療為手術切除，沒有轉移和腫瘤殘留，術前未行輔助治療，有完整的隨訪資料。所有病例標 本均經(jīng)10%福爾馬林固定、石蠟包埋，切片作常規(guī)H&E染色。所有病例都重新進行病理組織 學評估，組織學分級參照Edmonson和Steiner標準。
[0012] 隨訪 手術切除后病人常規(guī)地在門診進行隨訪，隨訪間隔為2-6月，隨訪項目包括血清AFP、 腹部B超和胸部X光片。隨訪過程當懷疑腫瘤復發(fā)時則進一步行CT和MRI檢查，必要時行 穿刺活檢進行病理確診。無復發(fā)生存期定義為手術日期至腫瘤首診復發(fā)日期的時間間隔。 腫瘤特異的總生存期定義為手術日期至病人死于肝癌或最后隨訪日期的時間間隔。
[0013] H&E 染色 采用常規(guī)H&E染色方法進行形態(tài)學觀察評價腫瘤分級、腫瘤包膜、腫瘤是否壞死、腫瘤 血管浸潤情況及組織芯片典型區(qū)域定位。
[0014] 組織芯片制作 (1)制作"受體"蠟塊 將徠卡LEICA PARAPLAST*HM的石蠟用模具制成大小約為4. OcmX 2. 5cmX I. 5cm的"受 體"蠟塊，并用修蠟機將蠟塊表面修平備用。
[0015] (2)選擇"供體"組織 顯微鏡下選擇病變典型部位并在玻片上做好標記，然后將切片和石蠟組織塊進行匹 配，根據(jù)玻片病灶位置在石蠟組織塊上作相應的標記。
[0016] (3)制作組織芯片方陣 將制作好的"受體"蠟塊固定在組織芯片制作機上的蠟塊槽內(nèi)，用組織芯片機上的細穿 刺針頭在"受體"蠟塊打洞，用粗針頭從"供體"蠟塊中取出所需組織，插入"受體"蠟塊的洞 內(nèi)。重復以上步驟，逐一將所選蠟塊組織插入"受體"蠟塊中，排列成微組織陣列，即制成芯 片蠟塊。（4)芯片蠟塊切片用組織切片機對組織芯片蠟塊進行連續(xù)切片，厚度約4um，將制 作好的切片作H&E染色，檢查所制作的微陣列是否與所設計陣列中的組織排列一致以及是 否含有腫瘤組織。
[0017] 免疫組織化學染色 采用EnVision二步法進行免疫組織化學染色： 1) 3-5 μ m石蠟切片56°C溫箱烤片過夜； 2) 二甲苯脫蠟及梯度酒精水化； 3) 蒸餾水漂洗1分鐘； 4) 0. 3%氏02室溫浸泡10分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶； 5) 蒸餾水漂洗1分鐘； 6) 抗原修復： 所有抗原的修復全部采用高壓修復法：將適量的抗原修復液（工作液）（每種抗體所使 用的修復液詳見表4)注入不銹鋼壓力鍋中加熱至沸騰。將切片放置于修復液中，待高壓鍋 加帽出氣后，低火維持2:30分鐘，將壓力鍋端離熱源，冷卻至室溫； 7) pH7. 2-7. 4PBS緩沖液漂洗1分鐘； 8) 用羊血清孵育30分鐘以去除非特異性著色； 9) 滴加一抗，室溫孵育過夜； 10) pH7. 2-7. 4PBS緩沖液漂洗（2分鐘X5); 11) 滴加 EnVision二抗，室溫孵育60分鐘； 12) pH7. 2-7. 4PBS緩沖液漂洗（2分鐘Χ5); 13) DAB顯色2-10分鐘，清水沖洗終止反應； 14) 蘇木素復染1-2分鐘，鹽酸酒精分化1-3秒； 15) 流水中充分沖洗； 16) 37 °C溫箱烤片，二甲苯透明，中性樹膠封片。
[0018] 免疫組化結果評價 30個基因標簽的評分使用半定量方法：計算陽性腫瘤細胞占總腫瘤細胞的比例乘以 其染色強度。腫瘤細胞染色所占的百分比被分為半定量的五級分級系統(tǒng)：〇分為所有的腫 瘤細胞均未染色；1分為I %到10%的腫瘤細胞被染色；2分為11 %到25%的腫瘤細胞被 染色；3分為26 %到50 %的腫瘤細胞被染色；4分為51 %到75 %的腫瘤細胞被染色；5分為 76%以上的腫瘤細胞被染色。染色強度使用半定量的4級評分系統(tǒng)：0為沒有染色；1為弱 染色；2為中度染色；3為強的染色。免疫組化結果由兩位不知道病人臨床病理資料的病理 醫(yī)生評分產(chǎn)生。當兩位病理醫(yī)生的結果一致時，評分的最終結果由第三位病理醫(yī)生共同商 量討論后決定。
[0019] 免疫組化分界值的選擇 免疫組化評分最佳的分界值由X-tile分析軟件（3. 6. 1版本，耶魯大學醫(yī)學院）確定， X-tile分析軟件是基于每一基因標簽的表達分數(shù)與患者無病生存之間的關系計算得到。 X-tile軟件提供了一個較直觀的方法評估變量和患者生存之間的關系。X-tile軟件能夠 根據(jù)Kaplan-Meier生存分析和Log-rank檢驗計算其最大的卡方值（即最小p值）進而自 動選擇變量最優(yōu)的分界值。
[0020] LASSO回歸分析 LASSO (Least Absolute Shrinkage and Selection Operator)是一種流行的高維預測 的回歸方法。它通過構造了一個懲罰數(shù)得到一個較為精煉的模型，同時它收縮一些系數(shù)，并 設定一些系數(shù)為零。LASSO是一種處理具有復共線性數(shù)據(jù)的有偏估計的方法，通過回歸系數(shù) 的絕對值最小以及殘差二乘和最小，得到一個折中嶺回歸和子集選擇的回歸方法。這種方 法被擴展和廣泛應用于高維數(shù)據(jù)生存分析的Cox比例風險回歸模型。在訓練組病例，發(fā)明 人應用LASSO Cox回歸模型選取與小肝癌聯(lián)系緊密而有用的預后標志物，并構建了一個多 基因標簽為基礎的預測小肝癌復發(fā)的模型（R軟件，版本3. 0.1 ;"glmnet"軟件包）。
[0021] 統(tǒng)計學分析 比較兩組數(shù)據(jù)差異連續(xù)變量使用t檢驗和分類變量采用卡方檢驗。發(fā)明人使用 Kaplan-Meier方法分析變量與小肝癌無復發(fā)生存之間的相關性，應用log-rank檢驗分析 生存曲線。發(fā)明人應用時間依賴的ROC曲線分析臨床病理參數(shù)及多生物標簽為基礎分類機 的準確度。發(fā)明人使用Cox回歸模型進行多變量生存分析，Cox回歸系數(shù)做成列線圖。應 用刻度尺探討列線圖的特性性能。時間依賴ROC分析由R軟件"survival R0C"數(shù)據(jù)包完 成，列線圖和刻度尺利用R軟件rms數(shù)據(jù)包完成，而其他的統(tǒng)計則由3. 0. 1版本R軟件完成。 當雙側P值小于〇. 05時認為有統(tǒng)計意義。
[0022] 3. 1病人臨床病理特征 發(fā)明人對682例手術切除、病理確診的小肝癌病例進行基因表達特征檢測。所有患者 均為長期的乙型肝炎病毒攜帶者和首次手術切除治療的患者。其中275例患者手術后經(jīng)歷 腫瘤復發(fā)，中位復發(fā)時間為38. 5個月。當前研究五百四十五肝癌標本被收購了。表2. 2總 結了本研究中三組小肝細胞癌患者的臨床病理特點。三組病例的臨床病理特點和RFS率沒 有明顯差異（表2. 2)?；颊咦畛Ｒ姷乃劳鲈蚴悄[瘤復發(fā)、轉移或嚴重的肝硬化。確診復 發(fā)患者的后續(xù)治 表2. 2小肝癌患者的臨床病理特征
*P值通過對比訓練組與驗證組之間的差異獲得。
[0023] 3. 2候選基因標簽在小肝癌組織的表達情況 根據(jù)以往的文獻報道，發(fā)明人選取30個與肝癌發(fā)生發(fā)展相關的基因標簽進行免疫組 化檢測。30個基因標簽在肝細胞癌組織IHC典型的表達情況如圖1所示。根據(jù)發(fā)明人以前 的研究，為了讓每個標記物的預測價值最大化，發(fā)明人應用X-tile軟件確定訓練組中每個 基因標簽的分界值。X-tile軟件通過分析變量與患者生存的關系確定變量單一的、直觀的 分界值，X-tile軟件能夠根據(jù)最大的卡方值和最小的P值自動選擇變量的分界值。X-tile 分析軟件確定30個基因標簽免疫組化表達的分界值（圖2) :X-tile軟件將病例分為兩亞 組進行l(wèi)og-rank檢驗，其檢驗產(chǎn)生的卡方值如左邊所示；X-tile軟件將所有病例根據(jù)基 因標簽的表達分為藍和灰色兩組（中間方形圖，X軸表示標記物的表達分數(shù)，Y軸表示病例 數(shù)）；右邊顯示Kaplan-Meier生存曲線圖。
[0024] 在訓練組隊列，通過X-tlie軟件分析30個基因標簽表達評分與小肝癌患者RFS 的相關性，從而確定各個基因標簽的分界值，根據(jù)訓練組獲得的分界值又被引入內(nèi)部驗證 組和獨立外部驗證組進行驗證，各個標記物的分界值及相關驗證組結果如表2. 3所示。
[0025] 表2. 3各個基因標簽表達的分界值及其驗證結果
[0026] 3. 3構建基于6基因標簽的小肝癌復發(fā)風險模型 在訓練組隊列，發(fā)明人應用LASSO Cox回歸模型建立小肝癌復發(fā)的預后模型。LASSO使 用Ll懲罰地縮小一些回歸系數(shù)為零。λ懲罰參數(shù)，也稱調優(yōu)參數(shù)，控制著收縮的量：λ值 越大，選擇的預測因子數(shù)量就越少。LASSO回歸已經(jīng)擴展并廣泛應用于生存分析與高維數(shù)據(jù) 的Cox比例風險回歸模型。LASSO可用于高維基因微陣列數(shù)據(jù)的最優(yōu)選擇，這些微陣列數(shù) 據(jù)由于具有強大的預后意義和彼此變量間的低相關性可以防止過度擬合。發(fā)明人采用懲罰 Cox回歸模型與LASSO處罰同時達到收縮和選擇變量的目的。Ten-time交叉驗證被用來確 定λ的最佳值。發(fā)明人通過1-標準誤原則選擇λ值：最佳λ值是對于那些部分似然偏差 在部分似然偏差最小值的一個標準誤內(nèi)的最大值。本研究中，發(fā)明人通過部分似然偏差與 Iog(A)進行畫圖，而λ為調優(yōu)參數(shù)（圖3KLASS0 Cox回歸模型確立了 6個與小肝癌復發(fā) 相關的基因標簽：包括〇)147、11^-7、燈67、1正、？97及1^-1^1(圖3)。圖3中，仏)30個肝癌 相關的生物標簽LASSO系數(shù)分布概況：垂直線顯示的是由10倍交叉驗證確定的閾值；(B) LA