一種用于肝纖維化和肝硬化檢測的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及一種用于肝纖維化和/或 肝硬化檢測的試劑盒，尤其涉及一種用于檢測樣本中CHI3L1水平的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 肝硬化（Cirrhosis)是指肝纖維化中晚期。它的形態(tài)學(xué)定義為彌漫性肝臟纖維化 伴有異常結(jié)節(jié)形成。僅有彌漫性肝纖維化而無結(jié)節(jié)形成（如先天性肝纖維化），或僅有結(jié) 節(jié)形成而無纖維化（如結(jié)節(jié)性再生性增生）均不能稱為肝硬化。從臨床的角度來看，肝硬 化是指上述肝臟組織病理學(xué)改變所導(dǎo)致的肝功能衰竭（血清白蛋白降低、膽鹼酯酶活力降 低、膽紅素升高、凝血酶原時間延長等）和門脈高壓癥（食管胃底靜脈曲張及其破裂出血、 腹水、自發(fā)性細菌性腹膜炎及肝腎綜合征、肝性腦病等）等表現(xiàn)。從病理學(xué)上來看，慢性炎 癥壞死首先導(dǎo)致肝臟纖維結(jié)締組織增生和沉積（纖維化），繼而導(dǎo)致肝小葉結(jié)構(gòu)的破環(huán)和 假小葉形成，最終發(fā)展為肝硬化。
[0003] 肝硬化的臨床診斷方法包括相關(guān)的影像學(xué)診斷、病理學(xué)診斷或/和治療和隨訪 等。選擇的血清樣本來源于臨床確診的肝硬化病人等。肝硬化的診斷方法主要有以下3類：
[0004] 1)組織病理學(xué)檢查：肝活檢組織病理學(xué)檢查至今仍被認為是診斷肝纖維化和肝 硬化的"金標準（Gold standard) "。1994年國際慢性肝炎新的分級、分期標準建議將肝臟纖 維化作為病情分期的依據(jù)，與分級（主要是炎癥、壞死的程度）分別評分。目前國際上常用 的肝組織評分方法包括Knodell、Scheuer、Ishak、Metavir、Chevallier等系統(tǒng)。我國1995 和2000年病毒性肝炎防治方案也采用了相應(yīng)的分級、分期標準，王泰齡教授也發(fā)表了改進 的肝纖維化的半定量積分系統(tǒng)。利用常規(guī)HE染色和各種細胞外基質(zhì)的組織化學(xué)、免疫組織 化學(xué)甚至分子原位雜交技術(shù)可從肝組織標本獲得許多有關(guān)纖維化方面的信息；計算機圖像 分析等各種技術(shù)更能提供定量的資料以便于觀察抗纖維化治療的效果。目前在B超引導(dǎo)下 采用自動肝穿槍進行肝活檢的可靠性及安全性很高，病人的痛苦也很小。但肝活檢也有局 限性，例如：病變不均一有可能造成取樣誤差，難以在同一病人反復(fù)多次進行，因而不便于 觀察肝纖維化的動態(tài)變化或治療效果，因此一般很少在臨床診斷實際采用。
[0005] 2)肝纖維化的血清學(xué)診斷：鑒于肝臟穿刺組織病理檢查的局限性，人們經(jīng)過動物 實驗和臨床一病理對照研究發(fā)現(xiàn)了不少對判斷肝纖維增生有一定價值的血清指標。國內(nèi)應(yīng) 用較多的有血清ΠΙ型前膠原氨基端肽（PIIINP)、IV膠原（CIV)、層連蛋白Pl (Lam)、透明 質(zhì)酸（HA)?？偟膩碚f，在動物實驗中，這些指標和肝臟中相應(yīng)的細胞外基質(zhì)成分有良好的 相關(guān)性；在臨床研究中，這些指標和肝組織病理學(xué)纖維化程度也有較好的相關(guān)性，由慢性肝 炎、肝纖維化到肝硬化逐步升高，并能除外肝外疾病及肝臟炎癥活動的影響，對診斷肝纖維 化有一定幫助。但是各組之間有較多的重疊，僅憑一次結(jié)果難以做出肯定的診斷，而且目前 國內(nèi)此類試劑盒急需標準化并提高其穩(wěn)定性。聯(lián)合應(yīng)用多項指標綜合判斷，并進行動態(tài)測 定可能更有助于判斷肝臟纖維增生變化趨勢和治療效果。
[0006] 3)影像學(xué)診斷：各種常用的影像學(xué)手段如B型超聲、CT、磁共振成像（MRI)等可以 發(fā)現(xiàn)肝包膜增厚，肝表面輪廓不規(guī)則，肝實質(zhì)的回聲不均勻增強或CT值增高或呈結(jié)節(jié)狀， 各葉比例改變，脾臟厚度增加及門靜脈和脾靜脈直徑增寬等肝硬化和門脈高壓的征象。彩 色多普勒超聲檢查或放射性核素掃描可以測定肝臟動脈和門脈的血流量及功能性門體分 流情況。
[0007] 但是以上這些檢測都有低靈敏度和特異性的缺陷，造成診斷中出現(xiàn)很高的假陽性 和假陰性。因此，人們迫切需要科技工作者開發(fā)出檢測更方便、靈敏度和特異性更高、而且 準確率高的肝硬化診斷手段。
[0008] 導(dǎo)致肝硬化最常見的病因是乙肝（HBV)或丙肝病毒（HCV)感染，世界人口總數(shù) 的約1/3(20億）曾感染過或者正在感染乙肝病毒（參見http://www.hepb.org/hepb/ statistics, htm)，其中有4億人為終身慢性感染者。而我國的HBV感染率已經(jīng)高達10%。 因此，由HBV和HCV感染導(dǎo)致的肝硬化在我國的發(fā)病逐年增加。據(jù)不完全統(tǒng)計，我國慢性乙 型肝炎病人約為2000萬人，其中近25~30萬慢性乙肝病人可發(fā)展為肝硬化，其中5~20 萬可能發(fā)展為肝癌。而我國每年死于肝硬化的人數(shù)高達20萬。因此，如果能夠發(fā)現(xiàn)易感人 群并進行早期診斷和干預(yù)，則會大大降低肝硬化乃至肝癌的發(fā)病率，降低患者死亡率，減少 醫(yī)療費用并提高患者的生活質(zhì)量；同時，肝硬化易感人群的發(fā)現(xiàn)對于了解其發(fā)病機理并尋 找干預(yù)手段也有重要的科學(xué)意義和臨床應(yīng)用價值，這將對人類最終攻克這一頑疾有重要意 義。眾所周知，乙肝病毒感染后有著"肝炎-肝硬化-肝癌"三部曲表現(xiàn)，其中肝硬化是基于 病毒侵犯肝臟后導(dǎo)致肝細胞長期慢性炎癥、肝細胞死亡，并由肝臟纖維組織增生發(fā)展而來。
[0009] 發(fā)明人在肝硬化基因差異表達以及相關(guān)的生物標志物研究中，意外地發(fā)現(xiàn)在中國 人群中由乙肝引起的肝纖維化和肝硬化會發(fā)生CHI3L1蛋白的高表達，這提示CHI3L1具有 用作肝纖維化和肝硬化的生物標志物的可能性。
[0010] CHI3L1是人類軟骨糖蛋白39(HcGP-39)(或稱為類幾丁質(zhì)酶蛋白， chitinase3-likel)的簡寫，又簡寫為YKL-40。人們經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，血清中CHI3L1的水平與 許多疾病狀況比如在骨關(guān)節(jié)炎、原發(fā)性大腸癌、乳腺癌、復(fù)發(fā)的卵巢癌有關(guān)，因而可用于一 些疾病的診斷、預(yù)后評估、治療效果監(jiān)測及病情發(fā)展監(jiān)測。例如，可用于卵巢癌的診斷和預(yù) 后（參見：程明剛，等。血清CHI3L1在卵巢癌患者診斷和預(yù)后中的應(yīng)用。《廣東醫(yī)學(xué)》2008 年29卷2期第255-256頁）。耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院研究人員在2007年11月15日出版的《新 英格蘭醫(yī)學(xué)期刊》（The New England Journal of Medicine)上發(fā)表文章稱，臨床試驗結(jié)果 表明該分子可能在決定嚴重哮喘病生理反應(yīng)時發(fā)揮重要作用，與常人相比，哮喘病患者的 CHI3L1循環(huán)血清會更多，同時也與哮喘的嚴重程度有關(guān)。（參見生物通網(wǎng)址：http://www. ebiotrade. com/newsf/2007-11/20071116165039. htm)。美國圣迭戈加州大學(xué) Johansen 等稱，CHI3L1是獨立于癌胚抗原（CEA)和乳酸脫氫酶的生物標志物，普通人群血清CHI3L1 水平高者，其胃腸道腫瘤患病風(fēng)險增加2. 7倍，且診斷為胃腸道腫瘤后預(yù)后欠佳（參見中 國醫(yī)學(xué)論壇報網(wǎng)絡(luò)版。網(wǎng)址：http: //www. cmt. com. cn/article/080221/a080221b0301. htm)。血清CHI3L1水平在酒精性肝硬化病人中升高（參見Johansen, J. S.，Christoffer sen, P. , Moller, S. , Price, P. A. , Henriksen, J. H. , Garbarsch, C. , and Bendtsen, F. (2000) Serum CHI3Llis increased in patients with hepatic fibrosis. Journal of hepatology, 32 :911-920.)。Kamal等的研究表明血液中的CHI3L1蛋白水平已丙肝病毒慢性感染和肝 纖維化有關(guān)（Kamal, et al. HEPATOLOGY，2006 ;43:771-779.)。
[0011] 但是,對于中國人群常見的乙肝病毒感染后生物樣本比如血液中CHI3L1水平與 肝纖維化和肝硬化的關(guān)系，目前還沒有報道。
[0012] 因此，基于CHI3L1蛋白與中國人群中乙肝引起的肝纖維化和肝硬化的相關(guān)性，本 發(fā)明提出了通過檢測CHI3L1蛋白來判斷肝硬化發(fā)病、診斷和干預(yù)的新的應(yīng)用方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 基于上述發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的首要目的在于提供一種用于檢測肝纖維化和/或肝硬 化、尤其是乙肝病毒感染引起的肝纖維化和/或肝硬化的試劑盒，其通過檢測個體樣本中 CHI3L1的水平來確定個體是否有肝纖維化和/或肝硬化狀況，該試劑盒包含：
[0014] (1)能夠結(jié)合CHI3L1的抗體；
[0015] (2)當CHI3L1結(jié)合于⑴中限定的抗體時，能夠結(jié)合于CHI3L1的標記抗體；和
[0016] (3)由含有已知量CHI3L1的溶液組成的標準樣，其中CHI3L1來源于由乙肝病毒感 染引起的肝纖維化和/或肝硬化患者的體液比如血清。
[0017] 為方便起見，將上述（1)中限定的抗體稱作CHI3L1初級抗體或者CHI3L1第一抗 體；將上述（2)中限定的標記抗體稱作CHI3L1第二抗體。
[0018] 優(yōu)選CHI3L1第一抗體可以被固定在固相載體上，形成用于"捕獲"CHI3L1的捕獲 抗體。
[0019] 優(yōu)選CHI3L1第二抗體上的標記物能夠催化或者激活化學(xué)發(fā)光化合物或者熒光染 料，從而快速地將無色的底物轉(zhuǎn)變成有色的產(chǎn)物、或者引起光變化，或者將非熒光的熒光染 料轉(zhuǎn)變成強烈的熒光產(chǎn)物。
[0020] 優(yōu)選上述試劑盒進一步包含：
[0021] (4)引發(fā)劑溶液，用于引發(fā)CHI3L1第二抗體上的標記物與作為標記物反應(yīng)對象的 化學(xué)發(fā)光化合物或顯色底物或者熒光染料之間的化學(xué)反應(yīng)。
[0022] 優(yōu)選CHI3L1第一抗體、或者用于固定CHI3L1第一抗體的固相載體上連接有化學(xué) 發(fā)光化合物或熒光染料。借此，使得免疫測定方法更簡單化，定量更準確。
[0023] 本發(fā)明的另一目的在于提供另一種用于檢測由乙肝病毒感染引起的肝纖維化和/ 或肝硬化的試劑盒，其通過檢測個體樣本中CHI3L1和HBV蛋白的水平來確定個體是否有肝 纖維化和/或肝硬化狀況，其包含：
[0024] 0- )能夠結(jié)合CHI3L1的抗體；
[0025] (2'）當CHI3L1結(jié)合于（Γ )中限定的抗體時，能夠結(jié)合于CHI3L1的標記抗體；
[0026] (3'）能夠結(jié)合HBV蛋白的抗體；
[0027] (4'）當HBV蛋白結(jié)合于（3'）中限定的抗體時，能夠結(jié)合于HBV蛋白的標記抗體；
[0028] (5'）由含有已知量CHI3L1的溶液組成的標準樣，其中CHI3L1來源于由乙肝病毒 感染引起的肝纖維化和/或肝硬化患者的體液比如血清；以及由含有已知量HBV蛋白的溶 液組成的標準樣，其中HBV蛋白來源于由乙肝病毒感染引起的肝纖維化和/或肝硬化患者 的體液比如血清。
[0029] 為方便起見，將上述（Γ)中限定的抗體稱作CHI3L1初級抗體或者CHI3L1第一抗 體；將上述（2'）中限定的標記抗體稱作CHI3L1第二抗體；將上述（3'）中限定的抗體稱作 HBV初級抗體或者HBV第一抗體；將上述（4'）中限定的標記抗體稱作HBV第二抗體；
[0030] 優(yōu)選CHI3L1第一抗體和HBV第一抗體可以分別被固定在不同的固相載體上，分別 形成用于"捕獲" CHI3L1和HBV蛋白的捕獲抗體。
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