用于預(yù)測小肝癌復(fù)發(fā)的聯(lián)合診斷標(biāo)記的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一組腫瘤診斷標(biāo)志，特別涉及用于預(yù)測小肝癌復(fù)發(fā)的聯(lián)合診斷標(biāo)記。
【背景技術(shù)】
[0002] 肝癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率居世界第6位，死亡率居第三位，每 年約有25萬人死于肝癌。肝癌由于起病隱匿，惡性程度高，治愈率低，是嚴(yán)重威脅人類健 康和生活質(zhì)量的惡性腫瘤之一，且肝癌的發(fā)病率每年都在持續(xù)地上升。中國是全世界肝癌 每年新增病例最多的國家，占全世界總發(fā)病率的一半，且歐美國家發(fā)病率雖不高但也在逐 年增加。肝細(xì)胞性肝癌（heptocellular carcinoma, HCC)是肝癌最主要的組織學(xué)類型，占 原發(fā)性肝惡性腫瘤的70% -85%，在我國更是占到了約90%。迄今為止，HCC的發(fā)病機(jī)理 仍然不明確，但病毒感染、黃曲霉素 Bl攝入和酗酒等被認(rèn)為是HCC主要的致病因素。其中 10% -40%慢性B型肝炎病毒攜帶者最終將發(fā)展為肝細(xì)胞癌，全世界每年估計(jì)超過1百萬 患者死于B型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV)和C型肝炎病毒相關(guān)的肝癌。在中國 和日本，75 % -80% HCC發(fā)病與肝臟慢性病毒感染關(guān)系密切，其中B型肝炎病毒感染率占 50% -55%，而世界范圍內(nèi)80% -90%的HCC病例合并有肝硬化。因此，肝臟HBV感染及肝 硬化是HCC最主要的高危因素和癌前病變過程。
[0003] 近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)及影像學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)肝癌的早期診斷及治療取 得了很大進(jìn)步，使肝癌的臨床診斷和治療效果均得到明顯改觀。根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)外科學(xué) 肝臟外科學(xué)組2001年制定的標(biāo)準(zhǔn)，將單發(fā)直徑< 2cm的肝癌定為微小肝癌，單發(fā)的直徑 > 2cm且< 5cm的肝癌為小肝癌。而臨床病理學(xué)上定義小肝癌為單個(gè)或兩個(gè)癌結(jié)節(jié)直徑 < 3cm。臨床病理研究資料證實(shí)：3cm以上的小肝癌預(yù)后相對(duì)較差，門脈癌栓及衛(wèi)星結(jié)節(jié)發(fā) 生率都較高，而< 3cm的小肝癌則組織學(xué)分化較好，腫瘤多數(shù)有包膜，DNA含量大多為二倍 體，少見癌栓和衛(wèi)星灶，這些提示腫瘤在3cm以下是生物學(xué)特性發(fā)生明顯改變的主要時(shí)期。 從20世紀(jì)70-80年代起，隨著血清甲胎蛋白（AFP)、實(shí)時(shí)超聲顯像和CT的廣泛應(yīng)用，大大提 高了肝癌的早期診斷率，很多小肝癌病例在臨床被發(fā)現(xiàn)。小肝癌多屬于早期肝癌，一直是肝 癌臨床研究的熱點(diǎn)。小肝癌的治療主要強(qiáng)調(diào)根治性，手術(shù)切除被認(rèn)為小肝癌根治性治療的 "金標(biāo)準(zhǔn)"，是小肝癌的首選治療手段。但小肝癌術(shù)后5年生存率仍停留在50% -60%之間， 始終沒有重大的突破，術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移仍然是小肝癌預(yù)后不良的主要原因。
[0004] 肝癌復(fù)發(fā)的來源一是多中心發(fā)生，即肝癌根治性切除后，由于肝癌生長的土壤 (肝硬化）和其它促癌因素的繼續(xù)存在，再發(fā)新的腫瘤；二是單中心發(fā)生，即原先切除病灶 術(shù)前、術(shù)中癌細(xì)胞經(jīng)門靜脈途徑播散，發(fā)生肝內(nèi)復(fù)發(fā)和肝外轉(zhuǎn)移。目前對(duì)影響肝癌術(shù)后預(yù)后 因素的研究，主要集中于對(duì)腫瘤大小、數(shù)目、分化程度、脈管侵犯、甲胎蛋白水平等臨床病 理因素的分析，而這些對(duì)肝癌肝切除后的復(fù)發(fā)尚不能進(jìn)行較準(zhǔn)確的預(yù)測。因此，針對(duì)肝癌 復(fù)發(fā)這一科學(xué)難題，如何對(duì)切除術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)進(jìn)行有效的預(yù)測，如何預(yù)防肝癌術(shù)后的腫瘤 復(fù)發(fā)均對(duì)提高肝癌的療效有重大的臨床意義，探索和建立簡單、快速、敏感性高和特異性強(qiáng) 的分子預(yù)測指標(biāo)和新的治療靶點(diǎn)已成為提高臨床療效的迫切需要。
[0005] 肝癌的復(fù)發(fā)是一個(gè)多步驟、多因素參與的復(fù)雜過程，涉及到腫瘤細(xì)胞黏附、細(xì)胞外 基質(zhì)降解、細(xì)胞迀移、細(xì)胞增殖、腫瘤血管形成等腫瘤生物學(xué)各個(gè)方面，不能單獨(dú)僅從一方 面來分析肝癌復(fù)發(fā)。肝癌的復(fù)發(fā)與臨床病理分期、腫瘤包膜、腫瘤大小、數(shù)目、血管浸潤及肝 硬化程度等有關(guān)，這些結(jié)果只是建立在肝癌臨床病理和細(xì)胞水平觀察和研究的基礎(chǔ)上，很 難在小肝癌（尤其是單結(jié)節(jié)）復(fù)發(fā)之前對(duì)其復(fù)發(fā)傾向早期做出個(gè)體化的預(yù)測。近年來的研 究發(fā)現(xiàn)影響肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移基因、蛋白在其生物學(xué)行為中起著重要作用，但是當(dāng)前的大多數(shù) 研究為單因素研究模式，集中研究一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)基因、蛋白的表達(dá)情況，單單僅憑一個(gè)或 少數(shù)幾個(gè)基因、蛋白的表達(dá)情況無法確切反映肝癌轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)特征，因此應(yīng)該進(jìn)一 步采用多因素聯(lián)合的方法綜合分析腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的多個(gè)指標(biāo)與小肝癌復(fù)發(fā)的關(guān)系，辨 別各相關(guān)指標(biāo)間的內(nèi)在聯(lián)系，從而建立一個(gè)合適的模式來預(yù)測小肝癌患者術(shù)后的復(fù)發(fā)。
[0006] 最近，部分研究發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)標(biāo)簽、表觀遺傳分子標(biāo)記和microRNA能夠很好預(yù)測 肝癌患者的復(fù)發(fā)及預(yù)后。然而，這些基于基因標(biāo)簽的檢測由于實(shí)驗(yàn)室平臺(tái)、新鮮組織獲取、 重復(fù)性、檢測費(fèi)用和方法推廣等原因使其很難在臨床上廣泛應(yīng)用。而免疫組化檢測方法因 其操作簡易、應(yīng)用廣、費(fèi)用低、定性靈敏度高、定位直接準(zhǔn)確等因素得到研究者的青睞，被用 于各種腫瘤的分子分型，包括肝細(xì)胞癌。以上的這些研究都是基于大小肝癌病例得到的結(jié) 果，而小肝癌的生物學(xué)特性與大肝癌存在著一定的差異，對(duì)于小肝癌（尤其是HBV陽性的單 發(fā)直徑< 3cm)這一特殊亞群卻還沒有很好預(yù)測患者復(fù)發(fā)的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提及一種用于預(yù)測小肝癌復(fù)發(fā)的聯(lián)合診斷標(biāo)記，該標(biāo)志對(duì)小肝 癌的復(fù)發(fā)有很好的預(yù)測價(jià)值。
[0008] 發(fā)明人通過對(duì)大量病例進(jìn)行分析，在訓(xùn)練組病例，LASSO Cox回歸模型確立并構(gòu) 建了基于6基因標(biāo)簽（包括⑶147、IL-7、Ki67、MIF、P97及H)-L1)的小肝癌復(fù)發(fā)預(yù)測模 型；6基因標(biāo)簽分類器定義的高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)人群與低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)人群的危險(xiǎn)比為2. 721 (95% Cl: 1. 633-4. 532 ;P〈0. 0001);對(duì)內(nèi)部驗(yàn)證組隊(duì)列（167例）進(jìn)行同樣的分析也得到類似的 結(jié)果。為了驗(yàn)證6基因標(biāo)簽分類器在不同人群是否有同樣的預(yù)測效能，發(fā)明人將該分類器 應(yīng)用于來自不同中心的包含有347例小肝癌的獨(dú)立外部驗(yàn)證組隊(duì)列中。發(fā)現(xiàn)： 1) 分類器定義的高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)人群與低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)人群的危險(xiǎn)比為1.868(95 % Cl :1, 334-2. 617 ；P<0. 0001)； 2) 通過排除臨床病理參數(shù)的協(xié)同作用，多變量生存分析結(jié)果顯示6基因標(biāo)簽分類器是 一個(gè)影響小肝癌復(fù)發(fā)的強(qiáng)大的獨(dú)立預(yù)后因素，無論是在訓(xùn)練組和內(nèi)部驗(yàn)證組，還是在外部 驗(yàn)證組都得到類似的結(jié)果（P〈〇. 0001); 3) 分層生存分析結(jié)果顯示6基因標(biāo)簽分類器仍然是小肝癌臨床上和統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著 意義的預(yù)后模型；ROC曲線分析顯示6基因標(biāo)簽分類器在預(yù)測小肝癌復(fù)發(fā)方面比臨床臨床 危險(xiǎn)因素具有更好的準(zhǔn)確度（AUC :0. 686vs 0. 606); 4) 聯(lián)合6基因標(biāo)簽分類器與臨床病理高危因素能提高參數(shù)的預(yù)后預(yù)測價(jià)值（AUC = 0.703);通過構(gòu)造兩個(gè)集6基因標(biāo)簽分類器和臨床高危因素于一體的列線圖：AFP陰性組和 AFP陽性組；刻度尺圖顯示AFP陰性組的列線圖的預(yù)測效果更好；時(shí)間依賴的ROC曲線分析 顯示列線圖在AFP陰性的患者有更高的預(yù)測準(zhǔn)確度。
【附圖說明】
[0009] 圖1是免疫組化檢測30個(gè)基因標(biāo)簽在小肝癌組織的表達(dá)情況； 圖2是X-tile分析軟件確定30個(gè)基因標(biāo)簽免疫組化表達(dá)的分界值；X-tile軟件將病 例分為兩亞組進(jìn)行l(wèi)og-rank檢驗(yàn)，其檢驗(yàn)產(chǎn)生的卡方值如左邊所示；X-tile軟件將所有病 例根據(jù)基因標(biāo)簽的表達(dá)分為藍(lán)和灰色兩組（中間方形圖，X軸表示標(biāo)記物的表達(dá)分?jǐn)?shù)，Y軸 表示病例數(shù)）；右邊顯示Kaplan-Meier生存曲線圖； 圖3是構(gòu)建基于6個(gè)生物標(biāo)簽的小肝癌預(yù)后分類器；(A) 30個(gè)肝癌相關(guān)的生物標(biāo)簽 LASSO系數(shù)分布概況：垂直線顯示的是由10倍交叉驗(yàn)證確定的閾值；(B)LASSO模型的調(diào)優(yōu) 參數(shù)選擇的Ten-time交叉驗(yàn)證：垂直實(shí)線代表部分似然偏差土 SE (標(biāo)準(zhǔn)誤），垂直虛線代 表通過最小標(biāo)準(zhǔn)和I-SE標(biāo)準(zhǔn)獲得的最佳值； 圖4是訓(xùn)練組、內(nèi)部驗(yàn)證組及外部驗(yàn)證組的基于6基因標(biāo)簽分類器的風(fēng)險(xiǎn)分?jǐn)?shù)、時(shí)間依 賴的ROC曲線和Kaplan-Meier生存曲線； 圖5是根據(jù)6基因標(biāo)簽分類器檢測682例小肝癌患者的臨床病理參數(shù)分層的 Kaplan-Meier 生存分析； 圖6是根據(jù)6基因標(biāo)簽分類器檢測682例小肝癌患者的臨床病理參數(shù)分層的 Kaplan-Meier 生存分析； 圖7是ROC曲線比較6基因標(biāo)簽分類器、臨床病理參數(shù)及單個(gè)基因標(biāo)簽的預(yù)測準(zhǔn)確度； 圖8是列線圖預(yù)測AFP陰性和AFP陽兩組小肝癌患者的腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0010] 下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0011] 樣本資料 收集連續(xù)的病理確診及手術(shù)切除的非轉(zhuǎn)移性小肝癌病例682例。其中來自于中山大學(xué) 附屬腫瘤醫(yī)院病理科1998年12月至2008年12月期間病理確診小肝癌335例。按電腦生 成的分配順序隨機(jī)將335例中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院的小肝癌病例分為：培訓(xùn)組168例，內(nèi)部 驗(yàn)證組167例。內(nèi)部驗(yàn)證后，又收集了 2000年7月至2009年9月期間其他醫(yī)院確診的小 肝癌347例作為一個(gè)獨(dú)立外部驗(yàn)證組。只有原發(fā)性手術(shù)切除的小肝癌（非射頻消融或肝移 植）病例才納入本研究。納入標(biāo)準(zhǔn)包括：腫瘤單發(fā)，腫瘤直徑< 3cm，血清HBV陽性，首次治