用于肝癌的無(wú)創(chuàng)診斷的特異性生物標(biāo)志物組的制作方法
【專利說明】
[0001] 版權(quán)聲明/許可
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技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明描述了一種用于檢測(cè)和定量一組特異性的和新的肝細(xì)胞癌（HCC)腫瘤生 物標(biāo)志物的方法，所述方法通過測(cè)量肝癌患者血清中的對(duì)應(yīng)自身抗體來完成。該組生物標(biāo) 志物包括 Bmil、VCCl、SUMO-4、RhoA、TXN、ET-I、UBE2C、HDGF2、FGF21、LECT2、SODl、STMN4、 中期因子、IL-17A和IL26。更具體地，本發(fā)明進(jìn)一步描述了一種容易獲得的高通量和靈敏 的測(cè)試試劑盒的設(shè)計(jì)，以采取患者的外周血清樣品來在早期以無(wú)創(chuàng)的方式檢測(cè)肝癌，所述 檢測(cè)通過測(cè)量針對(duì)選自所述生物標(biāo)志物組的至少一種生物標(biāo)志物的自身抗體進(jìn)行。本發(fā) 明進(jìn)一步允許鑒定用于分期的特征生物標(biāo)志物譜，以及檢測(cè)化療治療后的監(jiān)測(cè)期期間的復(fù) 發(fā)。本發(fā)明將支持自動(dòng)數(shù)據(jù)分析。
【背景技術(shù)】
[0004] 肝細(xì)胞癌（HCC)是中國(guó)第二普遍的癌癥，占總?cè)丝诘?. 7% [1]。大多數(shù)HCC患者 發(fā)生快速的腫瘤進(jìn)展，導(dǎo)致高死亡率。為了提高總生存率，對(duì)該疾病的早期診斷變得至關(guān)重 要。目前，檢測(cè)HCC的最普遍方式是血液檢查，血液檢查測(cè)量HCC腫瘤標(biāo)志物諸如甲胎蛋白 (AFP)的水平。AFP是在胎兒的發(fā)育過程中由卵黃囊和肝產(chǎn)生的血漿蛋白，作為血清白蛋白 的一種形式。在正常條件下，AFP水平在出生后逐漸下降并且在成年人中保持低水平。腫 瘤標(biāo)志物的水平增加指示可能有肝癌。然而，AFP檢查的主要問題是過多的假陽(yáng)性。這是 因?yàn)镠CC不是導(dǎo)致AFP水平升高的唯一原因，酒精性肝炎、慢性肝炎或肝硬化也與AFP的升 尚相關(guān)。
[0005] 盡管AFP檢查普遍被推薦用于肝癌的診斷，但其結(jié)果并不是結(jié)論性的。疑似患者 將需要經(jīng)歷超聲成像、CT掃描或?qū)Ρ萂RI掃描以進(jìn)一步確認(rèn)。取肝活檢以區(qū)分腫瘤是良性 還是惡性的。然而，對(duì)HCC的常規(guī)檢測(cè)具有一些限制性：(a)約20%的肝癌不產(chǎn)生升高水平 的常用HCC腫瘤標(biāo)志物[2]。（b)病毒性肝硬化會(huì)對(duì)血液檢查產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果[3]。（c)超 聲不能檢測(cè)到小的腫瘤[4]。（d) CT掃描需要高的輻射劑量并且對(duì)小于Icm的腫瘤不靈敏
[5] 。（e)MRI掃描很昂貴，并且操作很耗時(shí)。由于這些限制，需要開發(fā)新的具有較高靈敏度 和特異性的生物標(biāo)志物篩選，目的是早期診斷HCC和/或確定HCC的預(yù)后，從而對(duì)常規(guī)方法 進(jìn)行補(bǔ)充。
[0006] 與緊靠腫瘤的正常肝上皮細(xì)胞相比，HCC腫瘤細(xì)胞往往會(huì)產(chǎn)生獨(dú)特的一組蛋白。評(píng) 價(jià)經(jīng)驗(yàn)證的HCC腫瘤生物標(biāo)志物具有有利于HCC診斷的巨大潛力。然而，不是所有生物標(biāo) 志物本身可以在血清或尿中找到以進(jìn)行方便的診斷。可選地，特異性針對(duì)生物標(biāo)志物的自 身抗體提供了評(píng)價(jià)生物標(biāo)志物的表達(dá)的機(jī)會(huì)。在許多癌癥中已經(jīng)證明腫瘤生物標(biāo)志物的存 在與針對(duì)這些腫瘤抗原的自身抗體的產(chǎn)生有關(guān)[6-8]。檢測(cè)患者血清中的自身抗體將允許 我們更有效地檢查生物標(biāo)志物的存在。理想地，從外周血中檢查自身抗體將是在早期以無(wú) 創(chuàng)的方式檢測(cè)肝癌的證據(jù)。妨礙生物標(biāo)志物的臨床應(yīng)用的一個(gè)常見障礙是它們?cè)诒话l(fā)現(xiàn)后 并未被驗(yàn)證。但一旦經(jīng)過驗(yàn)證，這些檢查將具有成本效益并且是準(zhǔn)確的。原型的設(shè)計(jì)也支 持高通量篩選。這可以減少常規(guī)肝癌診斷所需的成本。
[0007] 下面列舉的參考文獻(xiàn)偶爾在說明書中引用。這些參考文獻(xiàn)的每一篇公開內(nèi)容都全 部地通過引用合并于本文中。
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【發(fā)明內(nèi)容】

[0016] 在本發(fā)明中，提供了一種測(cè)量針對(duì)一組特異性腫瘤生物標(biāo)志物的自身抗體以對(duì)癌 癥進(jìn)行診斷和分期的檢測(cè)和定量方法。與正常肝上皮細(xì)胞比較，HCC腫瘤細(xì)胞往往產(chǎn)生一 組獨(dú)特的蛋白。對(duì)該組獨(dú)特的蛋白（生物標(biāo)志物）的評(píng)價(jià)將對(duì)常規(guī)診斷方法進(jìn)行補(bǔ)充并有 利于癌癥的早期診斷。
[0017] 通過使用基于二維/質(zhì)譜法的方法，在本發(fā)明中從患者的配對(duì)活檢（腫瘤活檢相 對(duì)于毗鄰的正常組織）中鑒定了一組肝癌生物標(biāo)志物，包括Bmi I、VCCl、SUMO-4、RhoA、TXN、 ET-1、UBE2C、HDGF2、FGF21、LECT2、S0D1、STMN4、中期因子、IL-17A 和 IL26。
[0018] 然后驗(yàn)證了此組肝癌生物標(biāo)志物的特異性和準(zhǔn)確性，并一起用于診斷肝癌。在本 發(fā)明中，列舉的生物標(biāo)志物的蛋白表達(dá)自cDNA克隆，其被純化并偶聯(lián)至具有不同發(fā)射波長(zhǎng) 的熒光微球珠。存在于患者血清中的針對(duì)所述蛋白的自身抗體免疫結(jié)合于蛋白-珠綴合 物。自身抗體隨后與藻紅蛋白（PE)-綴合的二抗相互作用。微球珠的特異性熒光信號(hào)充當(dāng) 綴合的生物標(biāo)志物的標(biāo)識(shí)物。通過測(cè)量在復(fù)合物處由PE-綴合的二抗產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度，能 夠檢測(cè)和定量自身抗體。由于自身抗體是在患者血清中產(chǎn)生的，與HCC腫瘤細(xì)胞處的生物 標(biāo)志物的豐度成正比，因此由較高濃度的自身抗體所產(chǎn)生的較高熒光強(qiáng)度指示對(duì)應(yīng)生物標(biāo) 志物的較高表達(dá)。針對(duì)總血清自身抗體的每種生物標(biāo)志物的最低檢測(cè)限為約〇. 15ng/mL。
[0019] 與來自健康受試者的血清相比，針對(duì)目標(biāo)生物標(biāo)志物的自身抗體的水平在癌癥患 者中處于較高的濃度。而且，比較來自處于不同時(shí)期的肝癌患者的不同血清，可以生成用于 分期的特征譜。因此，本發(fā)明允許無(wú)創(chuàng)地評(píng)價(jià)被靶向的肝癌生物標(biāo)志物。這使得能夠檢測(cè) 處于早期階段的HCC以及鑒定用于分期的特征生物標(biāo)志物譜，以及檢測(cè)化療治療后的監(jiān)測(cè) 期期間的復(fù)發(fā)。
【附圖說明】
[0020] 下文參照附圖更詳細(xì)地描述本發(fā)明的實(shí)施方案，在附圖中：
[0021] 圖1示出通過二維質(zhì)譜法發(fā)現(xiàn)的腫瘤活檢和毗鄰的正常組織之間蛋白表達(dá)譜的 差異，該法鑒別出在肝癌中上調(diào)的15種特異性生物標(biāo)志物；箭頭指示在質(zhì)譜分析儀的2-D 凝膠上鑒定出的點(diǎn)的位置。
[0022] 圖2顯示了在本發(fā)明中靶向和測(cè)量的一組15種經(jīng)驗(yàn)證的肝癌生物標(biāo)志物以及它 們的對(duì)應(yīng)分子量。
[0023] 圖3顯示了從cDNA克隆表達(dá)生物標(biāo)志物的工作流程。
[0024] 圖4顯示了純化表達(dá)自大腸桿菌的生物標(biāo)志物的工作流程。
[0025] 圖5顯示了通過BioPlex系統(tǒng)測(cè)量自身抗體的工作流程。
[0026] 圖6顯示了生物標(biāo)志物蛋白與BioPlex珠的綴合。
[0027] 圖7顯示了生物標(biāo)志物-BioPlex珠綴合物與一抗和PE-綴合的二抗免疫反應(yīng)的 復(fù)合物的圖示。
[0028] 圖8顯示了從被限制性內(nèi)切酶HindIII和BamHl切割的質(zhì)粒釋放的DNA插入物的 凝膠電泳。
[0029] 圖9顯示了考馬斯藍(lán)染色的SDS-PAGE，證明了異丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG)對(duì)（a)Bmil、（b