分透析后，再用2000 mL蒸懼水透析,最后用3000mL三蒸去離子水透析；然后4°C, 12000r/min離心30min,棄沉淀，收集上清液，測(cè)蛋白濃度。做SDS-PAGE電泳，鑒定單克隆抗體的純度。
[0018]2.4兔抗鼠IgG抗體的制備
用Balb/C小鼠IgG免疫健康新西蘭大白兔，制備高效價(jià)的兔抗鼠IgG高免血清，采用飽和硫酸銨沉淀法對(duì)血清進(jìn)行粗提，經(jīng)G-200過(guò)柱后得到高純度的兔抗鼠IgG。
[0019]3、樣品預(yù)處理方法
3.1蘋果前處理方法:用均質(zhì)器均質(zhì)樣品，稱取(2.0±0.lg)均質(zhì)后的蘋果樣品到10mL聚苯乙烯離心管中，分別加入4 mL復(fù)溶工作液，2 mL甲醇，用渦旋儀渦動(dòng)5min ;室溫下4000r/min離心5 min ;取上清液200 μ L，加入到800 μ L復(fù)溶工作液中，充分混勻，取其50 μ L用于分析。
[0020]3.2玉米前處理方法:用均質(zhì)器均質(zhì)樣品，稱取(2.0±0.lg)均質(zhì)后的玉米樣品到10 mL聚苯乙烯離心管中，分別加入4 mL 10%氯化鈉,2 mL甲醇,用潤(rùn)旋儀振動(dòng)5 min ;室溫下4000r/min離心5 min ;取上清液100 μ L,加入到900 μ L復(fù)溶工作液中，充分混勻，取其50 μ L用于分析。
[0021]3.3蔬菜前處理方法:用均質(zhì)器均質(zhì)樣品稱，取(1.0±0.lg)均質(zhì)后的蔬菜樣品到10 mL聚苯乙烯離心管中，加入2 mL 0.lmol / L硫酸,再加入5 mL甲醇,用潤(rùn)旋儀潤(rùn)動(dòng)5min ；,室溫下室溫下4000r/min離心5 min ;取上清液200 μ L,加入到800 μ L復(fù)溶工作液中，充分混勻，取其50 μ L用于分析。
[0022]4、制備試劑盒和檢測(cè)樣品
取溶解于50 mmol/L PBS pH7.0的5g/L兔抗鼠抗體l~2mL，經(jīng)Η)_10柱轉(zhuǎn)換緩沖條件，洗脫液為含 0.155mmol/L NaCl 的 50 mmol/L Na2C03-NaHC03 pH8.5 緩沖液。收集蛋白峰，經(jīng)紫外吸收分析定量(1.46A280-0.74A260)，用上述洗脫液稀釋兔抗鼠抗體至2g/L。取500^1000 μ L稀釋后的兔抗鼠抗體加入含0.2~0.4mg的Eu3+-N2-[p-異氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸(Eu3+-DTTA)的小瓶中，30°C磁力攪拌反應(yīng)20小時(shí)。反應(yīng)液經(jīng)用80mmol/LTris-HCl pH7.8緩沖液平衡的Sepharose CL-6B柱(lX40cm)層析,A2S。監(jiān)測(cè)收集蛋白峰，稀釋分裝備用。
[0023]4.2包被板固相抗原制備
將MP-0VA用50mmol/LNa2C03-NaHC03 pH9.6緩沖液稀釋至lmg/L的包被液，96孔包被板各孔加100 μ L，4°C放置過(guò)夜。棄去包被液，沖洗三次，加150 μ L含3g/L OVA的上述緩沖液封閉，4°C放置過(guò)夜。棄去封閉液，真空抽干，板條密封后置_20°C冷凍保存。
[0024]4.3試劑的配制
(1)MP標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制:將MP標(biāo)準(zhǔn)品，稀釋成為Ong/mL，0.01ng/mL, 0.025ng/mL,0.1ng/mL, 0.25ng/mL, Ing/mL, 2.5ng/mL, 1 Ong/mL, 25ng/mL, lOOng/mL 系列濃度，稀釋液為0.lmol/L pH7.5磷酸鹽緩沖液；
(2)緩沖液:8mmol/LNaCl、0.2% 0VA、50 μ mol/L 二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、0.lmL/LTweeen-80 和 0.l%NaN3 的 50mmol/L Tris-HCl ρΗ7.8 ；
(3)洗滌液為:14.5mmol/LNaCl、0.2mL/L Tweeen-80 和 0.2%NaN3 的 50mmol/LTris-HCl pH7.8 ；
(4)增強(qiáng)液的配制:由15μηιο1β _萘甲酰三氟丙酮、50 μ mol三正辛基氧化膦和lmL曲拉通X-100加入pH3.2鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液中，再定容至1L配制而成。
[0025]4.4試劑盒提供的試劑
基于上述制備的試劑，本發(fā)明用于檢測(cè)甲基對(duì)硫磷(MP)的時(shí)間分辨熒光免疫分析試劑盒包括如下材料:
(1)96孔酶標(biāo)板XI塊；
(2)MP標(biāo)準(zhǔn)品 lmg/mL/ 瓶；
(3)抗MP抗體凍干品，用時(shí)用0.5 mL蒸餾水溶解；
(4)Eu3+-兔抗鼠抗體凍干品，用時(shí)用0.5 mL蒸餾水溶解；
(5)增強(qiáng)液:15mL；
(6)10X洗滌液:30mL ；
(7)緩沖液:30mL。
[0026]4.5測(cè)定之前注意事項(xiàng):
A.使用之前將所有試劑回升至室溫(18-30°C)；
B.使用之后立即將所有試劑放回2-8°C；
C.如果樣品量大建議使用多通道移液器；
D.在所有恒溫孵育過(guò)程中，避免光線照射，用蓋子蓋住微孔；
E.取出需用數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放進(jìn)原錫箔袋中并且與提供的干燥劑一起重新密封，保存于2-8°C。
[0027]4.6具體檢測(cè)步驟如下:
取MP-0VA板條，加入50 μ?的ΜΡ到各自的微孔中，加50 μ?以緩沖液稀釋的抗ΜΡ抗體，25°C?37°C振蕩0.5~1小時(shí)，洗滌液洗3次，加以緩沖液稀釋的100 μ? Eu3+ -兔抗鼠抗體，25°C?37°C振蕩0.5~1小時(shí)，洗滌液洗6次，加200 μ?增強(qiáng)液振蕩5分鐘后測(cè)量熒光強(qiáng)度cps，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的MP含量。
[0028]4.7按下列步驟制備試劑盒和檢測(cè)蘋果、玉米、蔬菜樣品:
(1)制備試劑盒同實(shí)施例的4；
(2)具體檢測(cè)步驟如下:
蘋果前處理方法:用均質(zhì)器均質(zhì)樣品，稱取(2.0±0.lg)均質(zhì)后的蘋果樣品到10 mL聚苯乙烯離心管中，分別加入4 mL復(fù)溶工作液，2 mL甲醇，用渦旋儀渦動(dòng)5min;室溫下4000r/min離心5 min ;取上清液200 μ L，加入到800 μ L復(fù)溶工作液中，充分混勻，取其50 μ L用于分析；
玉米前處理方法:用均質(zhì)器均質(zhì)樣品，稱取(2.0±0.lg)均質(zhì)后的玉米樣品到10 mL聚苯乙烯離心管中，分別加入4 mL 10%氯化鈉，2 mL甲醇，用渦旋儀振動(dòng)5 min ;室溫下4000r/min離心5 min ;取上清液100 μ L，加入到900μ?復(fù)溶工作液中，充分混勻，取其50μ?用于分析；
蔬菜前處理方法:用均質(zhì)器均質(zhì)樣品稱，取(1.0±0.lg)均質(zhì)后的蔬菜樣品到10 mL聚苯乙烯離心管中，加入2 mL 0.lmol / L硫酸,再加入5 mL甲醇,用潤(rùn)旋儀潤(rùn)動(dòng)5 min;,室溫下室溫下4000r/min離心5 min ;取上清液200 μ L，加入到800 μ L復(fù)溶工作液中，充分混勻，取其50μ?用于分析；
取ΜΡ-OVA板條，加入50 μ?的ΜΡ到各自的微孔中，加50 μ?以緩沖液稀釋的抗ΜΡ抗體，25°C?37°C振蕩0.5~1小時(shí)，洗滌液洗3次，加以緩沖液稀釋的100 μ? Eu3+ -兔抗鼠抗體，25°C?37°C振蕩0.5~1小時(shí)，洗滌液洗6次，加200 μ?增強(qiáng)液振蕩5分鐘后測(cè)量熒光強(qiáng)度cps，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的MP含量。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種檢測(cè)甲基對(duì)硫磷(MP)的時(shí)間分辨熒光免疫分析試劑盒，其特征在于:由多孔包被板，緩沖液，甲基對(duì)硫磷標(biāo)準(zhǔn)品，甲基對(duì)硫磷的抗體凍干品，銪標(biāo)記的羊抗鼠抗體，洗滌液和增強(qiáng)液所組成。2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測(cè)甲基對(duì)硫磷(MP)的時(shí)間分辨熒光免疫分析試劑盒的檢測(cè)方法，包括免疫原、包被原和單克隆抗體的制備以及樣品前處理，其特征在于: (1)將甲基對(duì)硫磷(MP)與牛血清白蛋白偶聯(lián)，得到免疫原； (2)將甲基對(duì)硫磷(MP)與卵血清蛋白偶聯(lián)，得到包被原； (3)用步驟(1)的免疫原免疫小鼠，通過(guò)雜交瘤技術(shù)，得到分泌抗甲基對(duì)硫磷的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株； (4)以體內(nèi)誘生腹水法大量制備抗體，使用ProteinG柱進(jìn)行純化，獲得抗甲基對(duì)硫磷的單克隆抗體 (5)用步驟(2)的包被原包被固相載體； (6)將動(dòng)物組織先經(jīng)過(guò)酸解提取后，再過(guò)MAX柱凈化，最后加入衍生試劑和催化劑進(jìn)行處理，得到待測(cè)產(chǎn)物； (7)將步驟￠)的待檢物進(jìn)行測(cè)量熒光強(qiáng)度cps，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的甲基對(duì)硫磷(MP)含量。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測(cè)甲基對(duì)硫磷(MP)的時(shí)間熒光免疫分析法試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于:所述的固相載體是多孔包被板，采用96孔的多微孔包被板作為固相載體。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測(cè)甲基對(duì)硫磷(MP)的時(shí)間熒光分辨免疫分析法試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于:所述的衍生試劑是丁胺。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測(cè)甲基對(duì)硫磷(MP)的時(shí)間分辨熒光免疫分析法試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于:所述的催化劑是腈基磷酸二乙酯。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測(cè)甲基對(duì)硫磷(MP)的時(shí)間熒光免疫分析法試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于:所述步驟(6)和(7)具體為取包被有MP-0VA的微孔包被板，加入50 μ?處理好的樣品到各自的微孔中，加入50 μ?以緩沖液稀釋的甲基對(duì)硫磷抗體，25~37°C振蕩0.5~1小時(shí)，洗滌液洗三次，加以緩沖液稀釋的100 μ? Eu3+-羊抗鼠抗體，25~37°C振蕩.0.5~1小時(shí)，洗滌液洗六次，加200 PL增強(qiáng)液振蕩5分鐘后測(cè)量熒光強(qiáng)度cps，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的甲基對(duì)硫磷(MP)含量。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測(cè)甲基對(duì)硫磷（MP）的時(shí)間熒光分辨熒光免疫分析試劑盒及其檢測(cè)方法。所述檢測(cè)甲基對(duì)硫磷的時(shí)間分辨熒光免疫分析檢測(cè)試劑盒是由多孔包被板、緩沖液、甲基對(duì)硫磷標(biāo)準(zhǔn)品、甲基對(duì)硫磷的抗體凍干品、銪標(biāo)記的羊抗鼠抗體、洗滌液和增強(qiáng)液所組成。所述檢測(cè)甲基對(duì)硫磷的時(shí)間熒光免疫分析試劑盒的檢測(cè)方法包括下列步驟：(1)免疫原的制備；(2)包被原的制備；(3)單克隆抗體的制備；(4)樣品的前處理及檢測(cè)。本發(fā)明檢測(cè)時(shí)間短、平均回收率高、樣品前處理簡(jiǎn)單、能現(xiàn)場(chǎng)操作檢測(cè)，應(yīng)用廣泛，檢測(cè)成本低，同時(shí)具有檢測(cè)特異性強(qiáng)，批內(nèi)和批間差異小、靈敏度高和操作簡(jiǎn)單快速，且特別適合于大批量樣品的檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。
【IPC分類】G01N33/577
【公開號(hào)】CN105319366
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410349743
【發(fā)明人】洪霞, 杜霞
【申請(qǐng)人】江蘇維賽科技生物發(fā)展有限公司
【公開日】2016年2月10日
【申請(qǐng)日】2014年7月22日