塑化劑(DBP)抗原的酶標(biāo)板，加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50μ?7孔到對應(yīng)的微孔中；
(4)加入酶標(biāo)抗體工作液，50μ?7孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫25°C避光環(huán)境中反應(yīng)30 min ；
(5)小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液300μ?7孔，充分洗滌4次，浸泡15-30 s,用吸水紙拍干；
(6)加入底物液A50 μ?ν孔，底物液B 50 μ?ν孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25°C避光環(huán)境中反應(yīng)15 min ；
(7)加入終止液50μ?/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450 nm處或雙波長450/630nm檢測，測定每孔吸光度值(請在5 min內(nèi)讀完數(shù)據(jù))；
(8)以標(biāo)準(zhǔn)品測試的吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)品的濃度對數(shù)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中塑化劑(DBP)的含量。
[0013]其中，所述處理后的樣品是經(jīng)過以下處理的樣品:
取5 mL樣品于干凈的玻璃試管中，加入2mL色譜純的正己烷，蓋上蓋后振蕩3 min，然后靜置，待分層后取上層清液1 mL，于干凈的玻璃器皿室溫氮氣吹干，吹干后用lmL 35%的甲醇復(fù)溶后待測。
[0014]本發(fā)明采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)方法來檢測。用于檢測塑化劑(DBP)的ELISA試劑盒的測定原理:樣品中的塑化劑(DBP)與酶標(biāo)板上固定的抗原特異性競爭酶標(biāo)抗體，通過酶催化顯色劑顯色，根據(jù)顯色的深淺來判斷樣品中塑化劑(DBP)的含量。如果樣品中的塑化劑(DBP)含量少，顯色深；反之，則顯色淺。本發(fā)明的試劑盒檢測方法操作簡便，檢測靈敏、準(zhǔn)確、快速，適用于大批量樣品的檢測。
【附圖說明】
[0015]圖1為塑化劑(DBP)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
【具體實施方式】
[0016]檢測塑化劑(DBP)的ELISA試劑盒，其包括酶標(biāo)板、塑化劑(DBP)標(biāo)準(zhǔn)品、塑化劑(DBP)酶標(biāo)抗體工作液、底物液A、底物液B、終止液和濃縮洗滌液。
[0017]下面具體描述本發(fā)明中檢測塑化劑(DBP)的ELISA試劑盒的制備，
塑化劑(DBP)蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的制備:
將塑化劑(DBP)半抗原與載體蛋白BSA按12:1的結(jié)合比混合在0.05 mol/L pH 9.6的碳酸鹽緩沖液(CBS)中，然后加入入碳二亞胺，攪拌1?2h，置室溫反應(yīng)24 h，最后用0.2mol/L pH 7.6的PBS透析兩天，除去未反應(yīng)的半抗原，即可得到塑化劑(DBP)蛋白質(zhì)偶聯(lián)物。
[0018]塑化劑(DBP)抗體的制備:
選用3月齡健康大白兔，通過三次免疫，每次塑化劑(DBP)蛋白質(zhì)偶聯(lián)物免疫原用量為50 μδ/0.05 mL，每次免疫間隔時間為2周。初次免疫分別將免疫抗原與費氏佐劑及不安全佐劑等量混合，勁部皮下多點注射，二次、三次免疫直接注入腹腔。融合前3天每只腹腔注入25 Pg塑化劑(DBP)蛋白質(zhì)偶聯(lián)物進行加強免疫，免疫后第6 d耳靜脈取血，采用直接競爭ELISA法測定效價。取得較高效價后用半抗原直接在大腿肌肉注射，8 d后頸動脈采全血，分離抗血清，采用辛酸-硫酸銨法純化抗體，制成凍干粉后于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0019]制備辣根過氧化物酶標(biāo)記塑化劑單克隆抗體:采用過碘酸鹽氧化法。
[0020]制備包被有塑化劑(DBP)包被抗原的酶標(biāo)板:
酶標(biāo)板包被塑化劑(DBP)抗原，包被抗原是將塑化劑(DBP)半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到的，該載體蛋白為牛血清白蛋白(BSA);用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸鹽(CBS)緩沖液作為包被液，將塑化劑(DBP)抗原稀釋成1:30000比例，100 μ?7孔，37°C放置2 h，取出酶標(biāo)板甩掉板內(nèi)液體，用稀釋后的濃縮洗滌液300 μ?7孔，洗板2次，30 s/次；然后加入0.3%牛血清白蛋白(BSA)封閉，160 μ?7孔，37°C放置2 h，棄去封閉液，拍干后的酶標(biāo)板放置恒溫間(25°C )晾干；抽檢合格后將酶標(biāo)板真空密封后置4°C下保存。
[0021]所述的塑化劑(DBP)標(biāo)準(zhǔn)品配制濃度分別為0 ppm、0.05 ppm、0.15 ppm、0.45ppm、1.35 ppm、4.05 ppmD
[0022]所述的塑化劑(DBP)酶標(biāo)抗體工作液的制備:采用辣根過氧化酶偶聯(lián)塑化劑單克克隆抗體所得到，該酶標(biāo)抗體工作液用抗體稀釋液稀釋成1:20000。
[0023]所述底物液A為含有0.5 mmol/L的過氧化氫脲的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液；所述底物液B為四甲基聯(lián)苯二胺的乙醇溶液；所述終止液為2 mol/L的硫酸；所述濃縮洗滌液是10倍濃縮洗滌液，其包含0.5%吐溫-20，0.01mol/L的PBST，pH值范圍7.0-7.5之間。
[0024]基于上述制備的試劑，本發(fā)明用于檢測塑化劑(DBP)的ELISA試劑盒包括如下材料:
(1)96孔酶標(biāo)板XI塊；
(2)標(biāo)準(zhǔn)液X 6 瓶:(lm